糖苷酶实验指导

α-糖苷酶抑制剂抑制活性测定

实验原理：

食物中的淀粉（多糖）经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖（或称寡糖）以及双糖与三糖，进入小肠经α- 葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在α- 葡萄糖苷酶，在服用α- 葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制, 而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益, 在长期使用后亦可降低空腹血糖, 估计与提高胰岛素敏感性有关。

对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（pNPG）经α-葡萄糖苷酶水解可产生对硝基苯酚，其在405nm呈特异性吸收，因此可以通过检测对硝基苯酚的生成量检测α-葡萄糖苷酶的活性。

仪器与试剂

缓冲液：0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）--每100ml中1mol/l磷酸氢二钠4.6 ml，1mol/l磷酸二氢钠5.4 ml。

酵母α-葡萄糖苷酶：将100U/ml酶原液用0.1M的磷酸钠缓冲液（pH6.8）稀释为1U/ml的酶溶液，冷冻备用。

底物pNPG配制：2mM的pNPG溶解于0.1M的磷酸钠缓冲液中。

阿卡波糖抑制剂配制：200μg/ml溶于0.1M的磷酸钠缓冲液中。

实验内容

1.分组：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、阳性对照组空白、待测样品

大、中、小剂量组、待测样品组空白

空白对照： 170μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG

阴性对照组：10μl酶溶液+160μl缓冲液+30μl 2mM的pNPG

阳性对照：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂+30μl 2mM 的pNPG

阳性对照空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl阿卡波糖抑制剂

待测样品组：10μl酶溶液+60μl缓冲液+100μl待测样品+30μl 2mM的pNPG 待测样品空白：10μl酶溶液+90μl缓冲液+100μl待测样品

2.实验步骤

96孔酶标板上依次加入除底物外的所有反应液，37℃温浴10分钟，然后迅速加入底物,并测定反应初始吸光值（405nm）；之后，用塑料膜密封酶标板，37℃保温，每隔15分钟测定一次吸光值，以吸光值对时间做反应曲线。注：

除阳性对照空白和待测样品空白，其他每个样品做3个平行

每班分成4组，每组做一块酶标板