烟草组织培养实验方案

烟草组织培养实验方案

摘要本实验通过配制四种培养基来实现烟草种子萌发，种子苗叶片诱导、分化及植株再生，从而获得课题所需要的基因受体植株。

关键词烟草组织培养

前言

组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。烟草是典型的基因工程模式植物,易于进行组织培养,

容易得到再生的转化植株。

一实验植物：华烟6号

二实验材料：华烟6号种子

三实验方法与步骤

1．培养基的配制

本次实验使用（1）种子萌发培养基：MS培养基+GA30.7mg/L；（2）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（3）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（4）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强度2 000 lx。

2. 培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）

3. 无菌苗的获得

把烟草种子用市售丝袜（或纱布）包好，先分别用75%乙醇或无菌水浸泡30 s，用无菌水洗净表面抑制种子萌发的药物，待洗涤的水清澈透明，然后将烟草种子用70%酒精浸泡1 min, 10%NaClO消毒10 min,经无菌水漂洗后，在超净工作台处（紫外灭菌20～30min）接种于以配置好的（1）培养基,放入(27±1)℃的光照培养架中培养。光照周期为10 h(8:00~18:00)光照,12 h暗培养。种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。

4. 烟草叶片愈伤诱导及不定芽分化

在超净工作台上取上述烟草无菌苗幼嫩叶片1~2片于无菌培养皿中，将叶片切成1.0～1.5平方厘米的小方块，接入（2）中培养。约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（3）上，3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。光照时间8～12小时，温度通常在23～28℃之间。

5. 诱导生根及移栽

取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（4）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。

四数据记录：

编号 种子数目萌发时间萌发数目萌发时间染菌率

烟草叶片愈伤组织诱导情况

编号每瓶接种数愈伤组织诱导率愈伤组织状态染菌率

烟草叶片愈伤组织再生植株情况

编号分化率每个愈伤组织分化芽数分化情况染菌率

编号生根率生根情况 再生植株分化根数染菌率

参考文献

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