免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术原理和操作流程
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用 于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望
免疫共沉淀串联蛋白质谱coip-ms
免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）是一种用于研究蛋白质相互作用的重要技术。
它通过将特定抗体与靶蛋白质结合，然后利用质谱技术鉴定和分析与该蛋白质相互作用的其他蛋白质，从而揭示细胞内复杂的信号传导网络和蛋白质功能。
在本篇文章中，我们将深入探讨CoIP-MS技术的原理、应用和局限性，以及个人对这一技术的理解和看法。
一、CoIP-MS技术原理1. CoIP原理免疫共沉淀（Co-IP）是一种将特定抗体与靶蛋白质结合的技术。
通过免疫沉淀的方式，来极大程度地富集我们需要的蛋白质。
2. 质谱技术原理质谱技术是一种通过离子化和加速来测定分子质量的技术。
在CoIP-MS中，利用质谱技术鉴定和分析与靶蛋白质相互作用的其他蛋白质。
二、CoIP-MS技术应用1. 蛋白质相互作用研究CoIP-MS技术被广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。
通过对一种蛋白质进行免疫共沉淀，然后利用质谱技术鉴定与其相互作用的其他蛋白质，可以揭示信号传导、细胞周期、转录调控等生命活动的分子机制。
2. 蛋白质功能验证CoIP-MS技术也可以用于验证蛋白质的功能。
通过鉴定与某一特定蛋白质相互作用的其他蛋白质，可以初步推测该蛋白质在细胞内的功能和通路位置。
三、CoIP-MS技术局限性1. 验证性由于CoIP-MS技术对蛋白质相互作用的鉴定依赖于抗体的质量和特异性，因此在实际应用中需要进行多次重复实验来验证结果的可靠性。
2. 数据解析CoIP-MS生成的数据量庞大，需要借助生物信息学和统计学的方法来进行数据解析和筛选，因此在数据分析的过程中存在一定的复杂性和技术门槛。
四、个人理解和看法对于CoIP-MS技术，我个人认为它是一种非常有价值的蛋白质相互作用研究技术。
通过CoIP-MS技术，我们可以全面了解蛋白质的相互作用网络和功能，为生命科学领域的研究提供了强有力的工具。
然而，在实际操作中需要注意抗体的选择和数据的解析，以确保结果的可靠性和准确性。
总结回顾：通过本文的详细介绍，我们对免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）技术有了更深入的了解。
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。
它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。
本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。
免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。
该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。
3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。
可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。
同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。
2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。
此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。
3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。
为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。
4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。
可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。
通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。
5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。
洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。
6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
coip免疫共沉淀的原理
coip免疫共沉淀的原理
coip免疫共沉淀（coip）是将抗体标记的抗原或抗体与样
品中的特定目标蛋白质进行特异性结合，形成抗原抗体复合物。
然后用一抗或二抗将此复合物与相应的抗体结合，在凝胶上形成
一条带，此带即为可移动的沉淀物。
与沉淀物结合的抗体可被洗脱，而未结合的抗原或抗体则可以被固定。
因此，coip免疫共
沉淀可用于分离与研究蛋白质相互作用，鉴定蛋白质及其亚基。
免疫共沉淀（coip）技术在蛋白质组学研究中应用非常广泛。
蛋白质组学是研究蛋白质序列和空间结构的学科，研究对象主要
是蛋白质本身，而不是其所结合的其他分子。
通过分析和鉴定所
需的蛋白，可以了解这些蛋白与哪些分子相结合以及它们之间的
相互作用方式，进而为蛋白质功能与结构、翻译后修饰、信号转
导以及蛋白质与其配体和受体之间相互作用等生物学过程的研究
提供有力工具。
在细胞生物学、免疫学等领域中，coip技术已
被广泛应用于基因表达调控、免疫活性调节及疾病发生机制研究
等方面。
—— 1 —1 —。
免疫共沉淀实验原理
免疫共沉淀实验原理免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于研究蛋白质间的相互作用。
其原理是利用特异性抗体结合目标蛋白质，将其与抗体一起沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用的蛋白质分子。
这种实验方法常用于研究蛋白质的定位、亚细胞定位、蛋白质复合物的组成以及蛋白质间的相互作用等。
下面将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。
免疫共沉淀实验的原理可以简单描述为以下几个步骤：1. 抗体结合：首先，选择特异性抗体，该抗体能够与目标蛋白质结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据实验需求来确定。
将抗体与目标蛋白质结合形成免疫复合物。
2. 免疫复合物的富集：将免疫复合物与磁珠或琼脂糖等固相载体结合，形成免疫磁珠或免疫琼脂糖。
这些固相载体具有良好的亲和力，能够高效地捕获免疫复合物。
3. 样品处理：将待测样品加入到含有免疫磁珠或免疫琼脂糖的溶液中，使样品中的目标蛋白质与免疫复合物结合。
同时，对样品进行适当的处理，如细胞裂解、蛋白质交联等，以保持样品的完整性并增加结合效率。
4. 免疫共沉淀：将含有样品和免疫复合物的溶液进行充分混合，并进行一定时间的孵育，使目标蛋白质与免疫磁珠或免疫琼脂糖结合。
通过外加磁场或离心的方式，将免疫磁珠沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用的蛋白质分子。
5. 洗涤：对沉淀下来的免疫磁珠或免疫琼脂糖进行洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
洗涤的条件需要根据实验需求进行优化，通常包括洗涤缓冲液的浓度、洗涤次数和洗涤时间等。
6. 析出：将洗涤后的免疫磁珠或免疫琼脂糖进行脱盐或去除洗涤缓冲液，最终得到含有富集的目标蛋白质及其相互作用蛋白质的沉淀物。
7. 分析：对沉淀物进行进一步的分析，如Western blotting、质谱分析、原位杂交等，以研究蛋白质的相互作用关系、定位及功能等。
总结起来，免疫共沉淀实验是一种通过特异性抗体结合目标蛋白质，将其与抗体一起沉淀下来，从而富集目标蛋白质及其相互作用蛋白质的实验方法。
免疫共沉淀实验方法
免疫共沉淀实验方法免疫共沉淀实验方法是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，通过利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合来寻找与目标蛋白相互作用的蛋白质。
下面将详细介绍免疫共沉淀实验方法的步骤和注意事项。
步骤一：制备样品首先需要制备含有目标蛋白的样品，可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白。
样品需要在低温下保存，并在实验前加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以保持蛋白的完整性。
步骤二：制备抗体制备抗体需要选择与目标蛋白特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体需要在低温下保存，并在实验前进行免疫球蛋白纯化和浓度调整。
步骤三：免疫共沉淀实验1. 将制备好的样品加入到含有抗体的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
2. 将混合物加入到预先平衡好的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
3. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
4. 重复步骤3，洗涤3次。
5. 加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
6. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
7. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
8. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
9. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
10. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
11. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
12. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
13. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
免疫共沉淀技术原理
免疫共沉淀技术原理
免疫共沉淀技术是一种在生物学实验中常用的技术，是由免疫学和共沉淀技术两种方法结合构成的。
免疫共沉淀技术基本原理为：首先用抗体（抗原特异性免疫球蛋白）和抗原（蛋白质、多糖类或核酸分子）结合，形成抗原-抗体复合物，然后将抗原-抗体复合物及抗原混合悬浮液置于离心机或离心管中，进行离心，将复合物沉淀在管底，抗原在此过程中被抑制，经离心或超滤操作从抗原-抗体复合物中抽提出抗体，最后可用SDS-PAGE或ELISA技术鉴定抗体的纯度。
该技术在抗原和抗体可溶性、亲和力足够强的情况下，可大规模地制备抗体。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。
该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。
一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。
在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。
随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。
2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。
4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。
2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。
3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。
4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。
然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。
2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。
3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。
基因工程-免疫共沉淀技术
五、应用实例与展望
研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作蛋白
P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症发生 约一半是由于该基因的突变失活。
• 抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀 • SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物。 • 切取p53结合蛋白条带，酶解后进行质谱（LC-ESIMS/MS）分析，得到相应的肽序列标签 。 • 搜索数据库分析目的蛋白相关数据。
操 作 步 骤 示 意 图
免疫共沉淀的优点
免疫共沉淀的缺点
（1）可能检测不到低亲和
（1）相互作用的蛋白质 都是经翻译后修饰的， 处于天然状态； （2）蛋白的相互作用是 在自然状态下进行的，
力和瞬间的蛋白质－蛋白质
相互作用； （2）两种蛋白质的结合可 能不是直接结合，而可能有 第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目 的蛋白是什么，以选择最后 检测的抗体，方法本身具有 冒险性。
五、应用实例与展望
• 生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、剪切、 分泌、细胞周期调控、信号转导等均受蛋白质间 相互作用的调控。蛋白质间相互作用存在于机体 每个细胞的生命活动过程中。 • 由于蛋白质间相互作用具有重大的意义，因此其 检测方法的研究也备受重视。蛋白质相互关系的 研究以后会愈来愈多，我们不仅可通过免疫共沉 淀技术来证实，还会有更多先进技术值得我们去 发现、运用和发展。
免疫共沉淀技术
Co-Immunoprecipitation（CO-IP）
姓名 学号
目
1
录
基本概念
原理与应用
2
3 4 5
操作步骤
注意事项 应用实例与展望
一、Байду номын сангаас本概念
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）：
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，也是
研究细胞基因组结构和功能的重要方法。
该技术可以用来鉴定某个转录因
子或其他核蛋白与某个特定DNA序列的结合关系，从而确定这个DNA序列
在基因表达调控中的重要性。
该技术包括以下步骤：（1）交联；（2）裂解；（3）免疫沉淀；（4）洗涤；（5）离解交联；（6）DNA提取。
在这个过程中，首先将细胞进行交联，使得染色质固定在原位。
之后，将染色质进行裂解并进行免疫沉淀，这里是将特定的抗体与目标蛋白质结合，从而使得目标蛋白质与某些DNA序列结合，并保持在染色质中。
然后
对免疫沉淀后的复合物进行洗涤，去除杂质物质，以提高免疫沉淀的特异
性和纯度。
之后，对免疫沉淀后的复合物进行离解交联，使免疫沉淀的蛋
白质与DNA分别被分解为单独的分子。
最后，从免疫沉淀复合物中提取DNA，用于进一步的分析，例如PCR扩增、Southern blotting、测序等。
该技术的优点是可以在整个基因组范围内寻找目标DNA序列的结合蛋白，相对快速、成本低、灵敏度高，并且可以直接从原位染色质富集DNA
序列。
缺点是免疫沉淀的特异性和纯度可能受到影响，需要对实验进行严
谨控制。
染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究蛋白质与DNA 相互作用的技术。
以下是一般的染色质免疫共沉淀的基本步骤：
1. 细胞固定：将细胞培养物在适当的条件下进行固定，以维持DNA-蛋白质复合物的结构。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解液将细胞破碎，释放出染色质。
3. 抗体结合：将特异性抗体加入到裂解液中，使其与目标蛋白质结合。
4. 免疫沉淀：使用抗体-抗原复合物的特异性结合，通过免疫沉淀的方法将与抗体结合的染色质-蛋白质复合物沉淀下来。
5. 洗涤：对沉淀进行多次洗涤，以去除非特异性结合的物质。
6. DNA 提取：将沉淀中的DNA 提取出来。
7. DNA 分析：对提取的DNA 进行分析，例如PCR、芯片分析或高通量测序等，以确定与目标蛋白质结合的DNA 区域或基因。
需要注意的是，具体的实验步骤可能会因实验目的、细胞类型和使用的试剂而有所不同。
在进行染色质免疫共沉淀实验时，建议遵循相关的实验方案和标准操作流程，并根据实际情况进行优化和调整。
此外，染色质免疫共沉淀技术需要一定的实验技能和经验，包括细胞培养、抗体选择、洗涤条件的优化等。
免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术
免疫共沉淀技术（immuno-co-precipitation, ICP）是一种用于检测蛋白质相互作用的分子生物学技术。
它利用抗体来识别和结合目标蛋白，通过物理沉淀将目标蛋白与其它蛋白质分离出来，从而得到一组可能存在蛋白质间相互作用的蛋白质复合体。
原理上，在特异性抗体和抗原蛋白之间形成免疫复合物，并将目标蛋白质和其他蛋白质一起沉淀出来，从而实现蛋白质相互作用的检测和鉴定。
免疫共沉淀技术步骤如下：
1. 先将受体蛋白与抗原蛋白混合；
2. 加入特异性抗体，使受体蛋白与抗原蛋白形成免疫复合物；
3. 通过物理沉淀的方法将受体蛋白与抗原蛋白复合物沉淀出来；
4. 用免疫印迹技术对共沉淀蛋白复合物进行检测。
免疫共沉淀技术流程
免疫共沉淀技术流程一、免疫共沉淀技术的准备工作。
1.1 首先呢，咱们得把要用的材料都准备好。
这就像做饭得先把食材买齐一样。
细胞或者组织样本那是必不可少的，这是咱们整个实验的基础。
就好比盖房子得有砖头一样，没有样本，后面的事儿都白搭。
1.2 还有抗体，这可是关键的“小助手”。
要根据咱们想要研究的蛋白去精心挑选合适的抗体。
这抗体就如同钥匙，得精准匹配蛋白这个“锁”，要是选错了，那可就打不开正确的“大门”，实验结果肯定就不对路了。
另外，各种试剂也得备齐，像裂解缓冲液之类的，这就如同做菜时的调料，缺了它，味道就不对了。
二、细胞裂解与蛋白提取。
2.1 细胞或者组织样本到手后，就得进行裂解了。
这个过程就像是把一个包裹打开，把里面的东西都释放出来。
把样本放到裂解缓冲液里，然后通过一些手段，比如超声破碎或者研磨，让细胞破个“壳”，把里面的蛋白都释放到溶液里。
这一步可得小心点，要是操作太猛了，可能把蛋白都给破坏了，那就“竹篮打水一场空”了。
2.2 蛋白提取出来后，要进行定量。
这就好比我们卖东西得先称称重量一样。
得知道有多少蛋白，这样后续的实验才能按照合适的比例来进行。
要是蛋白量都不清楚，那后面加抗体的量也不好确定，整个实验就会乱了套，成了“没头的苍蝇”到处乱撞。
三、免疫共沉淀反应。
3.1 接下来就是重头戏——免疫共沉淀反应了。
把我们之前选好的抗体加到蛋白溶液里，这时候就看抗体和目标蛋白“看对眼”了。
它们就像一对情侣，特异性地结合在一起。
然后再加入一些能结合抗体的东西，比如说Protein A或者Protein G琼脂糖珠，这就相当于给这对“情侣”找了个“媒人”，让它们更稳定地结合在一起。
3.2 在这个过程中，要给它们足够的时间和合适的条件去反应。
就像谈恋爱得有个过程一样，不能着急。
温度、时间这些条件都得控制好，不然的话，这“恋爱”谈不成，实验也就失败了。
四、清洗与分析。
4.1 反应完成后，得把那些没有结合的杂质给清洗掉。
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程
免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer (1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法) 做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法1.利用抗体的高度特异性与抗原结合，将抗原特异性地富集。
2.抗原-抗体复合物与磁珠或珠标记结合，通过磁力或离心作用将复合物分离沉淀下来。
1.材料准备：准备所需的细胞或组织样品，以及抗体、磁珠或珠标记等实验试剂。
2.细胞或组织提取：将细胞或组织样品裂解，并用适当的缓冲液重悬，获得蛋白质提取液。
3.抗体结合：将蛋白质提取液与所需的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.沉淀：将磁珠或珠标记加入抗原-抗体复合物中，使其结合，再利用磁力或离心作用将复合物沉淀下来。
5.洗涤：用适当的缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性的蛋白质。
6. 分离与检测：将沉淀物分离出来并进行进一步的分析、检测，如Western blotting、质谱分析等。
1.高特异性：通过使用特异性抗体，可以选择性地沉淀目标蛋白质，减少非特异性的干扰。
2.高灵敏度：沉淀后的蛋白质富集度高，有利于进一步的鉴定和分析。
3.可用于分析蛋白质相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用关系，揭示机体内蛋白质功能和信号传导的调控机制。
免疫共沉淀技术在生命科学研究中扮演着重要的角色。
例如，通过免疫共沉淀可以研究蛋白质与DNA、RNA或其他蛋白质的相互作用关系，从而了解基因调控、信号传导和代谢途径等重要生物学过程的调控机制。
此外，免疫共沉淀还可以用于筛选靶蛋白质、鉴定疾病标志物，以及评估一些药物对蛋白质相互作用的影响。
综上所述，免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，通过利用特异性抗体与所要研究的蛋白质结合，实现蛋白质的富集、分离和鉴定。
该技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和疾病研究等领域，对揭示分子相互作用、信号传导机制和疾病发生发展具有重要意义。
免疫共沉淀(Co-IP)
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
免疫共沉淀（Co-IP）技术流程
免疫共沉淀（Co-IP）技术流程一、免疫共沉淀（Co-IP）概述免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的原理开发出来的方法。
其基本原理是，为了研究细胞中蛋白A与蛋白B是否结合，在细胞裂解液中加入抗蛋白A的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与蛋白A结合的蛋白B，就可以形成这样一种复合物：“蛋白B—蛋白A—抗蛋白A抗体—agaroseProteinA或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
蛋白B然后经western blot或质谱检测目的蛋白。
蛋白A这种方法得到的蛋白B是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
二、技术流程1、收集经过处理的细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min, 细胞裂解液于4°C，12000转离心30 min后取上清；2、取少量裂解液以备免疫印迹分析，剩余裂解液中加入适量的相应抗体，4 °C缓慢摇晃孵育过夜；3、取10μL protein A 或GAgarose珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000 rpm离心3 min；4、将预处理过的10 μl protein A 或G琼脂糖珠加入到经过与抗体孵育的细胞裂解液中，4 °C缓慢摇晃孵育2~4h，使抗体与protein A或GAgarose珠偶联；5、免疫沉淀反应后，在4 °C以3000 rpm 速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 μL的3×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；6、SDS-PAGE, 免疫印迹或质谱仪分析。
rna免疫共沉淀技术
rna免疫共沉淀技术
RNA免疫共沉淀技术（RNA immunoprecipitation，简称RIP）
是一种用于研究RNA与蛋白质相互作用的实验方法。
该技术可以帮
助科研人员识别RNA分子与特定蛋白质之间的相互作用，从而揭示
细胞中的基因调控网络和信号传导途径。
在RIP实验中，首先将细胞或组织裂解，形成细胞提取物。
然后，使用特异性的抗体将目标蛋白质与其结合的RNA一起沉淀下来。
接着通过去除蛋白质，释放RNA，并进行后续的RNA分析，比如RT-qPCR或RNA测序，从而确定与目标蛋白质结合的RNA分子。
RIP技术的应用非常广泛，特别是在研究转录后调控、RNA降解
和转运等方面。
通过RIP实验，可以鉴定特定RNA分子与蛋白质的
相互作用，从而识别出参与调控基因表达的重要蛋白质，并揭示它
们在细胞功能和疾病发生中的作用。
除了传统的RIP技术，近年来还出现了一些改进的方法，如
CLIP-seq和HITS-CLIP等，这些方法结合了RNA免疫共沉淀和高通
量测序技术，可以更准确地鉴定RNA与蛋白质的结合位点和结合序列，为RNA蛋白互作研究提供了更多的信息。
总的来说，RNA免疫共沉淀技术是一项非常重要的实验方法，对于理解基因调控和RNA蛋白互作具有重要意义，为我们揭示细胞内部复杂的调控网络提供了有力的工具。
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血吸虫抱雌沟蛋白与幼虫巨大致死基因作用
? 构建p3 和质粒 ? 两质粒共转染 293T 细胞 ? 分离免疫沉淀复合物 ? 用抗体共沉淀 蛋白，用抗体验证。
家蚕微孢子虫胞壁蛋白单克隆抗体 靶蛋白的分离与质谱鉴定分析
? 利用微孢子虫胞壁蛋白制备2株单抗，鉴定分别 G10 识别虫体蛋白的三种成分， B10识别55左右一 种成分。
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免疫沉淀原理图解
2 免疫共沉淀定义
免疫共沉淀（，）是以抗体和抗原之间 的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互 作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整 细胞内生理性相互作用的有效方法。
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免疫共沉淀原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整 细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互 作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免 疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能 沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋 白质是否在体内结合；也可用于确定一种特 定蛋白质的新的作用搭档。
3 与质谱分析
原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用 抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共 沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳 分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
3 与质谱分析流程
4: 应 用
34重组质粒的构建及其在 7 细胞中的表达与定位
? 4为人P21活化激酶4，构建其34真核质 粒
? 转染7细胞。 ? 裂解细胞后用抗体免疫沉淀细胞裂解液
? 裂解虫体提取总蛋白利用制备的单抗进行免疫共 沉淀
? 切取结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱 （）分析，得到相应的肽序列标签
? 鉴定得出结论G10识别的70左右条带为热休克蛋白 70，B10识别的是一种未曾报到的蛋白，分析得到 其相关信息
THE END
Thank you
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用
2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而 可能有第三者在中间起桥梁作用；
3. 如用 检验，必须在实验前预测目的蛋白 是什么，以选择最后检测的抗体，若预测 不正确，实验就得不到结果，实验本身具 有冒险性。
实验的关键
1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和 抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在反应。 建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性 是问题。
2 免疫共沉淀原理图解
IP CO-IP
2
CA
C A+B
D
蛋白A ， 蛋白B 抗A抗体C进行洗脱 抗B抗体D进行验证
优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然状态；
2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的， 可以避免人为的影响；
3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复 合物。
缺点
实验室讨论
免疫共沉淀技术
1: 2: 3: 与质谱分析 4: 用
1
免疫沉淀定义
免疫沉淀（ ）是利用抗体特异性反应 纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体 可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常 为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。
1
免疫沉淀步骤
抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的 蛋白结合后，再与蛋白（），通过离心得到 珠子- 蛋白或二抗- 抗体- 目的蛋白复合物， 沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液， 煮沸5-10，在高温及还原剂的作用下，抗原 与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗 体、目的蛋白和少量的杂蛋白。
2. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必 须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
3. 考虑抗体 /缓冲液的比例。抗体过少就不能检出 抗原，过多则就不能沉降在上，残存在上清。缓冲 剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
3与质谱分析 质谱分析
质谱法( , ) ，即用电场和磁场将 运动的离子（带电荷的原子、分子或分 子碎片）按它们的质荷比分离后进行检 测的方法。测出了离子的准确质量，就 可以确定离子的化合物组成。
，沉降4蛋白。 ? 鉴定被沉降的目的的蛋白表达。
研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白
? P53 基因为一种人体抑癌基因人体癌症发生约 一半由于该的基因突变失活。
? 抗p53 抗体与1和2总蛋白进行免疫共沉淀 ? 分离免疫沉淀复合物 ? 切取p53 结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串
联质谱（）分析，得到相应的肽序列标签 ? 搜索数据库 分析目的蛋白相关数据