蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度的测定实验报告
蛋白质浓度的测定一．试验原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当他与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感性。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
故可用于蛋白质浓度的测定。
二．试验设备与试剂设备：普通离心机，721型分光光度计试剂：标准蛋白液（100ug/ml）三．实验材料新鲜绿豆芽四．实验内容1.标准曲线的制备取9支干净的试管，按表进行编号并加入试剂。
2.样品蛋白的测定（1）样品蛋白液制备准确称取2g新鲜绿豆芽胚轴的部分，研磨成匀浆，离心分离（4000r/min,10min）。
取上清液用0.9%nacl定容到10ml。
（2）含量测定另取两只干净的试管，加入样品液0.1ml，0.9mlnacl和考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀。
室温静置3min，与波长595nm处比色，读取吸光度。
五．实验结果1.标准曲线结果如表所示，并以吸光度为纵坐标，个标准液含量为横坐标做标准曲线。
标准曲线y = 0.0075x - 0.0023R 2= 0.9846-0.100.10.20.30.40.50.60.70.8050100150蛋白质含量吸光度A595线性 (A595)2. 样品蛋白含量的测定样品蛋白的比色结果如表，根据直线方程求出每支试管中蛋白质含量。
试管号 A595蛋白质含量 10 0.186 25.1511 0.179 24.17根据公式求出样品绿豆芽蛋白质含量六．结果与讨论结果： 绿豆芽蛋白质含量=1233.0ug/g讨论：1.试液为混合均与就取样2.量取溶液时读数有误差3.读取A 值时有读数误差4.比色杯中的误差如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。
蛋白质浓度测量标准
蛋白质浓度测量标准
蛋白质浓度是衡量蛋白质含量的重要参数。
因此，确定正确的蛋白质浓度对于许多生物化学和分子生物学实验至关重要。
这里我们介绍几种常用的蛋白质浓度测量标准。
1. 比色法：比色法是测定蛋白质浓度最常用的方法之一。
该方法基于分子间色素的吸收差异，比较未知浓度的蛋白质样品与已知浓度的标准样品的吸光度。
2. BCA法：BCA法是一种常用的蛋白质浓度测量标准，其原理为利用还原性离子（如Cu2+）与蛋白质中的蛋白质酪氨酸残基发生反应，形成紫色化合物，通过比色法确定蛋白质浓度。
3. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测量方法，其原理是通过蛋白质与碱式铜离子复合，还原Folin-Ciocalteu试剂，生成蓝色化合物，最后通过比色法确定蛋白质浓度。
4. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感的蛋白质浓度测量方法，其原理为蛋白质样品与Bradford染料发生结合，形成复合物后，可通过比色法确定蛋白质浓度。
总之，选择正确的蛋白质浓度测量标准对于实验的准确性和可靠性具有至关重要的作用。
在选择测量方法时，应该根据实验需要和样品的特性选择适合的方法。
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蛋白质浓度测定-Bradford
蛋白质浓度测定—Bradford法一、实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支三、操作方法1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100标准蛋白含量( g)0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0标准蛋白溶液（0.1mg/mL）(mL)0．1 0．2 0．3 待测蛋白质溶液(mL)2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水(mL)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2考马斯亮蓝试剂摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。
蛋白质浓度的测定
实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法有多种，常见的方法包括：
1. Bradford法：用Bradford试剂与蛋白质反应，形成蓝色的蛋白质-染料复合物。
根据复合物与蛋白质浓度成反比的关系，可以通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. Lowry法：将蛋白质与碱式铜试剂和Folin-Phenol试剂反应，生成紫色蛋白质-复合物。
通过比色法或荧光法测定复合物的吸光度，计算出蛋白质浓度。
3. BCA法：将蛋白质与BCA试剂反应形成紫色的蛋白质-染料复合物，根据复合物与蛋白质浓度成正比的关系，通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
4. UV分光光度法：利用蛋白质在280nm处的吸收峰测定蛋白质浓度。
该方法的优点是快速、简单，但需要纯化后的蛋白质，并且无法区分不同种类的蛋白质。
5. 二维凝胶电泳：分析各种蛋白在二维中的迁移距离，可以定量测定蛋白质的相对含量。
该方法需要复杂的操作和设备，但能够同时定量多种蛋白质。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法蛋白质是生物体内一类重要的生物大分子，其浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义。
目前常用的蛋白质浓度测定方法主要包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford法等。
下面将对这几种常用的蛋白质浓度测定方法进行详细介绍。
比色法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与某种试剂发生反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光度来确定蛋白质的浓度。
比色法操作简单，结果准确，适用于大多数蛋白质的浓度测定。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质和肽键发生还原反应而形成的紫色螯合物来测定蛋白质浓度的方法。
BCA法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和特异性，适用于各种类型的蛋白质。
Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与碱性铜离子和蛋白质中的酚类物质在碱性溶液中发生离子还原反应，生成蓝色络合物，通过测定其吸光度来确定蛋白质的浓度。
Lowry法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和稳定性，适用于大部分蛋白质的浓度测定。
Bradford法是一种基于某种染料与蛋白质中的氨基酸残基之间的相互作用来测定蛋白质浓度的方法。
Bradford法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和线性范围，适用于多种类型的蛋白质。
在进行蛋白质浓度测定时，需要注意以下几点，首先，选择合适的测定方法，根据样品的特性和实验要求进行选择；其次，掌握好操作技巧，严格按照操作步骤进行，避免操作失误；最后，对测定结果进行准确的记录和分析，确保结果的可靠性和准确性。
总之，蛋白质浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义，选择合适的测定方法并掌握好操作技巧是保证测定结果准确可靠的关键。
希望本文介绍的蛋白质浓度测定方法能够对您有所帮助。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法1.低里德试剂法低里德试剂法通过测定蛋白质与试剂中碱式染料之间的吸光度来计算蛋白质浓度。
常用的低里德试剂有考马斯亮蓝G-250和试剂Folin-Ciocalteu。
这种方法操作简便，灵敏度高，但依赖于特定的蛋白质。
2.比色法比色法使用吸光度测定蛋白质溶液中特定波长的光的吸收程度。
常用的试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和BCA试剂。
这些试剂与蛋白质发生化学反应后，形成显色物质，显色强度与蛋白质浓度成正比。
这种方法操作简便，灵敏度高，但对于一些物质干扰较大。
3.紫外吸收法紫外吸收法是通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度来计算蛋白质浓度。
蛋白质在280 nm波长下的吸光度与其含量成正比。
该方法对纯度较高的蛋白质测定较为准确，但对于包含核酸、色素等物质的溶液会有干扰。
4.氨基酸分析法氨基酸分析法是通过测定蛋白质中的氨基酸含量来估计蛋白质浓度。
可使用色谱法或光谱法进行氨基酸测定。
该方法需要较复杂的实验设置和仪器，适合用于纯化蛋白质或特定氨基酸分析。
5.生物学活性测定法生物学活性测定法是通过测定蛋白质对生物系统或特定底物的活化能力来估计蛋白质浓度。
例如，酶活测定法通过测定酶活性与酶浓度之间的关系来计算蛋白质浓度。
这种方法直接反映了蛋白质的功能性，但前提是需要具备可靠的活性测定方法。
在实验中选择合适的蛋白质浓度测定方法需要根据实验目的、样品属性和仪器设备等进行综合考虑。
此外，为了减小误差，实验过程中应注意控制实验条件的一致性，并进行适当的平行样品测定。
蛋白质浓度检测标准
蛋白质浓度检测标准引言蛋白质是生物体内非常重要的有机化合物，其浓度的准确检测对于许多生物学和生物化学研究具有重要意义。
蛋白质浓度的准确检测可以帮助科学家了解细胞内蛋白质的含量和分布，起到指导生物研究方法和结果解释的作用。
因此，制定蛋白质浓度检测标准至关重要。
确定蛋白质浓度的方法1.分光光度法分光光度法是目前最常用的测定蛋白质浓度的方法之一。
该方法利用蛋白质在特定波长下的吸光性质来测定其浓度。
具体操作步骤如下：–准备一定浓度的标准蛋白溶液，例如1mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液。
–使用分光光度计在280nm波长下测量标准蛋白溶液的吸光度。
记录吸光度与浓度的关系。
–测量待测蛋白溶液的吸光度，并根据标准曲线确定其浓度。
2.二氧化碳测定法二氧化碳测定法利用蛋白质氨基酸和二氧化碳的反应，原理是测定生成的二氧化碳量与蛋白质浓度成正比。
具体操作步骤如下：–将蛋白溶液与NaOH溶液混合，使蛋白质中的氨基酸与NaOH反应产生二氧化碳。
–静置反应混合液一段时间后，使用酸去除多余的NaOH。
–使用酸碱滴定法测定反应产生的一氧化碳的量，根据一氧化碳与蛋白质浓度的关系确定蛋白质的浓度。
3.比色法比色法是一种简单且常用的蛋白质浓度测定方法。
其原理是利用蛋白质与某些试剂的化学反应产生显色物质，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
具体操作步骤如下：–将蛋白质溶液与试剂混合，反应一段时间后生成显色物质。
–使用分光光度计测量显色物质的吸光度，根据吸光度与浓度的关系确定蛋白质的浓度。
蛋白质浓度检测的标准制定1.标准蛋白溶液的选取制定蛋白质浓度检测标准的第一步是选取标准蛋白溶液。
常用的标准蛋白溶液包括牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）等。
选取标准蛋白溶液时应考虑其纯度、稳定性、价格等因素。
2.确定标准曲线标准曲线是将已知浓度的标准蛋白溶液的吸光度与浓度进行关联的曲线。
制定标准曲线的具体步骤如下：–准备一系列浓度递增的标准蛋白溶液，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等。
测蛋白质浓度的方法
测蛋白质浓度的方法
测定蛋白质浓度的常用方法有：
1. 布拉德福法（Bradford法）：利用蛋白质与染料共存时发生吸光性变化的原理。
将样品与染料（布拉德福试剂）反应后，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
2. Lowry法：利用蛋白质与试剂（含铜离子和碱液）发生离子传递反应产生复合物，再与酚反应形成比色产物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
3. BCA法（双硫仑法）：利用蛋白质与试剂（含双硫仑和铜离子）反应生成紫色螯合物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
该方法适用于一般抗原浓度范围内。
4. 490 nm法：该方法利用酪氨酸与试剂（含酮氨酸和硫氰酸）发生反应生成紫色产物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
需要注意的是，不同方法适用于不同类型和浓度的蛋白质，选择合适的方法进行测定非常重要。
同时，测定结果可能受到样品的酸碱度、离子浓度、存在的干扰物等因素的影响，应尽可能控制这些条件以获得准确的测量结果。
蛋白质浓度的测定(精华)
蛋白质浓度的测定一．紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A(absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法在190-210 nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长范围内，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
检验蛋白质浓度的方法
检验蛋白质浓度的方法
常用检测蛋白质浓度的方法有比色法、质谱法、时间分光光度法、电泳法等。
1、比色法：利用蛋白质及其衍生物吸收光谱的特点，分别用不同浓度的染色剂对标准品和样品进行染色，然后比较染色后的色度强度多少，可确定蛋白质浓度。
2、质谱法：其原理是，利用质谱仪，通过电离质谱图，分析样品中各种分子量物质，通过其他组分中已知浓度的比较，考察来蛋白质浓度。
3、时间分光光度法：该法是利用偶联反应，比如蛋白质与某种琼脂糖结合反应等，在短时间内达到最高点，然后用某种光度测定仪检测，由其浓度变化来推测蛋白质的浓度。
4、电泳法：电泳法是检测蛋白质最常用的方法，原理是把样品放在凝胶泳道中，加上电压，使分子带电而沿正负极移动，然后根据电泳图判断蛋白质浓度。
蛋白定量试剂
兼容大多数去垢剂
蛋白定量方法中，测定最快速，方法最简单，且在室温下进行
蛋白质间差异性小于Bradford法
与大多数盐离子、溶剂、缓冲剂、硫醇、还原性物质和金属螯合剂兼容
缺点
能还原铜离子的物质也能造成显色，影响定量的准确性
与通常用于溶解膜蛋白的高浓度去垢剂不兼容
与铜离子螯合的试剂，DTT 等常见还原剂和特定的单个氨基酸也会在BCA检测中显色（半胱氨酸或胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）
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0
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0.3
0.4
0.5
每份标样分别加入BCA试剂200μl。
2、配制待测样品：准确吸取20μl样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度标曲浓度范围内。
2、配制待测样品：准确吸取50μl样品溶液于孔板中，加入考马斯亮蓝G250试剂200μl。静置10min后检测。如待测样品需稀释，稀释倍数需根据原始样品浓度进行适当调整，一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml。
3、用酶标仪在595nm波长下测定溶液的吸光度。以BSA含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
考马斯亮蓝G250
6104-58-1
磷酸
7664-38-2
乙醇(95%)
蛋白浓度测定的方法
蛋白浓度测定的方法蛋白质是生物体内的重要物质，对于许多实验室研究和临床诊断都有着重要的意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度是非常关键的。
目前，常用的蛋白质浓度测定方法主要有生物学素法、分光光度法、BCA法、Lowry法、Bradford法和尿素法等。
下面将分别介绍这些方法的原理和操作过程。
1.生物学素法：生物学素法是一种通过测定蛋白质与棒状素之间的结合来确定蛋白质浓度的方法。
这种方法主要应用于血浆、血清和尿液等样品的蛋白质测定。
实验方法如下：a.准备一组具有不同浓度的棒状素溶液。
b.将待测蛋白质溶液与棒状素一起孵育一段时间。
c.通过酸甲醛试剂对母液进行反应，并测量光密度。
d.制作标准曲线，并根据待测样品的光密度与标准曲线的关系计算蛋白质浓度。
2.分光光度法：分光光度法是一种通过测定蛋白质对特定波长的紫外光吸收量来计算浓度的方法。
这种方法适用于纯度较高的蛋白质样品。
实验方法如下：a. 准备一组蛋白质标准溶液，并使用光度计测量其在280nm波长处的吸光度。
b.将待测蛋白质样品的吸光度值与标准溶液的吸光度值进行比较，并计算浓度。
3.BCA法：BCA法是一种通过测定蛋白质与巴氏试剂之间的反应产生的紫色络合物的吸光度来计算蛋白质浓度的方法。
该方法对于各种类型的蛋白质样品都适用。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入BCA试剂。
b.将待测蛋白质样品与BCA试剂孵育一段时间。
c.使用光度计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
4. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，通过低里试剂和碱式铜试液与蛋白质样品反应，产生紫色或蓝色化合物，并通过比色计测量光密度来计算蛋白质浓度。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入低里试剂和碱式铜试液。
b.将待测蛋白质样品与低里试剂和碱式铜试液反应一段时间。
c.使用比色计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
5. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感且广泛应用的蛋白质浓度测定方法，通过考虑到蛋白质在酸性溶液中与染料试剂环氧化苏丹蓝的特异性作用来计算浓度。
蛋白质浓度测定
三、Lowry法
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应， 即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷 钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双 缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶 液。其干扰物质与双缩脲法相同，要注意的是，加入福林试剂时要 特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只 有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶 液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能 有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
二、BCA（Bicinchoninine 法
acid
assay）
这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶 液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化 合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极 强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单， 敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污 剂干扰。
测定
标本 标准 空白 H2O(ml) 0.15 0.15 0.2 细胞提取物 0.05 ----BSA --0.05 --试剂C 1 1 1 放室温10分钟,此时可稀释Folin试剂 稀释Folin 0.1 0.1 0.1 加塞, 放水箱37°C, 30分钟, 取出后在 500nm测光密度 计算: ΔO.D unk / ΔO.D stand = Pr(mg/ml)
比色法蛋白浓度测定
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础 是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外 加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质 的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应 蛋白质浓度。
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蛋白质浓度的测定一．紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1 mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A(absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法在190-210 nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长范围内，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
对于不同的蛋白质，其消光系数差别很小。
该方法的优点是操作简单，灵敏度高，样品可以回收。
缺点：在使用前，必须对分光光度计进行准确校正，多种buffer，heme or pyridoxal groups在该波长具有很强的吸收紫外光的能力。
测定：1.用生理盐水溶解蛋白质样品，确保其在215 nm处的吸收值小于1.5。
2.磷酸钾buffer不影响吸收值的测定。
3.计算公式：A2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205) 或Protein concentration (µg/mL) =144 (A215– A225)。
Notes:1.使用这两个方法进行蛋白质定量时，最佳的吸收值范围为0.05-1，当吸收值为0.3时，测定的结果最精确。
2.如果样品浑浊，可以扣除310 nm处的吸收值。
3.当蛋白质浓度很低时，蛋白质可能会吸附在石英杯内壁，从而影响蛋白质浓度的测定，在溶液中提高离子强度或者添加非离子型去垢剂可以防止这种现象的发生。
4. 1 mg/ml的BSA的吸收值为0.06，通常作为蛋白标准品。
5.当溶液中存在核酸时，可以用下列公式计算蛋白质浓度：Protein (mg/mL) = (A235–A280)/2.51Protein (mg/mL) = (A235–A280)/2.51Protein (mg/mL) = 0.183 A230– 0.0758 A2606.当吸收值小于2时，在215 nm处测定的吸收值符合朗伯比尔定律。
7.在215 nm处进行测定时，sodium chloride, ammonium sulfate, borate, phosphate,and Tris 不会影响吸收值的测定，但是0.1 M acetate, succinate, citrate, phthalate, and barbiturate 具有很强的吸收值。
8.在pH 4-8的范围内，215–225 nm的吸收值没有变化。
9.当蛋白质中存在核酸时，也可以这样计算：protein concentration (in mg/ml) =F× A280 (assuming the cuvette is 1 cm wide).二．Lowry法与BCA法Lowry法与BCA法测定蛋白的浓度的原理包括两个步骤。
第一步，基于双缩脲反应。
在碱性溶液中，肽键中的N原子结合二价铜离子，将Cu2+还原成Cu+，并形成一种铜离子络合物，反应后的溶液呈紫色，溶液在540 nm处有明显的吸收峰，根据朗伯比尔定律，可以测定蛋白质的浓度。
双缩脲反应但是，直接测定肽键与铜离子络合物的吸收值灵敏度低，所以通常继续进行第二步反应增加灵敏度。
在Lowry法中，Cu+在第二步反应中会与Folin–酚试剂反应。
该试剂是一种钼磷酸盐与磷钨酸盐的混合物。
反应的本质是Mo6+还原成钼蓝（Mo4+），此反应依赖于Cu+催化的芳香族氨基酸（酪氨酸与色氨酸）的氧化。
因此，与近紫外吸收光谱法一样，Lowry法测定的蛋白质浓度也只是一个近似值，不同的蛋白质所含有的色氨酸与酪氨酸数目的差异会导致所测浓度值存在误差。
实验材料：1.络合物生成试剂：在实验开始前，以100:1:1的体积比混合下列溶液。
溶液A：2% (w/v) Na2CO3;溶液B：1% (w/v) CuSO4·5H2O;溶液C：2% (w/v)酒石酸钾。
2. 2 M NaOH。
3.Folin试剂。
使用时为1当量浓度（N）。
4.标准：将2 mg/ml的BSA按照下表进行稀释。
方法：1.取0.1 ml样品溶液或者标准溶液，加入0.1 ml 1 M 氢氧化钠，在100℃水解反应10分钟。
2.冷却水解产物至室温，加入1 ml新鲜混合的络合物生成试剂，混匀后室温静置10分钟。
3.加入0.1 ml Folin酚试剂，迅速震荡混匀，室温静置30-60分钟，不要超过60分钟。
4.当蛋白浓度小于0.5 mg/ml时，读取750 nm处吸收值。
当蛋白浓度0.1-2.0mg/ml时，读取550 nm处吸收值。
5.绘制标准溶液浓度曲线，根据比对此曲线吸收值对应的浓度，确定位置蛋白质的浓度。
Notes:1.当蛋白质样品以沉淀存在时，用2 M氢氧化钠溶液溶解样品，然后按照步骤一进行水解。
然后取0.2 ml水解产物进入步骤二。
2.全细胞或复合物样品需要预处理。
处理方法见The Protein ProtocolsHandbook, second edition, Page 29.3.确保水解反应在pH 10-10.5。
4.反应孵育时间可以从10分钟到几个小时，影响不大。
5.涡旋振荡步骤是该方法可重复的关键。
因为Folin酚试剂很容易失效，因此加入后要迅速充分的震荡混匀。
6.高浓度时标准溶液曲线可能不是线性的，因此最佳测定范围：0.01-1 mg/ml。
7.因为不同的蛋白质所含有的色氨酸与酪氨酸的数目不同，为了浓度的准确性，可以采用多种标准蛋白质溶液绘制曲线，求得多个浓度值，最后取平均浓度值。
8.Buffer，药物，还原糖，核酸等物质都会干扰蛋白质浓度的测定。
9.分两次加入Folin酚试剂，每次加入后充分混匀，可以提高20%的灵敏度。
加入Folin酚试剂后3分钟时加入二硫苏糖醇，可以将反应灵敏度提高50%。
10.升高温度可以加快反应的进行，对反应结果影响不大。
与Lowry法一致，BCA法基于二价铜离子还原成一价铜离子的反应测定蛋白质的浓度。
第二步，每两分子的BCA螯合一分子一价铜离子，形成在562 nm具有强吸收峰的紫色复合物。
此反应依赖于半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸与色氨酸侧链，高温下肽键可以参与铜离子的还原，因此高温反应可以降低不同蛋白质之间因氨基酸组成差异而造成的结果差异。
与Folin试剂相比较，BCA在碱性条件下很稳定，也没有那么容易受到其他物质的干扰，因此，BCA法目前基本上取代了Lowry 法。
实验材料标准实验：试剂A：sodium bicinchoninate (0.1 g), Na2CO3 · H2O (2.0 g), sodium tartrate (dihydrate) (0.16 g), NaOH (0.4 g), NaHCO3 (0.95 g), made up to 100 mL. If necessary, adjust the pH to 11.25 with NaHCO3 or NaOH。
试剂B：Reagent B: CuSO4 · 5H2O (0.4 g) in 10 mL of waterStandard working reagent (SWR): 混合100体积regent A与2体积reagent B. 溶液呈苹果绿色，室温下可以稳定保存1周。
微量测定：Reagent A: Na2CO3 · H2O (0.8 g), NaOH (1.6 g), sodium tartrate (dihydrate) (1.6 g), made up to 100 mL with water, and adjusted to pH 11.25 with 10 M NaOH. Reagent B: BCA (4.0 g) in 100 mL of water.Reagent C: CuSO4 · 5H2O (0.4 g) in 10 mL of water.Standard working reagent (SWR): Mix 1 vol of reagent C with 25 vol of reagent B, then add 26 vol of reagent A.方法：见The Protein Protocols Handbook, Page 31。
Notes:1.试剂A与B非常稳定，可以购买。
2.延长样品孵育时间可以增强灵敏度。
注意要保持标准品孵育时间与样品孵育时间一致。
3.加热后，溶液颜色在1小时内都是非常稳定的。
4.样品中含有干扰物质时，可以将样品结合到尼龙膜上，然后洗掉杂质，BCA可以与膜上的蛋白质反应。