相对定量简易操作流程
相对定量实验方法与数据分析
自制荧光定量PCR试剂体系：
常规PCR体系 SYBRGreen或TaqMan探针 备注：Real-Time实验中通常使用热启动酶以降低引物二聚体和非特异性扩增出现的可能性， SYB RGreen对PCR反应有抑制作用，加入量要进行优化
混合试剂
混合：
试剂按照体积大小从大往小的加，将引物/探针（TaqMan方法选用），Real-Time PCR Premix 和PCR water加入到反应管中，cDNA模板最后加。如果是同种引物/探针有多管 的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后 再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染 操作注意事项 1. 2. 3. 4. 样本制备区和加样区要同扩增区分开，避免污染。定量PCR是非常灵敏的实验，微量污 染也会被扩增出，影响结果分析 加样操作要做到非常精确，微量的加样误差也会对实验的重复性造成非常大的影响 PCR预混合液如果需要多次使用，要避光分装保存。避免反复冻融和荧光染料见光降解 每次使用PCR预混合液时要等融化后完全混匀，否则对PCR效率造成很大影响
如果使用TaqMan探针，那么TaqMan探针的结合位置应尽量靠近引物的结合位置， 最好仅相差一个碱基。TaqMan探针的分析方法依赖于Taq酶的5’-列：引物长度一般为18-30base之间，在紧靠引物3’端的5个碱基中不能出现2个或2 个以上的G或C序列，这样会增加非特异性扩增的可能性。上下游引物避免出现连续的互补序列，防 止引物二聚体的形成 扩增产物长度：扩增产物长度最好控制在50-150bp之间，因为扩增较小的片断，PCR效率高。如果 扩增产品不能减少到150bp以内，但可以保证PCR效率接近100%的引物也可以使用。 G/C含量：G/C含量可以在30% ～ 80%之间，不要出现连续4个相连的G. 如果引物序列中的G/C含量 过高会降低PCR效率，也可能会增加非特异性扩增的可能性。在使用SYBRGreen法的相对定量实验时 更应注意引物序列中的G/C含量 Tm值：引物的Tm值是关系到PCR循环设计的参数，引物的Tm一般设计在58～60℃，上下游引物的Tm 不要相差2 ℃以上。探针的Tm值高于引物的Tm值5 ～ 10 ℃左右 探针序列：在探针的5’端结尾碱基不能是G，因为如果G存在，探针即使在水解后的荧光也依然会 被粹灭，影响结果分析
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
定量PCR实验操作流程
五：实验操作
• RNA抽提
• 相分离 • 室温放置上述样品液10min左右后，每 1mLTRIzol 中加入氯仿为200μL，盖上盖子， 剧烈振荡约1min，室温静置5min，然后 12000g 冷冻离心15min（4℃），小心取出 样品，通过观察可以发现样品分三层，其 ：实验内容
• • • • 细胞RNA抽提 RNA反转录 定量PCR检测 数据分析
四：实验主要仪器和试剂
• 主要实验仪器
• • • • • 冷冻超速离心机 常规PCR仪 酶标仪 电泳系统 CFX96 Real Time PCR System
四：实验主要仪器和试剂
• 主要实验试剂
• RIzol（Invitrogen）、RNA级氯仿、冷冻异 丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水 • TaKaRa Kits
试剂 SYBR® Premix Ex TaqTM II（2×） PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） 模板（cDNA溶液） 使用量 10 μl 1 μl 1 μl 1 μl 终浓度 1× 0.5 μM*1 0.5 μM*1 *2
dH2O
五：实验操作
• 实验数据分析结果
GAPDH
IL-6
五：实验操作
• 实验数据分析结果
1 04-15-09Time effect of LPS on cytokine mRNA IL-6 no treat 31.49 31.46 31.60 31.46 31.28 31.46 LPS(0.1 ug/mL)_1h 29.47 29.59 29.23 29.59 30.09 29.59 LPS(0.1 ug/mL)_3h 19.74 19.84 19.88 19.84 19.91 19.84 LPS(0.1 ug/mL)_6h 18.58 18.51 18.40 18.51 18.56 18.51 LPS(0.1 ug/mL)_12h 17.36 17.48 17.55 17.48 17.53 17.48 LPS(0.1 ug/mL)_24h 18.71 18.75 18.64 18.75 18.90 18.75 NC 31.85 31.81 31.94 31.81 31.64 31.81 expression in mouse RAW macrophage GAPDH S1 S2 17.10 16.99 14.47 0.00 17.13 16.99 14.47 0.00 16.73 16.99 14.47 0.00 17.20 17.25 12.22 -2.25 17.32 17.25 11.97 -2.50 17.24 17.25 12.83 -1.64 17.23 17.14 2.60 -11.87 17.21 17.14 2.74 -11.73 16.97 17.14 2.77 -11.70 17.44 17.47 1.11 -13.36 17.50 17.47 0.92 -13.55 17.48 17.47 1.09 -13.38 17.18 17.24 0.11 -14.36 17.45 17.24 0.30 -14.17 17.10 17.24 0.29 -14.18 17.07 17.01 1.70 -12.77 17.12 17.01 1.63 -12.84 16.85 17.01 1.88 -12.59 25.83 25.05 24.88 25.05 24.43 25.05 POWER 1.00 1.00 1.00 4.77 5.65 3.11 3746.22 3385.45 3318.35 10543.64 11960.07 10682.73 20975.92 18372.32 18616.37 7000.99 7329.39 6144.93
定量PCR分析的相对定量法
定量PCR分析的相对定量法预先研读科研文献，提出问题。
拟用60Co-γ射线照射HeLa细胞，经0，2，4，8，10Gy不同吸收剂量照射4小时后，研究60Co-γ射线对GRP78 mRNA表达水平的剂量影响关系。
设计拟扩增GRP78以及GAPDH（内参基因）引物序列，稀释合成后引物，验证是否合格能用，储存备用。
上下引物可以考虑预混，储存备用。
准备总RNA提取试剂盒，熟悉实验方法，即熟悉基本步骤与相应所用耗材，准备所用耗材。
知道经该试剂盒方法提取后实际剩下的总RNA体积数。
先培养二瓶细胞，长满后消化后混合，细胞计数，分成6瓶细胞，接种培养至第二天早晨。
编号。
送去钴源室60Co-γ射线照射，无菌操作，放回培养4小时。
按试剂盒程序提取各瓶细胞总RNA。
编号，测定并记录各管总RNA含量与体积数。
当天反转录成cDNA，并编号，测定总cDNA含量与体积数。
预约定量PCR仪器使用时间。
做5X6X2=60份定量PCR反应计划，因有5个剂量组，每一个剂量组做6次平行，2个基因。
考虑额外需要，故预混试剂拟按70份反应计划去准备。
做好96孔板中各孔排布图。
配制除样品cDNA和引物外的预混液，按计划加入96孔板中各孔指定位置内。
再有规律地依次加入规定量的cDNA样品，然后在排布图指定孔位置中加入指定量和指定种类的引物。
核实或做好加样记录。
定量PCR仪器分析开机预热、设定定量PCR仪器基本参数、位置参数和循环参数等；再次混匀96孔板中样品，将样品96孔板放入仪器中，检查后运行PCR仪器。
设计原始资料表格样式，记录各组实际扩增后所得CT值。
根据前面介绍的绝对定量法得到的标准曲线如下图，结合上表查找相应的基因含量数，转录如下表中，然后计算相应的平均数与标准差。
根据均值二次校对值和校对SD用SPSS软件做结果的ANOV A统计分析，检验各组之间的差异有无统计学意义，然后用excel软件作柱状图，并在柱状图上标示出SD变化，以及有无统计显著性差异的标识。
7500 2.0相对定量
AppliedBiosystems7500荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS 2.07500定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start >All Programs > Applied Biosystems > 7500Software >7500 V2.0开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup（Fig1-1）。
Fig 12.默认进入Setup 下的Experiment Properties 界面2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.3在实验类型中，选择Quantitation-Standard Curve2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的Plate Setup 界面，编辑基因（Target）及样本（Sample）：Fig23.1在界面中设置基因及样品（Fig2-1）。
利用“Add New Target”（Fig2-2）添加新的基因，并编辑基因名称及所标记的荧光种类。
例如基因名称为18S，报告基团为FAM，淬灭基团为NFQ-MGB，进行如下图的设定。
也可以通过下拉菜单进行不同的选择：TAMRA作为淬灭基团时选择TAMRA，其他非荧光淬灭基团选择None。
还可以利用其他按钮将之前已添加的基因进行保存或删除。
利用AddNew Sample（Fig2-3）添加新的样本，并编辑样品名称。
3.2在进行样品板的排布。
利用鼠标单击或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本（Fig3-1），同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U代表未知样本，N代表阴性对照，Fig3）。
Fig33.3在“Select relative quantitaion settings”中设置内参基因及参照样本（Fig3-3）。
3.4在“Select the dye to use as passive reference”（Fig3-4）中设置参比荧光，如下。
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对荧光定量PCR三种常⽤⽅法、注意事项相对定量⽅法实际操作（三种常⽤⽅法）本⼈⽤的是相对荧光定量PCR法，在分⼦⽔平上⽐较课题中5种新基因的表达差异。
实验进⾏很多次，感受颇深，同时遇到了⼀些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同⾏朋友⼀起探讨和指教。
1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）1).先对样品中的⽬的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否⼀致或接近；将扩增效率优化为⼀致。
2).同⼀样品分别进⾏看家基因和⽬的基因的扩增，分列在两页中公式：P1 P2相同的样品在两页⾥命名成相同的名称，并定义为unknown分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填⼊，并定义对照样品完成分析F=2—待检样品看对照组⽬的基因平均Ct对照组看家—待检样品⽬——Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应⽤1). Comparative Delta-delta Ct法是很常⽤的⼀种相对定量⽅法，其最⼤特点是，当优化的体系已经建⽴后，在每次实验中⽆需再对看家基因和⽬的基因做标准曲线，⽽只需对待测样品分别进⾏PCR扩增即可。
2). 其缺点是，每次实验都默认⽬的基因和看家基因的扩增效率⼀致，⽽并⾮真实扩增情况的反映，这⾥势必存在⼀定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对⽬的基因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene 的软件会⾃动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差⼩于0.1，那么后续实验中就可以⽤Comparative Delta-delta Ct法进⾏相对定量分析。
反之，如果M差值⼤于0.1，就⽆法⽤该⽅法进⾏相对定量分析。
此时的解决⽅法有两种，⼀是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值⼩于0.1，⼆是换⽤其它的相对定量⽅法。
相对定量简易操作流程SDS1.4
applied biosystems 7300/7500/7500 FastReal‐Time PCR System相对定量简易操作指南SDS 1.41. 仪器启动1.1. 打开计算机，待开机完成后再打开 7300/7500/7500 Fast 主机电源；1.2. 待仪器自检完成显示绿灯常亮后，双击计算机屏幕上的软件快 捷图标 开启ABI Prism 7300/7500/7500 Fast SDS软件 ；2. 实验文件设置2.1. 点击进入Create New Document界面：2.2. 在New Document Wizard界面中：在Assay中选择 ddCt (Relative Quantitation) Plate ○1 ，点击Next ○2；2.3. 编辑Detector：2.3.1.选中此次实验所用的Detector ○1，点击Add将Detector加入 Detectors in Document ○2，点击Next○3；2.3.2. 新建Detector：点击New Detector建立新的Detector○1，输入相应信息后点击ok○2，点击Next ○3；也可点击 Create Another，继续添加Detector；Name: 输入基因名称；Reporter Dye: 选择荧光种类；Quencher Dye: MGB 淬灭基团选None；TAMRA淬灭基团选TAMRA；SYBR 选 none；2.3.3. 删除Detector：如果文件中Detector过多需要删除，则在set up 界面中，点击Tools，并在下拉菜单 Detector Manager 中选择不需要的Detector 进行删除；2.4. 命名样品：选定Plate Document 中放样品的孔，选择Detector，在Detector列中Use下勾选○1，同时在Task栏中选择样品的种类○2：Target （目的基因），ENDO（内参基因），点击Finish○3；2.5. 保存文件：点击 File，在下拉菜单中选Save As，输入文件名称并存成SDS Document (*.sds) 的格式；2.6. 设置PCR反应条件：Plate Document 上点击Instrument，进入PCR反应程序设定窗口，可直接更改温度和时间，也可以利用Add Cycle，Add Hold，Add Step或Delete来更改反应步骤，信号收集设置在延伸步骤；使用 SYBR染料法，则点击Add Dissociation Stage添加熔解曲线步骤；3. 结果分析：3.1. 分析查看相对定量数据：运行结束后，单击分析数据；3.2. 在Results选项卡下查看扩增结果：3.3. 相对定量研究分析：点击File，选择New，进入New document Wizard，在Assay中选择ddCt (Relative Quantitation) study○1，点击Next○2；3.3.1. 单击Add plates添加反应板，然后单击Open；在一个RQ研究中最 多可添加10个反应板，单击Finish；如果要同时分析多个plate document，必须确认:a.所有PCR反应板的条件必须一致；b. 正确设置sample name；c. 所有PCR反应板需要有相同的内参基因；3.3.2. 数据分析：选择数据显示方式○1，选择对照样品○2，选择柱状图显示方式○3，进行分析○4；3.4. 导出数据：可点击File，在下拉菜单中选择Export，接着选择Results，导出 .csv数据，用Excel打开。
QS 6 7 相对定量简易操作指南
Applied Biosystems QuantStudio6&7实时荧光定量PCR仪V1.X相对定量简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start>All programs>Applied Biosystems>QuantStudio™Real-Time PCR Software>QuantStudio™Real-Time PCR Software开启软件。
进入主界面后选择“Experiment Setup”。
2.选择“Setup”下的“Experiment Properties”界面。
2.1输入实验名称(Experiment Name)。
2.2选择仪器类型及Block类型。
2.3选择相对定量实验类型，“Comparative C T”。
2.4选择试剂种类。
Taqman探针法选择“Taqman Reagents”，SYBR染料法选择“SYBR Green Reagents”。
2.5选择运行模式。
普通试剂选择“Standard”，快速试剂选择“Fast"。
3.选择“Setup”下的“Define”界面设置基因名称(Target)和样品名称(Sample)。
3.1在“Targets”下点击“New”，添加待测基因。
在“Target Name”中编辑基因名称，“Reporter”和“Quencher”中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于“Quencher”的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团则选择None。
3.2在“Samples”下点击“New”，添加待测样品。
在“Sample Name”中编辑样品名称。
3.3在“Analysis Settings”下选择合适的“Reference Sample”（对照样品）和“Endogenous Control”（内参基因）。
4.选择“Setup”下的“Assign”界面编辑样品板。
qPCR实验操作、分析、数据处理完整攻略
qPCR实验操作、分析、数据处理完整攻略Hi，又见面了大家，最近不得不说的就是由新型冠状病毒引起的全国性疫情。
本着“口罩带好，论文接稿”的态度，本人老老实实待在家中，躺在床上一动不动。
可是我那上进的师妹看到新型冠状病毒的检测方法qPCR，想到了一些奇怪的实验数据，微信上发来好多问题，刚好趁此机会，我们就一起学习这个经典不可或缺的实验qPCR。
最开始进入实验室时，就能听到一堆类似名词，RT-PCR、qPCR、real-time PCR。
首先我们区分一下，qPCR（Quantitative Real-time PCR）一般认为是real-time PCR的简称，即为实时定量基因扩增荧光检测系统，可以对原始模板数量进行精准的检测。
而RT-PCR是逆转录PCR（Reverse transcription PCR）, 是将RNA模板反转录成DNA 再进行扩增的实验。
这里需要注意虽然real-time PCR和Reverse transcription PCR的前缀都可以缩写为RT，但是我们一般认为RT-PCR是逆转录PCR。
（图片来自网络）首先我们要了解qPCR的实验原理，简单来说就是PCR扩增过程中，通过荧光信号的收集，以扩增和熔解曲线的方式对PCR进程进行实时检测。
一、实验操作qPCR的实验操作可谓说是比较简单，有一套详细的说明书各位小伙伴们都不在话下，但是还有一些小tip!1. 试剂耗材准备：qPCR的操作简单但是要严谨！建议小伙伴们提前备好耗材和试剂！耗材保证：无酶无菌，个人建议尽量选择进口枪头，减少液体挂壁，更为准确。
（使用过很多厂家的八连管，进口的不管是做工还是结果上，本人都觉得更好，也欢迎小伙伴们好货推荐！）镊子提前高压，加样所用金属托架提前放置冰箱降温。
2. RNA提取和反转录：低温操作！Trizol提取时注意蛋白质层的分离！Mix配置后切忌不可反复冻融！注意空气中小片段核酸污染！RNA提取后不可久放尽快反转录！3. 体系配制：注意避光！首先口罩戴起，头发扎好；每个样品设置3个平行孔，保证数据真实可用；反转录时可能同一样本核酸有多个小EP管分装，建议配体系时尽量转移一个管中混匀后加样，保证平行孔间数据稳定；没有排枪的小伙伴们加样只要手法稳定也是能保证结果的。
荧光定量相对定量操作方法
荧光定量相对定量操作方法
荧光定量实验通常包括以下步骤：
1. 制备标准曲线
使用已知浓度的标准物质，如DNA、蛋白质等制备一系列不同浓度的标准溶液。
将这些标准溶液分别加入荧光染料，测定它们的荧光强度，并绘制荧光强度与浓度之间的标准曲线。
2. 样品处理
样品可能需要进行预处理，如细胞裂解、核酸或蛋白质的提取和纯化等。
根据实验需要，样品还可能要进行稀释、消除背景干扰等操作。
3. 荧光检测
将荧光染料加入样品中，使样品中的目标分子与荧光染料结合，并在特定的波长下激发荧光。
使用荧光检测仪测定样品中荧光的强度。
4.计算浓度
根据标准曲线，将样品中荧光的强度转化为目标分子浓度。
对于相对定量实验，可以将不同样品的荧光强度进行比较，而无需计算准确浓度。
相对定量
定量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。
还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR仪上实现的呢？下面将进行一一介绍。
利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量：用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。
一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。
软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。
点示“Analysis”，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线（包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。
若是使用SYBR Green I法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。
对于SYBR Green I的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。
同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。
完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。
利用定量技术进行基因型分析研究：常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法（又称Hyb 探针），运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR 仪。
荧光定量简易操作流程
Applied Biosystems QuantStudio 3 & 5实时荧光定量PCR 仪V1.X 相对定量简易操作流程1、双击桌面图标开启QuantStudio Design & Analysis Software，或从开始菜单 > All Programs > Applied Biosystems > Quant Studio Design & Analysis Software> Quant Studio Design & Analysis Software开启软件。
2、进入主界面后，点击“Create New Experiment”。
3、在“Properties”界面设置实验属性：a.输入实验的名称；b.选择仪器型号；c.选择仪器的block（加热模块）类型；d.选择实验类型：“Comparative C T(∆∆C T)”；e.选择实验试剂类型：Taqman 探针法选择“Taqman reagents”，SYBR 染料法选择“SYBR Green Reagents”，其他选择“Other”；f.选择运行模式（run mode）：普通试剂选择“Standard”；快速试剂选择“Fast”。
4、点击“Next ”进入“Method”界面，设置实验的运行程序：4.1、（可选）设置多梯度反应温度：○1单击（Advanced Settings）；○2勾选veriflex，○3然后更改block上相应的反应温度，相邻区域温度差异不能超过5℃。
注：QuantStudio 3 可设置3个梯度反应温度；上图为QuantStudio 5示例图，可设置6个梯度反应温度。
4.2、（可选）设置暂停程序：点击○1图标，○2勾选Pause，○3设置暂停前的反应循环数（Pause after cycles），以及暂停后的温度（Pausing Temperature，范围：4~30℃）。
StepOneV2.X 相对定量简易操作流程
applied biosystems StepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS 2.2StepOne/StepOnePlus定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOneSoftware> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：2.1输入实验名称（Experiment Name）2.2确认仪器型号2.32.3在实验类型中，选择Quantitation-Comparative C T (ΔΔC T)2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample Name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U 代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3 在Select Relative Quantitation Settings 中（参看上图）选择对照样本及内参基因。
定量分析的一般步骤
表14-1 标准筛的筛号和孔径 缩分的目的：使粉碎后的试样量逐渐减少，一 般采用四分法。
例 题 :有 试 样 2 0 k g ， 粗 碎 后 最 大 粒 度 为 6 m m 左
筛号/目 3 6 10 20 40 60 80 100 120 140 200
右 ， 设 K 值 为 0 .2 ， 应 保 留 试 样 量 为 多 少 ?
03
酸性熔剂K2S2O7（熔点419 ℃）、KHSO4（熔点219℃）溶解碱性试样
灼烧时
2KHSO4=K2S2O7＋H2O
04
分解金红石 TiO2 + 2K2S2O7 = Ti(SO4)2 + 2K2SO4
✓ 碱熔法
碱性熔剂Na2CO3 ,K2CO3 ,NaOH ,KOH, Na2O2 或混合 例: 钠长石
要采取一系列减小误差的措施，对整个分析过程进
01
行质量控制 要采用行之有效的方法对分析结果进行评价，及时
ห้องสมุดไป่ตู้02
发现分析过程中的问题，确保分析结果的可靠性 03 14-4 分析结果准确度的保证和评价
分析结果的评价（对分析结果是否“可取”作出判断）
实验室内的质量评价
实验室间的质量评价
○ 对于一种新的试验方法，要检查其准确度和精密度 ● 在工业生产的质量控制和日常分析测试数据的有效性检验时，常用质量控制图（P421图 14-1）。
强氧化性酸---HClO4
1
2
高沸点203℃；除K+ 、NH4+外，其它盐均溶 于水；
浓热高氯酸具有强的脱水和氧化能力常用于不 锈钢、硫化物的分解和破坏有机物；
3
4
注意安全：浓度低于85%的纯高氯酸十分稳定， 但有强脱水剂（如浓硫酸）或有机物、某些还 原剂等存在一起加热时，就会发生剧烈的爆炸。
定量分析的一般步骤Ⅰ
较均匀的粉状固体或液体
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-7
2.组成很不均匀的物料
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-8 根据矿石的堆放情况和颗粒的大小来选取合理的取样点及采集量。 Q为所需试样的最小质量，单位为kg； K为缩分系数，试样均匀度越差， K值越大 d为试样的最大粒度（直径，单位mm） 将采集到的试样经过多次破碎、过筛、混匀、缩分后才能得到符合分析要求的试样。
1.1 取样的基本原则
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-3
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-4
14-1 试样的采取和制备
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14-3 测定方法的选择
第23 讲 第 14 章 定量分析的一般步骤 23-1 定量分析大致包括以下几个步骤：取样、试样的分解、干扰组分的分离、测定、数据处理及分析结果的表示。
测定的具体要求 欲测组分的含量范围 待测组分的性质 共存组分的影响 实验室条件
快餐定量操作方法
快餐定量操作方法
快餐定量操作方法是指在快餐店铺中，根据顾客的需求进行食材的分量控制和制作过程的规范化操作。
以下是一些快餐定量操作方法的示例：
1. 准备食材：根据每道菜品的配方规定，准备好所需的食材，并按照预定的分量进行称量或切割。
2. 烹调过程：根据菜品的要求，将食材烹调至恰到好处。
如炒菜时，根据菜品的配方和要求，掌握好火候和时间，以确保食材的口感和熟度。
3. 分量控制：根据菜品规定的分量，使用称量器具或标准量杯等工具，确保每个菜品的食材分量合乎要求。
例如，每份汉堡中的肉饼、生菜、番茄等食材的分量应保持一致。
4. 组装制作：根据快餐的标准流程，将烹调好的食材按照菜品的要求进行组装制作。
例如，将烤好的面包夹上肉饼、生菜、酱料等，形成完整的汉堡。
5. 装饰摆盘：根据快餐店的标准，将制作好的快餐进行整齐的摆盘。
注意食材的摆放顺序、装饰物的使用等，使菜品更加美观。
6. 注重卫生：在整个操作过程中，注意保持工作区域和设备的清洁卫生。
使用干净的厨具和餐具，定期清洁各种设备和工作台面，以确保客人食品安全。
快餐店的定量操作方法对于保持菜品的一致性和服务质量至关重要。
遵循标准的操作流程和配方规定，加强员工培训和质量控制，能够提升快餐店的竞争力，并赢得顾客的信任和满意度。
定量分析的基本操作
定量分析的基本操作第二章定量分析的基本操作在分析化学实验中，用到的玻璃仪器种类很多，按用途大体可分为（1）容器类，如烧杯、烧瓶、试剂瓶等，根据它们能否受热又可区分为可加热的和不宜加热的器皿；（2）量器类，如量筒、移液管、滴定管、容量瓶等；（3）其他玻璃器皿，如冷凝管、分液漏斗、干燥器、分馏柱、标准磨口玻璃仪器等，其中标准磨口玻璃仪器主要用于有机实验。
第一节常用的玻璃仪器的洗涤与烘干玻璃仪器的洗涤方法有很多，一般来说，应根据实验的要求、玻璃仪器受污染的程度以及所用的玻璃仪器的种类选择合适的方法进行洗涤。
实验中常用的烧杯、锥形瓶、量筒、量杯等一般的玻璃器皿，由于测量精度较差，可用毛刷蘸水直接刷洗，能去掉仪器上附着的尘土、可溶性的杂质和易脱落的不溶性的杂质；如果玻璃器皿上附着有机物或受污较为严重，可用毛刷蘸去污粉或合成洗涤剂刷洗，再用自来水冲洗干净，然后用蒸馏水或去离子水润洗三次，去掉自来水带来的一些无机离子。
带有精确刻度的容量器皿如滴定管、移液管、吸量管、容量瓶等，为了保证容积的准确性，不宜用刷子刷洗，应选择合适的洗液来洗涤，先用自来水冲洗后，沥干，再用洗液处理一段时间（一般放置过夜），然后用自来水清洗，最后用蒸馏水（或去离子水）冲洗3次。
具体操作如下：滴定管洗涤：选择合适的洗涤剂和洗涤方法。
一般用自来水冲洗，零刻度线以上部位可用毛刷蘸洗涤剂刷洗，零刻度线以下部位如不干净，则采用洗液洗(碱式滴定管应除去乳胶管，用乳胶头将滴定管下口堵住)。
少量的污垢可装入10mL洗液，双手平托滴定管的两端，不断转动滴定管，使洗液润洗滴定管内壁，操作时管口对准洗液瓶口，以防洗液外流。
洗完后，将洗液分别由两端放出。
如果滴定管太脏，可将洗液装满整根滴定管浸泡一段时间。
为防止洗液漏出，在滴定管下方可放一个烧杯。
最后用自来水、去离子水（或蒸馏水）洗净。
洗净后的滴定管内壁应被水均匀润湿而不挂水珠。
容量瓶的洗涤：先用自来水刷洗内壁，倒出水后，内壁如不挂水珠，即可用蒸馏水刷洗备用，否则必须用洗液洗。
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applied biosystems StepOne/StepOnePlus
荧光定量PCR仪
相对定量实验简易操作流程
SDS 2.2
StepOne/StepOnePlus定量PCR仪
相对定量实验简易操作流程
相对定量实验简易操作流程
1.双击桌面图标，或从Start > All Programs > Applied Biosystems > StepOne
Software> StepOne Software V2.2开启软件。
进入主界面后选择Advanced Setup 。
2.进入Setup下的Experiment Properties界面：
2.1输入实验名称（Experiment Name）
2.2确认仪器型号
2.3
2.3在实验类型中，选择Quantitation-Comparative C T (∆∆C T)
2.4选择试剂种类
2.5确认运行模式
3.进入Setup下的Plate Setup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：
3.1在左边界面中设置基因及样本。
利用 按钮添加新
的基因，并在Target Name中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。
对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。
也可利用其他按钮保存（Save Target）或删除（Delete Target）已添加的基因。
利用 按钮添加样本，在Sample Name中编辑样本名称。
3.2在右边 界面中进行样品板的排布。
利用鼠标单选或拖曳以选
择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U 代表未知样本，N代表阴性对照）。
3.3 在Select Relative Quantitation Settings 中（参看上图）选择对照样本及内参基因。
4. 在Setup 下的Run Method 界面，设定反应条件。
5. 如果想使用StepOnePlus 仪器上的VeriFlex TM
Block 温度梯度功能，需要先在
界面下，勾选Enable VeriFlex TM Block 选项。
此时Block 即被
分成六个区块。
（此功能仅限StepOnePlus 机型)
然后在Run Method界面中，点击想要调整的温度步骤，
在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。
两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。
6.点击，将文件存储成Experiment Document Single files (*.eds) 格式，然
后在Run界面中按下 按钮，反应即开始进行。
7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：
7.1在扩增图中（见上图），可通过更改Plot Settings来改变扩增图的显示方式。
如果
想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。
7.2查看相对表达量结果时，利用Plot Settings选项，以不同方式显示表达量的结果。
7.3对于SYBR Green法实验，可以在Melt Curve界面中查看熔解曲线。
7.4检查QC Summary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。
黄色三
角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。
详细信息及解决方案可以在Flag Details中看到。
8.分析之后的结果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。
若想存
储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Save as，存成JPEG格式的图片。