细胞培养污染图片及甲醛熏蒸(精编课件).ppt
Removed_细胞培养中污染的图片
细胞污染鉴别与图片细菌培养液是被洋葱佰克霍尔德菌污染了洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名，是医院感染病原菌之一。
洋葱伯克霍尔德菌是一种广泛存在于土壤及水中，与医院感染密切相关的革兰阴性杆菌，尤其为免疫缺陷及肺囊性纤维化患者易感染细菌之一。
它可以在无糖的培养基中生长。
在医院环境中常可污染自来水、体温表、喷雾器、静脉导管、导尿管、静脉输液管等，造成院内传播，导致多种医院感染，如败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、深部脓肿和眼结膜炎等，尤其采用导管植入进行治疗者，更容易引起感染。
洋葱伯克霍尔德菌对多种抗菌药具有天然的耐药性。
耐药现象严重，治疗可选择复方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和头孢他啶等抗菌药物。
白色念珠菌污染：（倒置）白色链球菌是常见的细胞污染革兰氏染色阳性通过革兰氏染液染色的链球菌中间长梭型的是正在分裂的念珠菌真菌感染真菌感染支原体污染电镜照片(X30k),煎蛋状和其他形状支原体污染电镜照片（X30k）支原体污染电镜照片（X12k）上面这个很明显是霉菌，确切的说应该属于丝霉，因为你可以看到明显的菌丝，有些种类是无横隔的，有的是具横隔的，培养基呈淡紫色，或不变色，但会变得粘稠。
污染来源：一般是来自实验服，并且具有季节性，像现在这种长蘑菇的季节很容易污染这种菌类。
这个是细菌污染，你在倒置显微镜下无法看到细菌的结构（需油镜），污染晚期培养基呈黄色。
污染来源：操作问题。
*这个可能是螨虫。
这个是原代培养皮肤成纤维细胞时污染的，形态呈杆状，能自主直线游动，速度相当快。
污染源：小鼠毛发中。
这个可能是酵母污染，镜下能隐约看到出芽生殖，不过不知道酵母会不会呈团聚集在一起，因为照片中那团黄色的东西也是此污染物，肉眼观察使可看到明显的白色或淡黄色颗粒状的漂浮物，同样这个污染源也是小鼠的皮肤。
细胞培养污染及排除42页PPT
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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ห้องสมุดไป่ตู้
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
细胞培养污染及排除4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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关于细胞培养中的污染
细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml 的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/mlTylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
细胞污染图片解析
白色念珠菌污染革兰氏染色阳性中间长梭型的是正在分裂的念珠菌生命经纬网友布兰卡的观点为：我个人感觉，操作之前酒精擦手消毒非常重要，因为环境再差，无菌台里一般是没问题的，但是，污染往往在这里操作时发生，因此，个人手的卫生非常重要，白色念珠菌是人体霉菌感染的常见霉菌种类（尽管我们有时感觉不到，但它就在你我的身边甚至身上存在着），我认为绝大多数污染是我们自己带进去的，因此，如果环境不是太差，那就找找自身的原因。
生命经纬网友dsh1205的观点为：灭菌水,是否有必要我也不太肯定。
其实这一点是很容易办到的，有总比没有好。
多注意一些可能的因素，对细胞总是有力的。
被污染总是很麻烦的，细胞长得不好不说，还影响实验进程。
我认为有两个环节很重要，操作台及温相。
我们操作前、后都要紫外杀菌30min，而且保持操作台通风设施正常。
我们的温相好像从来没有用酒精擦过，更没用紫外照射。
我们开温相时，先清洁剂洗手，在酒精擦手，范围与手术洗手差不多，时间一般在几秒内。
另外，我自己将瓶放回相中时，还对瓶体进行酒精擦洗。
当然还有给细胞换液也要注意了，吸管尽量不要深入瓶内，要深入瓶内的最好先在酒精灯上烧一烧等等。
HepG2细胞，荧光染色检测支原体支原体污染检测在上面的支原体检测图片里没大片的针状点，但不敢肯定个别细胞核外的小点是不是支原体，可是要有也不应该就这么几个啊？（细胞一共培养了40小时）生命经纬网友bianmin8024认为：这么大面积的污染，你可以看看是不是做这批细胞时操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
其实我觉得在每次试验前，最好简略写一下操作步骤做到心中有数。
这样可以避免实验中的忙乱。
既然现在已经污染了，就全部更换你的器皿。
培养箱的水没有必要用无菌水，但最起码要是蒸馏水。
以上图片细胞系念珠菌污染处理办法：扔掉，善后办法，养成良好的无菌操作的习惯，拿70％酒精擦手，擦超净台，擦培养瓶，擦培养基瓶，各种瓶子的口多拿火焰烧灼。
细胞培养污染图片及甲醛熏蒸
4.将容器放入空调送风口，快速倒入全量的甲醛溶液，关上空调机组门；
5.启动空调，关闭新风口，循环运行1－2小时，（视甲醛的反应速度）； 6.关闭空调，取出容器，空调及房间密闭8小时以上； 7.生产前4小时，打开空调，关闭回风阀进行空调全排风运行，直至空 调无甲醛气味后，空调按常规操作运行。（除甲醛时，可在空调送风口加 入适量的氨水，以快速中和残留甲醛） 操作中注意事项：甲醛加入高锰酸钾中，会迅速产生高温至溶液沸腾， 因此容器应大并应做好防护工作，以免混合的棕红色溶液溅出而污染机组。
培养液中可见一类黑色 小虫，生长迅速，镜下
快速运动，单个不成串
支原体污染
阳性
阴性
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变 慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变 化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
疑似黑胶虫？霉菌污染
甲醛高锰酸钾熏蒸灭菌
高锰酸钾具有强氧化性，但和福尔马林常温下反应较
用量计算： 细胞房空间=35m3 甲醛用量=10ml×35=350ml=0.35L 高锰酸钾用量=350/2=175g 温水用量=175ml
慢，但是反应放热，反应加快促进甲醛的挥发,产生甲醛 气体，甲醛能使菌体蛋白质变性凝固和溶解菌体类脂，可 以杀灭物体表面和空气中的细菌繁殖体、芽胞下真菌和病 毒,所以经一定时间后可杀死病原微生物.
甲醛加高锰酸钾熏蒸操作法：
1.准备、计算、称取甲醛与高锰酸钾量：10ml甲醛溶液中加入高锰酸钾
3－5g；
细胞培养污染图片
2010.12.6
中间长梭形是正在分裂的念珠菌
细胞培养污染图片及甲醛熏蒸
甲醛加高锰酸钾熏蒸操作法：
1.准备、计算、称取甲醛与高锰酸钾量：10ml甲醛溶液中加入高锰酸钾
3－5g；
2.取一不锈钢容器，容积大小应为甲醛量的3－4倍； 3.在容器内加入全量的高锰酸钾，用纱布或滤布将容器口蒙住；
4.将容器放入空调送风口，快速倒入全量的甲醛溶液，关上空调机组门；
5.启动空调，关闭新风口，循环运行1－2小时，（视甲醛的反应速度）； 6.关闭空调，取出容器，空调及房间密闭8小时以上； 7.生产前4小时，打开空调，关闭回风阀进行空调全排风运行，直至空 调无甲醛气味后，空调按常规操作运行。（除甲醛时，可在空调送风口加 入适量的氨水，以快速中和残留甲醛） 操作中注意事项：甲醛加入高锰酸钾中，会迅速产生高温至溶液沸腾， 因此容器应大并应做好防护工作，以免混合的棕红色溶液溅出而污染机组。
细胞培养污染图片
2010.12.6
中间长梭形是正在分裂的念珠菌
真菌污染
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒
性作用而使细胞脱落死亡。
细菌污染
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后 细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
支原体污染电镜照片（x30K），煎蛋形状
入高锰酸钾，搅拌均匀；再加入甲醛；加入甲醛后人立即离开，密闭房间。
注意顺序：是将甲醛倒入高锰酸钾溶液内。 ⑤消毒时间一般为20-30分钟。
⑥消毒后要打开门窗通风换气。 这里说的甲醛就是40%的甲醛溶液，也就是
福尔马林，一般包装上写的是37%。
甲醛及其对人体的危害ppt课件
必须饰面处理后 可允许用于室内可Biblioteka 接用于室内E2E1
饰面人造板（包括浸 气候箱法a 渍纸层压木质地板、 实木复合地板、竹地 干燥器法 板等。）
a、仲裁时采用气候箱法。 35 b、 E1为可直接用于室内的人造板， E2为必须饰面处理后允许用于室内的人造板。
第四节 人造板甲醛散发
24
• 2002年初，国家食品质量监督检验中心检测了 19种国产品牌啤酒样本的甲醛含量。结果表明， 国内啤酒的甲醛平均含量为0.31mg／L，与国 外啤酒的甲醛含量0.25mg／L无显著性差异。 假设每人每天饮用2L啤酒，以国内品牌啤酒的 甲醛平均含量计算，每人每天经口摄入甲醛为 0.62mg，加上从空气中吸入的1～1.2mg／日 （国家规定的最大容许量），仍然远低于美国 环境保护局建议的每人每日12mg／60kg体重 这个最大容许摄入量。
10
• 我国胶粘剂生产大多是人造板生产企业 自产自用，生产规模大多偏小，为保证 人造板产品的质量，盲目增加施胶量， 不但增加了成本，而且游离甲醛释放量 居高不下。结果是， 70 ％以上的企业生 产的板材甲醛释放量在 100 克板中 40 ～ 60毫克之间，有的甚至达到100毫克，远 远超过国家标准。
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第三节 甲醛释放量的限制
3.1 工作场所与室内环境中的限制 1. 工作场所最大允许的甲醛浓度 • 各国限定范围为１-３ppm。 • 例如：德国、丹麦和波兰为１ppm，英国、荷兰 和瑞典为２ppm，美国和澳大利亚为３ppm，俄 罗斯为0.5 ppm 。 • 我国《工业企业设计卫生标准》GBZ1-2002和 《工作场所有害因素职业接触限值》GBZ2-2002 规定，车间内的甲醛气体浓度不得超过0.5mg/m3。
细胞培养污染及控制PPT课件
支原体
第232页/共44页
5．培养检测
• （1）将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品 所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀。
• （2）然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养。 • （3）37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
第332页/共44页
1．使用抗生素
• 抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用 药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染 后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换 常规培养液。
第343页/共44页
• 细胞培养中污染来源主要有以下五条途 径：不洁的动物组织标本、空气、清洗消毒、操作、血
清
• 1、不洁的动物组织标本
• 很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但 由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素 洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。
第176页/共44页
3．荧光染色法观察
• （1）用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上， 在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中。
• （2）用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸甲醇固 定10min
• （3）用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst 33258 (生理盐水配制)中染色10min。
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式； 4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染； 5.研究或操作人员忽略污染问题； 6.已受污染的细胞； 7.已受污染的培养基、血清。
细胞常见污染图片与鉴别
细胞常见污染图片与鉴别
赛默飞世尔科技（中国）有限公司
ThermoFisher Scientific
图1. 洋葱佰克霍尔德菌污染洋葱佰克霍
尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，
广泛存在于土壤及水中，因引起洋葱患病而得
名，是医院感染病原菌之一。
图2. 白色念珠菌污染常见的细胞污染之一，左侧为倒置显微镜下视图，右侧为革兰氏染色图片，其中，长梭型的是处于分裂期的链珠菌
图3.链球菌革兰氏染色
图4. 真菌感染
图5. 支原体污染煎蛋状和其他形状，左侧：电镜照片(×30k)；右侧：电镜照片（×12k）
图6. 霉菌（丝霉）污染培养基呈淡紫色，或不变色，但会变得粘稠，一般是来自实验服，并且具有季节性，像现在这种长蘑菇的季节很容易污染这种菌类。
图7. 细菌污染倒置显微镜下无法看到细菌的结构（需油镜），污染晚期培养基呈黄色。
当快，源自小鼠毛发中。
源自小鼠的皮肤。
细胞培养污染简介ppt课件
3，支原体污染
3.1，支原体污染是目前实验室中最为常见的污染细胞的原核生物。 因支原体属于直径介于0.2左右的最小原核生物，形态易变，故极
易通过滤膜而逃过培养液的过滤除菌步骤。在细胞培养液中，支原体 可达到107-108CFU/mL （CFU=Colony Forming Unit，支原体浓度测量 单位）而不使培养液混浊及影响细胞生长。多种支原体对细胞不产生 任何病变效应，使得细胞污染不易被察觉。据报道，目前世界上有3050%的细胞株已受支原体污染。但是支原体对干细胞培养的影响甚大， 胚胎干细胞受支原体污染形态、生长速度等均出现改变。
超过400种细胞系已被鉴定为错认的细胞系
防止细胞交叉污染
（1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分， 最好做上标记便于辨别。并严格按顺序进行操作，避免一 起进行操作时易发生混乱。
（2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细 胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
（3）所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均 应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之，重新复苏留种细 胞进行培养。
4，内毒素污染
4.1， 细菌内毒素对培养物的危害： 实验证明，细菌内毒素对培养细胞（尤其是ES细胞）的生长及活性 具有明显的抑制作用,且该作用具有一定的时间、剂量依赖性。
4.2，细胞培养中内毒素的来源： 细胞培养基中的主要天然成份---牛血清包括胎牛血清和新生牛血 清是内毒素的潜在来源。我国2000年版《中国生物制品主要原辅料 质控标准》中对牛血清提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量， 细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支 持细胞增殖检查等等。对于胚胎干细胞培养，LIF和bFGF是细菌内 毒素的另一个潜在来源。
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中间长梭形是正在分裂的念珠菌
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真菌污染
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒 性作用而使细胞脱落死亡。
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鸡舍消毒：每立方米空间用甲醛溶液15毫升、高锰酸钾 7.5g，加7.5毫升水，密闭熏蒸消毒4-10h。
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用量计算： 细胞房空间=35m3 甲醛用量=10ml×35=350ml=0.35L 高锰酸钾用量=350/2=175g 温水用量=175ml
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细菌污染
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后 细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
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支原体污染电镜照片（x30K），煎蛋形状
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培养液中可见一类黑色 小虫，生长迅速，镜下 快速运动，单个不成串
支原体污染
阳性
阴性
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变 慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变 化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
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疑似黑胶虫？霉菌污染
Excellen熏蒸灭菌
高锰酸钾具有强氧化性，但和福尔马林常温下反应较 慢，但是反应放热，反应加快促进甲醛的挥发,产生甲醛 气体，甲醛能使菌体蛋白质变性凝固和溶解菌体类脂，可 以杀灭物体表面和空气中的细菌繁殖体、芽胞下真菌和病 毒,所以经一定时间后可杀死病原微生物.
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甲醛加高锰酸钾熏蒸操作法：
1.准备、计算、称取甲醛与高锰酸钾量：10ml甲醛溶液中加入高锰酸钾 3－5g；
2.取一不锈钢容器，容积大小应为甲醛量的3－4倍； 3.在容器内加入全量的高锰酸钾，用纱布或滤布将容器口蒙住； 4.将容器放入空调送风口，快速倒入全量的甲醛溶液，关上空调机组门； 5.启动空调，关闭新风口，循环运行1－2小时，（视甲醛的反应速度）； 6.关闭空调，取出容器，空调及房间密闭8小时以上； 7.生产前4小时，打开空调，关闭回风阀进行空调全排风运行，直至空 调无甲醛气味后，空调按常规操作运行。（除甲醛时，可在空调送风口加 入适量的氨水，以快速中和残留甲醛） 操作中注意事项：甲醛加入高锰酸钾中，会迅速产生高温至溶液沸腾， 因此容器应大并应做好防护工作，以免混合的棕红色溶液溅出而污染机组。
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高锰酸钾、甲醛熏蒸消毒
①按照甲醛（40%）10毫升／立方米、高锰酸钾5克／立方米计算用量。不同 情况下，用量有所不同，但比例为2：1。 ②盛药容器要大、耐热、耐腐蚀：一般用陶瓷或玻璃容器，因为高锰酸钾和 甲醛都具有腐蚀性，且混合后反应剧烈，释放热量。 ③房间要密闭：这样熏蒸效果才会好。 ④容器应尽量靠近门，以便操作人员迅速撤离；先将温水倒入容器内，后加 入高锰酸钾，搅拌均匀；再加入甲醛；加入甲醛后人立即离开，密闭房间。 注意顺序：是将甲醛倒入高锰酸钾溶液内。 ⑤消毒时间一般为20-30分钟。 ⑥消毒后要打开门窗通风换气。 这里说的甲醛就是40%的甲醛溶液，也就是 福尔马林，一般包装上写的是37%。