树突细胞分离步骤

合集下载

树突状细胞实验报告

一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。

2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。

3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。

二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。

DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。

本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。

三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。

2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。

四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。

（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。

（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。

2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。

（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。

（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。

3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。

（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。

五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。

2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。

3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。

（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。

树突状细胞培养方法

树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。

为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。

本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。

1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。

首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。

然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。

最后，将细胞进行培养。

2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。

目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。

添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。

3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。

常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。

可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。

4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。

因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。

一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。

5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。

为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。

可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。

6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。

可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。

7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。

为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。

总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。

小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养

小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。

无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。

参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。

即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。

2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。

3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。

4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。

5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。

6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。

树突状细胞抗原提呈过程

树突状细胞抗原提呈过程
第一步，抗原捕获。

树突状细胞通过其表面上的特异性受体，如Toll样受体（TLR）和C型凝集素受体（CLR），能够识别和捕获外源抗原。

当DC细胞
接触到病原体或其他外源抗原时，这些受体会识别并结合抗原分子，将其内部化到细胞内。

第二步，抗原处理。

捕获到的抗原分子在DC细胞内被降解成小片段，这一过程发生
在特殊的细胞器内，如内质网和溶酶体。

这些小片段被称为抗原肽，它们将在后续步骤中被呈递给T细胞。

第三步，抗原呈递。

处理后的抗原肽将与主要组织相容性复合物（MHC）分子结合，
形成MHC-抗原肽复合物。

这些复合物将被转运到树突状细胞表面，
并在那里呈递给T细胞。

第四步，T细胞激活。

当T细胞受体识别到MHC-抗原肽复合物时，T细胞将被激活并开始免疫应答。

这将引发一系列的免疫反应，包括T细胞的增殖和分化，以及其他免疫细胞的活化。

树突状细胞抗原提呈过程的完成标志着免疫系统对外源抗原的识别和应答。

这一过程的精密调控对于维持免疫系统的平衡和功能至关重要。

对树突状细胞抗原提呈过程的深入理解也为疾病的治疗和预防提供了新的思路和方法。

小鼠树突状细胞(DC)培养

7．PBS缓冲液离心洗细胞两次，均以500×g离心5分钟。
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)

树突状细胞及其前体细胞分选

03
树突状细胞及其前体细胞分选的方法
基于表面标志的分选方法
总结词
基于表面标志的分选方法是最常用的树突状细胞及其前体细胞分选方法，通过抗体与细胞表面抗原的特异性结合，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
详细描述
这种方法利用树突状细胞及其前体细胞表面特有的抗原标记，如CD11c、CD123等，通过与相应抗体结合后进行磁性分离或流式细胞仪分选。该方法具有较高的特异性和灵敏度，能够有效地分离出纯度较高的目标细胞。
02
通过分选树突状细胞及其前体细胞，可以进一步研究它们的生物学特性和功能，为免疫学研究提供更多有价值的信息。
03
树突状细胞及其前体细胞分选还有助于开发新的免疫疗法和疫苗，为人类健康和疾病治疗提供更多选择。
树突状细胞及其前体细胞分选的应用
在疫苗研发中，通过分选特定类型的树突状细胞，可以设计出更有效的疫苗，提高免疫应答的效果和持久性。
基于细胞活力的分选方法
总结词
基于细胞活力的分选方法是根据细胞活力的差异，将活力较高的树突状细胞及其前体细胞分离出来的方法。
详细描述
该方法利用不同细胞活力的特点，通过特定的染色或标记技术，将活力较高的树突状细胞及其前体细胞选择性地分离出来。该方法能够保证细胞的活性，有利于后续的实验和应用。
基于细胞大小和密度的分选方法
免疫荧光染色
利用特异性抗体对分选后的细胞进行免疫荧光染色，通过显过检测特定基因的表达水平，评估分选后细胞的纯度和功能状态。
分选结果的应用前景
疾病治疗
利用分选得到的树突状细胞及其前体细胞进行疾病治疗，如肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病治疗。
药物筛选
将分选得到的细胞用于药物筛选，以发现具有潜在治疗作用的药物分子。

pbmc分离注意事项

PBMC分离注意事项一、摘要PBMC（ Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）分离是生物医学研究中常见的实验操作之一。

PBMC包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等，在免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究中具有重要意义。

然而，在进行PBMC分离时，需要注意许多细节和操作要点，以确保实验结果的准确性和可靠性。

本文将就PBMC分离的实验准备、操作过程和后续处理等方面的注意事项进行详细讨论，旨在提高实验操作效率和实验结果质量。

二、实验准备注意事项在开始PBMC分离之前，需要进行充分的实验准备工作。

以下是一些需要注意的事项：1.血液样本的采集和处理在进行PBMC分离之前，需要采集血液样本。

采血时应注意以下几点：首先，要选择适当的采血时间，如清晨空腹采血可以提高检测结果的稳定性；其次，应选择适当的采血方式，如静脉采血或动脉采血；最后，应使用适当的抗凝剂来处理血液样本，以避免血液凝固。

在采集血液样本后，应尽快将样本送往实验室进行处理。

2.实验器材和试剂的准备在实验前，需要准备好所需的实验器材和试剂。

应选择适当的离心管、吸管、细胞筛等实验器材，并确保这些器材的清洁度和无菌状态。

此外，需要准备适当的分离介质、洗涤液、培养基等试剂，并确保这些试剂的质量和浓度符合实验要求。

三、操作过程注意事项在PBMC分离的操作过程中，应注意以下事项：1.离心速度和时间的选择离心是PBMC分离的重要步骤之一。

在选择离心速度和时间时，应根据实验要求和实际情况进行权衡。

离心速度过高或时间过长可能导致细胞损伤或失活；离心速度过低或时间过短则可能导致分离不充分。

因此，需要根据分离介质的特性和所需细胞类型进行选择和调整。

2.操作过程的无菌化处理在PBMC分离过程中，应保持操作的无菌化处理。

所有实验器材和试剂应保持清洁和无菌状态，以避免污染和交叉感染。

此外，实验操作应在无菌操作台或超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备。

bmdc细胞提取步骤

bmdc细胞提取步骤BMDC（骨髓源性树突状细胞）的提取步骤通常包括以下几个步骤：1.准备工作：a.高效细胞培养基：根据实验要求选择适合的培养基，常见的包括RPMI-1640培养基、DMEM等。

b.包含20%胎牛血清（FBS）的细胞培养基。

c.手术器械：包括手术刀、剪刀、镊子和注射器等。

d.消化酶：常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。

e.细胞培养条件：包括恒温恒湿的细胞培养箱以及含5%CO2的细胞培养箱。

2.动物准备：a.选择符合实验要求的动物（常用小鼠）。

b.按照实验室动物管理规定进行麻醉和安乐死操作。

c.用70%乙醇对动物表面进行消毒。

3.BMDC提取：a.彻底消毒动物表面后，在操作实验纸上将动物放置在耳板的背面。

b.使用消毒的剪刀和镊子，从动物的骨髓中提取骨骼。

c.将提取的骨骼置于含有培养基的试管中，并用注射器吸入10mL的培养基，将髓腔彻底清洁。

d.将清洗后的骨骼放在含有培养基的培养皿中，在恒温恒湿的培养箱中孵育24小时。

4.BMDC筛选和分离：a.24小时后，将培养皿中的骨骼取出，用胰蛋白酶和胶原酶进行胶原酶消化处理。

b.消化结束后，用细胞培养基将胶原酶停止消化，并通过筛选筛除未消化的骨骼颗粒。

c.将筛选后的纯化细胞放入含有培养基的96孔培养板中，每孔种植一定数量的细胞。

d.将种植后的培养板放入恒温恒湿的培养箱中进行细胞培养和观察。

5.细胞培养和扩增：a.用培养基进行细胞培养，每2-3天更换一次培养基。

b.确保培养皿内有适当的氧气和营养物质。

c.观察细胞的生长情况，密度达到一定程度后，用胰蛋白酶进行细胞裂解。

d.细胞数目达到要求后，用所需的方式进行实验或培养。

BMDC的提取过程需要严格的操作和分离步骤，确保获取纯化的树突状细胞，这对进一步的实验研究是非常重要的。

小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定

ＢＬ／小鼠肺组织经ＩＡＢｃ型胶原酶消化、密度梯度离心、Ｄｌ免疫磁珠分选纯化Ｄｓ流式细胞术鉴定分选ＤｓＣ１ｃＣ，Ｃ纯度，倒置相差显微镜观察孵育细胞生长状态，扫描电镜和透射电镜观察ＤｓＣ超微形态，流式细胞术检测肺间质ＤｓＣ１ｃＣ１ｂＣ８Ｃ的Ｄｌ、Ｄｌ、Ｄ６和Ｉ表型。结果：一分选获得的肺问质ＤｓＣ经鉴定，纯度为９．９ ±５６％，ＲＭＩ４培养基中生长状态良好，２５％．２在Ｐ１０６少数细胞形成小细胞集落。ＤｓＣ超微形态观察显示细胞表面多见长１ａ集的树枝状突起，胞器不发达，～２ｂ密ｍ细细胞核形不规则。９％以上肺间质ＤｓｏＣ为未成熟状态或前体Ｄｓ低表达成熟标志物ＩｂＣ８，Ｃ，．和Ｄ６并具有异质性，４％起源于髓系细胞分化。Ａ近０
中国免疫学杂志２１年第１０ —８Ｘ．０１０．１ｏ：０３６／．ｓ．００４４２１．９０２ｓ
・
免疫学技术与方法・
小鼠肺间质树突状细胞的分离、纯化与鉴定①
王宏伟陆江阳田光② 刘茜赵敏杨毅康佳蕊
（解放军总医院第一附属（０）３４医院病理科，京１０４）北００８
中国图书分类号Ｒ６．３４７文献标识码Ａ文章编号１０．８Ｘ（０１０．８４０００４４２１）９０１．５
［摘
要］目的：建立肺间质树突状细胞（Ｃ）Ｄｓ的分离与纯化方法，为肺间质ＤｓＣ的相关研究提供实验基础。方法：性雄

大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定

ｃｌｒｄＤｓｘｒｓｅＸ２（ｅｒｅｔＣ）ｎｏｔａｕｅＤｓｘｒｓｅａｏｉ００ｐｔｉｔｕｔｅＣｐｅｓｄ０６ｔｋｒｆａＤｓ，ａｄｍｓｍｔｒＣｐｅｓｄｍｊｒｓｃｍａｉｌｙｕｅｈｍａｏｒｅｈｔｂｉ
髓细胞诱导ＤＣ及其培养、纯化的方法，为下一步的研究提供基础．
Ｈｏｐｔｕｍｉｇｕｍｎｕｎ５０，ＣｉａｓｉｌＫｎｎ，ＫｎｉｇＹｎａ６０１ａｏｆｎ１ｈｎ）
［ｂａｔＯｂｅｔｅＴｘｌｒｔｏｓｆｓｌｉ，ｃｌｒｇａｄｉｅｔｉｔｇｏａｂｎＡｓｃ］ｒｊｃｉｏｅｐｏｅｍｅｄｏｉａｎｖｈｒｏｔｇｕｔｉｎｄｎｉｃｉｆｒｔｏｅｕｎｆａｎ
ＺＨＡＮＧＳｅｇ— ｎｎ ”，Ｌｉ，ＲＡＮＪａｇ—ｈａ”，ＳｈｎｉｇＩＬｉｎｕＨＡＯＪｎｃｕ，Ｌｈｉ－ｈｎａＩｕ”，ＬＵＪｎ ’ ＺＩｉｇ‘
（）Ｄｐ．ｆＮ．ｐｔｂｌｒａｃｅｔｕｇｒ；２）Ｄｐ．ｆＴｓｎａｏａｏ，Ｔｅ１ｔｅｐｅｓ１ｅｔｏｏＨｅａｉａｙＰｎｒａｃＳｒｅｙｏｉｉｅｔｏｅｔｇＬｂｒｒｉｔｙｈｓＰｏｌ’
［键词］大鼠；树突状细胞；骨髓关
［中图分类号］Ｒ９．［３２１文献标识码］Ａ［文章编号］１０ — ７６（０８２— ０１４０３４０２０）００４ —０
Ｉｏｌｉｓａｔｏｎ，ＣｕｌｕｒｎｄｄｅｉｃｔｏｎｔＢｏｎｅｔｅａＩｎｔｆａｉｉｏｆＲａＭａｒｗ．ｒｖｅｄｅｒｏ．．ｄｅｉＤｎｄｒｔｃＣｅｌｉｉｌｓ

树突状细胞及其前体细胞分选(1)

树突状细胞及其前体细胞分选(1)树突状细胞是免疫系统中重要的细胞类型，扮演着非常重要的角色。

它们负责识别和捕获病原体，并引导其他细胞产生免疫应答。

这些细胞的前体细胞可以从骨髓中分选出来，这是一项非常重要的步骤。

下面，本文将介绍关于树突状细胞及其前体细胞分选的相关内容。

一、树突状细胞的作用树突状细胞是适应性免疫系统中最重要的细胞类型之一。

它们能够捕获病原体的抗原，并将其通过MHC分子展示给其他免疫细胞，如T细胞和B细胞。

这种过程被称为抗原递呈。

通过这种方式，树突状细胞帮助其他免疫细胞识别和打击感染。

此外，树突状细胞还可以产生细胞因子和化学信使，调节其他细胞的行为。

二、树突状细胞的前体细胞树突状细胞是从骨髓中的前体细胞分化而来。

这些前体细胞受到多种细胞因子的调节，逐步分化为成熟的树突状细胞。

在骨髓中，前体细胞会经历数轮分裂和分化，形成多个分化阶段。

其中，CD34阳性的前体细胞被认为是树突状细胞的主要前体。

三、树突状细胞的分选方法分选是从组合细胞群中精选出所需细胞的一种方法。

对于树突状细胞及其前体细胞的分选，有多种方法可供选择。

其中，流式细胞术和磁珠分选是最常用的两种方法。

1.流式细胞术流式细胞术是利用细胞表面不同的标记物质将细胞精确地分离出来的一种方法。

对于树突状细胞及其前体细胞的分选，常用的标记物质有CD11c、CD123、CD1c等。

流式细胞术具有高精度、高通量等优点，但也有一些局限性，比如需要专业的设备和经验丰富的技术人员。

2.磁珠分选磁珠分选是利用特定抗体包裹在磁颗粒上，与目标细胞表面的抗原结合，并将其分离出来的方法。

对于树突状细胞及其前体细胞的分选，常用的抗体有CD11c、CD14等。

磁珠分选具有操作简便、纯度高等优点，但会受到样品数量、鉴别细胞表面标记物等因素的影响。

总结：树突状细胞及其前体细胞的分选是研究免疫系统中该细胞类型功能的关键步骤。

流式细胞术和磁珠分选是常用的两种方法。

掌握这些技术方法对于研究树突状细胞及其前体细胞的生物学功能具有重要的意义。

树突状细胞的鉴定

一、流式细胞仪分离法【原理】根据待分离的免疫细胞膜表面抗原的不同，制备出相应的荧光标记抗体，分离前，首先将待分离细胞制成单细胞悬液，经相应的荧光标记抗体染色后，进入流式细胞仪。

此细胞仪以激光为光源，通过高速流动系统将样品中的细胞排列成行，一个一个地从流动室喷嘴处流出，形成细胞液柱。

液柱与高速聚焦的激光束垂直相交，细胞受到激光激发后产生散射光并发射荧光，由光电倍增管接收光信号并转化成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨出细胞的类型，并对各类型分别计数和统计。

同时，细胞根据其表面的电荷使液滴瞬间感应相应的带电性，然后在电场的偏转作用下进入不同的收集管，从而将各种免疫细胞分离。

用FACS(流式细胞仪)分离细胞准确快速，分选纯度高（为99%），不损伤细胞活性，可在无菌条件下进行，并可直接统计出各类细胞的相对含量。

【器材与试剂】1.抗CD11c、CD83的单克隆抗体。

2.FITC—羊抗鼠IgG。

3.正常小鼠IgG 。

4.细胞洗涤液(NaCl 8.47g，K2HPO4 4.11g，KH2PO4 1.36g，NaN3 0.1g，20ml，加蒸馏水至1000m1)。

5.红细胞裂解液(KHCO3 1.0g，NH4C1 8.3g，EDTA 37mg，加蒸馏水至100ml)。

6.固定液(25％戊二醛3.2ml，葡萄糖2.0g，加无血清上述细胞洗涤液至100m1)。

7.肝素抗凝血。

8.离心机、流式细胞仪等。

【方法】1.取肝素抗凝血0．4ml，分别加入4支小试管中（其中3支为待测管，1支为对照管）各0.1ml。

然后在各待测管中分别加入0.1ml抗CD11c、CD83的单克隆抗体(1：1000稀释)，对照组加入.正常小鼠IgG ，30℃孵育45min。

2.加入细胞洗涤液3ml，1000r／min，离心2min。

以洗去未结合的抗体，重复洗2次。

3.摇匀管底沉淀细胞。

加入0.1ml FITC-羊抗鼠IgG，30℃孵育45min。

4.加入红细胞裂解液3ml，见红细胞悬液变为真溶液时，立即以1000r／min离心2min。

dc细胞培养方法

dc细胞培养方法（原创版3篇）《dc细胞培养方法》篇1DC 细胞（树突状细胞）是一种重要的免疫细胞，在机体内发挥着呈递抗原和启动免疫应答的重要作用。

然而，由于DC 细胞在体内分布散，含量少，分离和扩增具有一定的难度。

因此，体外扩增和培养DC 细胞成为了研究和应用的必经之路。

DC 细胞的培养方法通常包括以下步骤：1. 获取原始DC 细胞：可以从外周血、骨髓、脾脏等组织中分离获取DC 细胞。

常用的方法是使用抗CD14 和抗CD3 的磁珠负选，然后再使用抗CD11c 和抗CD19 的抗体阳性选择，从而得到纯化的DC 细胞。

2. 细胞培养：将分离得到的DC 细胞接种到培养皿中，加入适量的完全培养基（如RPMI-1640、DMEM 等）和细胞因子（如IL-4、IL-12、GM-CSF 等），然后在37℃的培养箱中培养。

通常情况下，DC 细胞在体外可以持续培养数天至数十天，但需要注意定期更换培养液和检查细胞生长状态。

3. 细胞分化：在培养过程中，DC 细胞会逐渐分化为成熟的DC 细胞。

为了评估DC 细胞的分化程度，可以使用流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达情况，如CD11c、CD19、CD80、CD86 等。

4. 细胞扩增：在培养过程中，可以通过加入细胞因子、激素、细胞激活剂等物质来促进DC 细胞的扩增。

此外，也可以使用体外扩增技术，如流式细胞术、激光激活细胞扩增技术等来增加DC 细胞的数量。

《dc细胞培养方法》篇2DC 细胞（树突状细胞）是一种重要的免疫细胞，在机体内发挥着呈递抗原和启动免疫应答的重要作用。

然而，由于DC 细胞在体内分布散，含量少，且从体内分离费时费力，得到的数量也很少，因此体外扩增成为研究和应用的必经之路。

DC 细胞的培养方法通常包括以下步骤：1. 获取原始材料：可以从外周血、骨髓、脐带血等来源中获取DC 细胞。

2. 细胞分离：通过密度梯度离心、免疫磁性分选等方法，从混合细胞中分离出DC 细胞。

树突状细胞培养方法

2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。

2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。

RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。

3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。

4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。

5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。

6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。

7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。

8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。

9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。

10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。

11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。

收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。

加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。

Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。

送第四军医大学流式细胞室上机检测。

树突状细胞及其前体细胞分选(一)

树突状细胞及其前体细胞分选(一)树突状细胞（DC）是一类免疫细胞，能够识别外来抗原并引发免疫反应，是免疫系统中极为重要的细胞类型之一。

DC分为两类：专职的树突状细胞和未成熟的树突状细胞。

后者又被称为树突状细胞前体细胞。

DC的分选方法DC的分选主要有FACS和MACS两种，其中FACS是一种流式细胞术，是通过对单个细胞进行快速分析而获得的信息来实现分选的。

而MACS则是一种磁性负选技术，通过对细胞进行表面标记，然后利用磁力将要孔洞筛选的细胞排除，从而达到分选效果。

DC的分选应用DC分选技术可以广泛应用于免疫治疗、疫苗开发、细胞治疗、抗肿瘤免疫疗法等领域。

以疫苗开发为例，目前世界上许多疫苗都是利用DC分选技术进行制备的，自体DC疫苗用于治疗肿瘤和感染性疾病等方面也有广泛的应用。

DC的前体细胞的分选DC的前体细胞是指未成熟的树突状细胞，也是其诱导免疫反应的先导因素。

因此，研究DC前体细胞和分选技术显得尤为重要。

最近，一项新的研究表明，DC前体细胞可以通过将白细胞留置法与FACS相结合的方式进行分选。

在这种分选方式下，首先将外周血单个核细胞分离出来，随后使用FITC标记抗体对前体细胞进行表面标记，再使用CD14和CD15标记前体细胞，最后使用FACS将细胞进行流式分选。

结果证明，这种方法分选的前体细胞对于获得免疫治疗的成功非常关键。

总之， DC是人体免疫系统中不可或缺的细胞类型之一，DC的分选技术是研究DC的前提和基础，也是免疫治疗、疫苗开发和细胞治疗等领域不可或缺的技术手段。

因此，我们需要进一步深入研究DC及其前体细胞的分选机制，以更好地应用于临床实践。

树突状细胞及其前体细胞分选-V1

树突状细胞及其前体细胞分选-V1正文：树突状细胞是一类具有免疫功能的细胞，主要分布在淋巴组织和周围组织中。

近年来，研究人员深入探究树突状细胞在疾病诊断和治疗上的作用，发现分选树突状细胞及其前体细胞是实现这一目标的关键。

一、树突状细胞及其前体细胞的分选技术树突状细胞的分选技术有多种，包括磁珠分选法、荧光激活细胞分选法、流式细胞术等。

其中，磁珠分选法和荧光激活细胞分选法是最常用的方法。

但是，这些技术仍然存在一些问题，如低细胞产率、样本污染等。

针对以上问题，研究人员提出了新的树突状细胞分选技术。

该技术利用细胞表面标志物的特异性结合，选择性地分选出树突状细胞及其前体细胞，使得分选效率和细胞纯度大幅提高。

二、分选树突状细胞及其前体细胞的意义分选树突状细胞及其前体细胞对于研究人员而言具有重要的意义。

首先，分选出纯度高、细胞活性好的树突状细胞，可为检测、诊断、治疗和预防某些疾病提供更加可靠的实验依据。

其次，树突状细胞的前体细胞是一类极具潜力的细胞，可通过分选技术得到，进一步培养为树突状细胞，作为治疗癌症等疾病的新型治疗手段。

最后，树突状细胞及其前体细胞的分选技术对进一步探究人类免疫系统的生物学特性和机制具有重要意义。

三、树突状细胞及其前体细胞在疾病诊疗中的应用1、疫苗研制树突状细胞可用于疫苗的研制。

在病原体感染后，树突状细胞可识别病原体并进一步激活人类免疫系统，诱发人体产生特异性免疫应答，使人体产生抗体，从而防止疾病的发生。

2、免疫治疗树突状细胞可用于治疗某些疾病。

通过将病人的树突状细胞或其前体细胞分选出来，进一步培养并激活，再注射到病人体内，可刺激机体产生免疫应答，有助于治疗癌症等疾病。

3、临床检测树突状细胞可用于临床检测。

通过检测树突状细胞数量和功能状态等指标，可以了解免疫系统是否正常，从而为临床诊疗提供指导。

四、结语总之，分选树突状细胞及其前体细胞是研究人员深入探究树突状细胞在疾病诊断和治疗上的关键步骤。

小鼠dc细胞提取原理

小鼠dc细胞提取原理小鼠DC细胞提取是一种常用的实验技术，用于研究小鼠的树突状细胞（Dendritic Cell，简称为DC细胞）。

DC细胞是免疫系统中重要的抗原呈现细胞，具有调节和激活免疫反应的功能。

以下是小鼠DC细胞提取的原理和步骤。

1. 小鼠准备：选择适合的小鼠品系，根据需要的DC细胞类型进行选择。

小鼠可以通过麻醉和牺牲来收集组织。

2. 组织切割：使用无菌器械将收集的小鼠组织切割成小块，并将其转移到称重器皿中，以便进一步分类和处理。

3. 组织消化：将组织块置于含有适当酶解酶的消化液中（如胰蛋白酶），并在37摄氏度的恒温搅拌条件下进行消化。

消化时间根据组织类型和实验需求而定。

4. 细胞分离：经过适当的消化时间后，将消化液过筛或过滤，并使用无菌操作将细胞转移到离心管中。

离心操作可分离细胞悬浮液和残留的组织碎片。

5. 密度梯度离心：为了分离出DC细胞，可以将细胞悬浮液进行密度梯度离心，以分离不同细胞类型。

常用的密度梯度离心介质有离心液（如Ficoll）。

6. DC细胞纯化：通过离心梯度离心后，可以通过其他细胞纯化方法（如磁分选或流式细胞术）进一步纯化DC细胞，以获得更纯的细胞群体。

7. DC细胞检测：通过染色或使用特定的抗体标记方法，可以对提取的DC细胞进行检测和鉴定。

这可以包括对DC细胞特异标志物的检测，如CD11c、CD11b、CD80和CD86等。

小鼠DC细胞提取原理涉及多个步骤，从选择小鼠到最后的细胞检测，每一步都至关重要。

正确操作和技术的运用将有助于获得高质量、纯净的小鼠DC细胞用于后续的实验研究。

小鼠树突状细胞流式标记

小鼠树突状细胞流式标记1. 简介树突状细胞是免疫系统中重要的抗原呈递细胞，它们在识别和激活免疫应答中起着关键作用。

为了深入了解树突状细胞的功能和特性，科学家们经常使用流式标记技术对其进行分析和表征。

小鼠树突状细胞是常用的模型生物，在许多免疫学实验中被广泛应用。

本文将介绍小鼠树突状细胞流式标记的原理、实验步骤以及一些常用的标记方法。

2. 原理流式标记技术基于荧光染料与目标细胞表面特定抗原间的高亲和性结合。

通过选择合适的荧光染料和抗体，可以将目标细胞（如小鼠树突状细胞）与其他非目标细胞进行区分。

常见的流式标记方法包括直接染色和间接染色。

直接染色使用已与荧光染料偶联的抗体直接与目标细胞结合，而间接染色则先使用与目标细胞特异性抗体结合，再加入荧光染料偶联的二抗。

3. 实验步骤以下是小鼠树突状细胞流式标记的一般实验步骤：步骤一：细胞准备1.小鼠树突状细胞可以从小鼠脾脏或淋巴结中分离得到。

使用适当的方法（如机械分散、酶消化等）将组织转化为单细胞悬液。

2.使用离心技术将单细胞悬液离心沉淀，去除上清液并洗涤细胞。

步骤二：表面标记1.将准备好的小鼠树突状细胞悬液分装至不同的试管中。

2.根据实验设计和需要选择合适的荧光染料和抗体。

将染料和抗体加入到试管中，并充分混匀。

3.在室温条件下孵育试管中的细胞和染料/抗体混合物，通常需要15-30分钟。

4.洗涤标记后的细胞，以去除未结合的染料和抗体。

步骤三：流式细胞仪分析1.将洗涤后的标记细胞悬浮液转移到流式细胞仪样本管中。

2.使用流式细胞仪设置合适的参数，如激发波长、荧光信号收集通道等。

3.运行流式细胞仪进行数据采集和分析。

4. 常用的标记方法以下是一些常用的小鼠树突状细胞流式标记方法：•CD11c标记：CD11c是树突状细胞表面上的一个抗原。

通过使用与CD11c特异性抗体结合的荧光染料，可以识别和定量树突状细胞。

•MHC-II标记：MHC-II是树突状细胞表面上的另一个重要抗原。

利用白细胞层制备树突细胞

组和胎牛血清组。将同一来源的ＰＭＮ以２×ｌ６ｍＢＣＯ／ｌ浓度接种于２个８ｌ０ｎｎ细胞培养皿中，７ ℃ 、积分数为５的／３体％Ｃ２饱和湿度的条件下培养１ｈ去除悬浮细胞，冷的０及，预ＲＭ６０洗涤２次，下贴壁的单核细胞。１培养皿加入ＰＩ１４剩个含有ＧＣＦＩ广（浓度分别为８０Ｕｍｌ５０ＵＩ）含Ｍ－Ｓ、Ｌ４终０／和０／ｌ和Ｉ１体积分数为２的自体血清的完全培养液培养３ｄ后，加％添ＧＣＦ和Ｉ广续培养３ｄ后收获悬浮细胞；一培养皿使Ｍ．ＳＬ４继另
自１９９６年Ｈｕ等首次报道用肿瘤抗原肽冲击的树突ｓ细胞（ｅｄｉｃｃｌ，Ｃ治疗Ｂ细胞淋巴瘤并获得成功后，ＣＤｎｒｅＤ）ｉｔｌＤ
在抗肿瘤治疗方面的应用前景得到了广泛关注。相关的临床治疗方案涉及多系统恶性肿瘤，如淋巴瘤、白血病、色素黑瘤、列腺癌、前肾肿瘤等，些方案已进入 Ⅱ期临床试验。我有们利用从献血员所获得的血液资源，重从可满足临床需求着的数量（量制备）大和质量（床应用级）临两个方面对ＤＣ的制备方案进行探索。旨在开发出一种新型的血液细胞治疗制

猪肠黏膜PP结中树突状细胞的分离与鉴定

猪肠黏膜PP结中树突状细胞的分离与鉴定袁晨;张恩;王佳璐;黄璐璐;杨倩【期刊名称】《南京农业大学学报》【年(卷),期】2018(41)6【摘要】[目的]本试验旨在建立体外分离猪肠黏膜派尔集合淋巴结(Peyer's patch,PP)中树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法。

[方法]应用密度梯度离心的方法获得单个核细胞,然后分别采用免疫磁珠法、流式细胞术根据细胞表面标志MHC-Ⅱ和SWC3a分选猪肠黏膜PP结DC,并进行DC形态学和免疫学性质鉴定。

[结果]磁珠分选(magnetic cell sorting,MACS)富集SWC3a+细胞纯度达90.2%,而SWC3a+/MHC-Ⅱ+细胞纯度达50.5%。

流式细胞术分选猪肠黏膜PP结中SWC3a+/MHC-Ⅱ+DC纯度高达95.6%,将该DC培养2 d后,细胞有聚集现象,细胞表面不规则,略有突起,具有刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。

[结论]成功建立了体外分离猪肠黏膜PP结中DC的方法,分离到的DC具有体内DC的生物学特性,为进一步研究猪肠黏膜PP结中DC的功能奠定了基础。

【总页数】6页(P1107-1112)【关键词】猪;肠黏膜;派尔集合淋巴结(PP结);树突状细胞【作者】袁晨;张恩;王佳璐;黄璐璐;杨倩【作者单位】南京农业大学动物医学院【正文语种】中文【中图分类】S852.4【相关文献】1.獭兔肠黏膜乳杆菌的分离鉴定及其体外益生特性研究 [J], 李晶;沈雪梅;刘丽慧;胡如久;崔宏晓;姚军虎;徐秀容2.动物微生态制剂菌种的分离与鉴定--猪肠源乳杆菌的分离与鉴定 [J], 孟军;黄丽红;刘淑英;刘莉3.大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜差异表达蛋白质组的分离与鉴定 [J], 李云胜;刘克玄;刘家欣;李毅;黄文起4.武定鸡肠黏膜乳酸菌的分离鉴定及应用 [J], 郑锦玲;陈媛;李云蓉;彭洁;李石友;李文贵;柴俊;卢志远;张以芳5.动物微生态制剂猪肠源肠球菌的分离与鉴定 [J], 孟军;刘淑英;黄丽红;王东平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。