高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究

高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【摘要】[目的]为了筛选出一株高产漆酶的菌株.[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株,结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定,研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果.[结果]该菌株属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.CLb.菌株CLb最适生长温度为37 ℃,最适生长pH为7.0,菌株能在含1 mmol/L Cu2+的培养基中生长,具有很强的耐铜性.以丁香醛连氮为底物,测定其芽孢漆酶活性,漆酶活性高达46.1 U/g干重.菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0.在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中,菌株CLb芽孢漆酶在4h内对活性黑以及在2h内对靛红的脱色率均达到93.0％,在6h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79.0％和92.5％.[结论]菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】4页(P1614-1616,1654)【关键词】细菌漆酶;芽孢杆菌属;染料脱色【作者】李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾【作者单位】东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江省实验中学,黑龙江哈尔滨150001;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】S188漆酶(EC 1.10.3.2，p-diphenol:dioxygen oxidoreductases)是一种含铜的多酚氧化酶，能够利用分子氧氧化各种芳香族和非芳香族化合物，同时完成多种底物的单电子转移，分子氧被还原为水［1］。

漆酶参与生物合成和木质素降解。

白腐菌漆酶对木质素的降解效果较好［2］。

因此，真菌漆酶应用于木质素和纤维材料的修饰及去木质素方面有较好的前景。

漆酶作用的底物范围很广，可应用于工业废水脱毒、纸浆造纸、纺织业和石化工业以及作为生物修复剂清理除草剂和杀虫剂［3］。

20世纪以前，对漆酶的研究主要集中在真菌漆酶［2］，对原核生物中漆酶的研究少有报道。

Alexandre等［4］根据分子数据分析，提出漆酶基因可能广泛存在于细菌中。

自1983年首次发现原核生物生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)具有漆酶活性［5］，随后陆续有报道证实海单胞菌(Marinomonas mediterranea)［6］、大肠杆菌(Escherichia coli)［7］、黄色链霉菌(Streptomyces galbus)［8］以及天蓝色链霉菌(S.coelicolor)［9］等菌株具有漆酶活性。

虽然大多数细菌漆酶与真菌漆酶相比产量少且氧化还原电位较低，但是细菌漆酶具有不需糖基化，具有较好的热稳定性和pH范围广泛等优点［10］，使得细菌漆酶比真菌漆酶更适合基因操作和构建重组酶［11］。

细菌生长繁殖速度较快，研究周期较短，使得高产漆酶菌株的筛选以及分离鉴定具有高效性。

笔者从东北林业大学实验林场樟子松林的土壤中采集样品，利用含铜的富集培养基筛选出一株高产漆酶的细菌菌株CLb，通过形态学、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，将菌株CLb初步鉴定为芽孢杆菌属，并对菌株的生物学特性及其对染料的脱色效果进行研究，为细菌漆酶应用于染料脱色提供理论基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土壤样品。

取自东北林业大学实验林场樟子松林下土壤。

1.1.2 培养基。

5×M9盐溶液:Na2HPO7·H2O 64 g/L，KH2PO415 g/L，NaCl2.5 g/L，NH4Cl 5 g/L;M9 培养基:20%葡萄糖20 ml/L，5×M9盐溶液200ml/L;富集培养基:CuSO4·5H2O 0.05 g，M9培养基1 000 ml;LB培养基:胰蛋白胨(Tryptone)10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 17 g/L，pH 7.0。

1.2 方法1.2.1 高产漆酶菌株的筛选及分离纯化。

称量采自东北林业大学实验林场樟子松林的土壤样品10 g，将土样加入于120 ml M9培养基，振荡混匀，150 r/min，37℃培养2 d，继代培养2次，将培养液适当稀释后涂布于含0.2 mmol/L Cu2+的LB 平板上，37℃培养3 d。

用浓度0.1%丁香醛连氮(无水乙醇溶解)溶液对上述平板菌落进行鉴定。

挑取对丁香醛连氮显现粉红色的单菌落划线于含0.4 mmol/LCu2+的LB培养基上，重复操作3次，得到产漆酶细菌的单克隆，选取显色最深的菌株进行研究。

1.2.2 菌株CLb的形态学及生理生化特性测定。

对菌株CLb进行革兰氏染色，测定糖类发酵、淀粉分解等生理生化特性［12］。

1.2.3 菌株CLb的16S rDNA序列分析。

以CTAB法提取的菌株CLb的总DNA为模板，以16S rDNA通用引物27F:5＇-agagtttgatcctggctcag-3＇和 1492R:5＇-ggttaccttgttacgactt-3＇扩增菌株CLb的16S rDNA。

反应体系为:ddH2O 22μl，10 × Ex buf fer缓冲液3 μl，dNTP 2 μl，引物 27F 和 1492R 各1 μl，模板DNA1 μl，Taq 聚合酶0.2 μl。

反应条件为:94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃变性18 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸78 s，循环30次，72℃终延伸7 min，4℃保存。

以小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，将胶回收产物与pMD18-T连接，将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，37℃培养过夜。

将用菌落PCR鉴定为阳性的转化子，送北京英骏生物工程有限公司测序。

1.2.4 构建菌株CLb的系统发育树。

将测定的结果在NCBI的BLAST上搜索比对，利用Clustal软件进行多序列比对，用Phylip-3.69软件中的最大简约法构建该菌株的系统发育树。

1.2.5 菌株CLb的生物学特性研究。

对菌株CLb的生长曲线、最适生长温度、最适生长pH、耐盐性以及Cu2+抗性等5个方面进行研究。

1.2.6 芽孢漆酶液的制备。

将菌株 CLb接种于含0.2 mmol/L Cu2+的LB固体培养基中，37℃倒置培养5 d。

粗酶液的制备方法参照文献［13］。

1.2.7 芽孢漆酶活性的测定。

0.2 mol/L磷酸氢二钠－0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 7.0)、0.5 mol/L丁香醛连氮及一定量的芽孢粗酶液在37℃反应3 min，用分光光度计测定525 nm处的吸光值，重复3次，取平均值。

一个酶活单位定义为1min内氧化1 μmol底物所需的酶量。

1.2.8 菌株CLb芽孢漆酶对染料脱色的研究。

取一定体积的粗酶液于80℃烘箱中烘至恒重，计算粗酶液中芽孢的浓度(mg/ml)。

染料脱色体系包括染料、芽孢漆酶液(终浓度为1 mg/ml)以及0.2 mol/L磷酸氢二钠－0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 7.0)，其中活性亮蓝RBBR、活性黑、靛红以及结晶紫的终浓度分别为100、40、25、5 mg/L，最大吸收波长分别为591、597、610以及583 nm。

40 ℃，160 r/min脱色，定时取样，14 000 r/min离心1 min后用分光度计测定各种染料在最大吸收波长处的吸光值。

每种染料体系重复3次，取平均值。

同时，设不加粗酶液的空白对照体系。

式中，A0为初始染料吸光值;A为定期取样测的吸光值。

2 结果与分析2.1 菌株CLb筛选及其生理生化特性从筛选的菌株中选取对丁香醛连氮显红色最深的一株细菌CLb进行研究。

菌株CLb的革兰氏染色结果为蓝紫色，是革兰氏阳性细菌，细胞大小为(1 μm ～2 μm)× (5 μm ～7 μm)，短杆状，有芽孢，具有侧鞭毛和荚膜;在LB固体培养基上，37℃培养24 h，菌落乳白色、扁平、呈圆形，菌落表面干燥、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。

菌株CLb V-P试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，丙二酸盐试验呈阳性。

芽孢杆菌CLb可利用麦芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、密二糖和乳糖。

芽孢杆菌CLb含明胶液化酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶和尿素酶。

2.2 菌株CLb的16S rDNA序列分析菌株CLb的16S rDNA经测序为1 514 bp。

利用Clustal软件多序列比对，用Phyilp构建系统发育树(图1)。

在NCBI上用BLAST软件比对，它与韦氏芽孢杆菌的相似度为94%。

结合形态学观察、生理生化特性以及16S rDNA同源性分析比对，确定该菌株属于芽孢杆菌属，定名为Bacillus sp.CLb。

图1 根据16S rDNA序列分析和最大简约法构建的系统发育树2.3 菌株CLb的生长特性根据所测OD600数值，显示出菌株CLb在1～3 h之间生长缓慢;5～15 h进入对数生长期;25 h后进入稳定期。

由图2可知，菌株CLb 的最适生长温度为37℃，25～42℃时该菌株均能生长，但50℃下菌株几乎不能生长。

由图3可知，菌株CLb的最适生长pH为7，pH 5～9菌株CLb生长良好，但是pH为4和11时菌株几乎不能存活。

由图4可知，菌株CLb的耐盐性良好，菌株CLb能在NaCl浓度为1% ～5%的范围内生长良好，NaCl浓度高于7%时菌株CLb生长缓慢。

由图5可知，菌株CLb对Cu2+的抗性比较强。

当培养基中Cu2+浓度为0～0.6 mmol/L时，对菌株CLb生长基本无影响，当Cu2+浓度为0.8～1.5 mmol/L时，其生长速度逐渐减慢。

该菌株为耐铜离子的细菌。

利用这一特性，可以提高对其富集和筛选的效率。

2.4 菌株CLb芽孢漆酶对染料脱色的结果由图6可知，在不含介体的脱色体系中，菌株CLb的芽孢粗酶液只能对结晶紫进行脱色，6 h内脱色率为90%，对其他3种染料均不脱色。

在脱色体系中加入介体乙酰丁香酮(Ace)后，缓冲液pH为7的条件下，菌株CLb芽孢漆酶在4 h内对活性黑以及在2 h内对靛红的脱色率均达到93%，在6 h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79%和92.5%。

当缓冲液pH为9时，菌株CLb芽孢漆酶同样能降解活性黑、靛红和结晶紫，其芽孢漆酶在4 h之内能完成脱色，脱色率分别为81.0%、85.3%和 93.5%。