高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究

高产漆酶菌株Bacillus sp.CLb的筛选及其对染料脱色效果的

研究

李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾

【摘要】[目的]为了筛选出一株高产漆酶的菌株.[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株,结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定,研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果.[结果]该菌株属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus sp.CLb.菌株CLb最适生长温度为37 ℃,最适生长pH为7.0,菌株能在含1 mmol/L Cu2+的培养基中生长,具有很强的耐铜性.以丁香醛连氮为底物,测定其芽孢漆酶活性,漆酶活性高达46.1 U/g干重.菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0.在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中,菌株CLb芽孢漆酶在4h内对活性黑以及在2h内对靛红的脱色率均达到93.0％,在6h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为79.0％和92.5％.[结论]菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率.【期刊名称】《安徽农业科学》

【年(卷),期】2014(000)006

【总页数】4页(P1614-1616,1654)

【关键词】细菌漆酶;芽孢杆菌属;染料脱色

【作者】李凡姝;刘海洋;戴绍军;赵敏;王天女;蔡华健;汪春蕾

【作者单位】东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江省实验中学,黑龙江哈尔滨150001;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨

150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040

【正文语种】中文

【中图分类】S188

漆酶(EC 1.10.3.2，p-diphenol:dioxygen oxidoreductases)是一种含铜的多酚氧化酶，能够利用分子氧氧化各种芳香族和非芳香族化合物，同时完成多种底物的单电子转移，分子氧被还原为水［1］。漆酶参与生物合成和木质素降解。白腐菌漆酶对木质素的降解效果较好［2］。因此，真菌漆酶应用于木质素和纤维材料的修饰及去木质素方面有较好的前景。漆酶作用的底物范围很广，可应用于工业废水脱毒、纸浆造纸、纺织业和石化工业以及作为生物修复剂清理除草剂和杀虫剂［3］。20世纪以前，对漆酶的研究主要集中在真菌漆酶［2］，对原核生物中漆酶的研

究少有报道。Alexandre等［4］根据分子数据分析，提出漆酶基因可能广泛存在于细菌中。自1983年首次发现原核生物生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)

具有漆酶活性［5］，随后陆续有报道证实海单胞菌(Marinomonas mediterranea)［6］、大肠杆菌(Escherichia coli)［7］、黄色链霉菌(Streptomyces galbus)［8］以及天蓝色链霉菌(S.coelicolor)［9］等菌株具有

漆酶活性。虽然大多数细菌漆酶与真菌漆酶相比产量少且氧化还原电位较低，但是细菌漆酶具有不需糖基化，具有较好的热稳定性和pH范围广泛等优点［10］，

使得细菌漆酶比真菌漆酶更适合基因操作和构建重组酶［11］。细菌生长繁殖速

度较快，研究周期较短，使得高产漆酶菌株的筛选以及分离鉴定具有高效性。笔者从东北林业大学实验林场樟子松林的土壤中采集样品，利用含铜的富集培养基筛选出一株高产漆酶的细菌菌株CLb，通过形态学、生理生化特性以及16S rDNA序

列分析，将菌株CLb初步鉴定为芽孢杆菌属，并对菌株的生物学特性及其对染料

的脱色效果进行研究，为细菌漆酶应用于染料脱色提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品。取自东北林业大学实验林场樟子松林下土壤。

1.1.2 培养基。5×M9盐溶液:Na2HPO7·H2O 64 g/L，KH2PO415 g/L，NaCl

2.5 g/L，NH4Cl 5 g/L;M9 培养基:20%葡萄糖20 ml/L，5×M9盐溶液200

ml/L;富集培养基:CuSO4·5H2O 0.05 g，M9培养基1 000 ml;LB培养基:胰蛋白

胨(Tryptone)10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 17 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 高产漆酶菌株的筛选及分离纯化。称量采自东北林业大学实验林场樟子松林

的土壤样品10 g，将土样加入于120 ml M9培养基，振荡混匀，150 r/min，37℃培养2 d，继代培养2次，将培养液适当稀释后涂布于含0.2 mmol/L Cu2+的LB 平板上，37℃培养3 d。用浓度0.1%丁香醛连氮(无水乙醇溶解)溶液对上述平板

菌落进行鉴定。挑取对丁香醛连氮显现粉红色的单菌落划线于含0.4 mmol/L

Cu2+的LB培养基上，重复操作3次，得到产漆酶细菌的单克隆，选取显色最深

的菌株进行研究。

1.2.2 菌株CLb的形态学及生理生化特性测定。对菌株CLb进行革兰氏染色，测

定糖类发酵、淀粉分解等生理生化特性［12］。

1.2.3 菌株CLb的16S rDNA序列分析。以CTAB法提取的菌株CLb的总DNA

为模板，以16S rDNA通用引物27F:5＇-agagtttgatcctggctcag-3＇和 1492R:5＇-ggttaccttgttacgactt-3＇扩增菌株CLb的16S rDNA。反应体系为:ddH2O 22

μl，10 × Ex buf fer缓冲液3 μl，dNTP 2 μl，引物 27F 和 1492R 各1 μl，模板DNA1 μl，Taq 聚合酶0.2 μl。反应条件为:94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃变性18 s，