叶绿体分离与荧光染色
大学课程《细胞生物学》实验教案-叶绿体的分离与荧光观察
大学课程《细胞生物学》实验教案-叶绿体的分离与荧光观察大学课程《细胞生物学》实验教案叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
二、实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。
三、实验材料新鲜菠菜叶四、实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。
五、实验药品匀浆介质(0.25mol／L蔗糖、0.05mol／L Tris—HCi缓冲液，pH7.4)：称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。
50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。
0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心l. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎。
2. 加入预冷到近0'C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。
3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
4. 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心1min。
5. 在2ml离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。
加液完后，可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。
6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。
7．离心8000r／min，20min。
8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。
还可在暗室内用荧光显微镜观察。
(二)菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1)在普通光镜下观察·(2)在荧光显微镜下观察(3)用同样方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
叶绿体的分离及荧光染色观察
叶绿体的分离及荧光染色观察泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者:商倩倩【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光;3、复习巩固制片及染色的基本技术。
【实验原理】1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。
细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架,这些结构被称为亚细胞组分。
分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、差速离心和密度梯度离心：差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。
离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀.在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。
最后为核糖核蛋白复合体。
由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。
一般差速离心2—3次，分离效果会好一些。
差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。
若对产物纯度的要求较高,则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。
这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种.速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体.叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。
它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集,然后用密度梯度离心纯化,便可用于各种研究.3、荧光：光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。
紫外辐射,可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光.荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光.一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失.荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。
叶绿体的分离与荧光观察
04 实验操作流程
实验材料准备
01
02
03
新鲜植物叶片
选择健康、无病虫害的植 物叶片，如菠菜、豌豆等。
实验试剂
包括分离液、荧光染色剂、 缓冲液等。
实验仪器
包括离心机、显微镜、染 色皿、吸管等。
叶绿体的分离
将新鲜叶片洗净，剪成小段， 放入离心管中。
加入适量的分离液，轻轻摇晃 ，使叶片充分浸泡在分离液中
荧光显微镜的工作原理和使用方法
工作原理
荧光显微镜利用特定波长的光激发细 胞内荧光染料或荧光探针发出可见光 ，通过光学系统放大并显示在屏幕上 。
使用方法
使用荧光显微镜时，需要先对样本进 行染色或标记，然后将其置于显微镜 下观察。观察时需要调整光源和滤光 片，以获得最佳的荧光效果。
荧光观察技术在叶绿体研究中的应用
叶绿体形态观察
荧光染料或荧光探针可以标记叶 绿体，通过荧光显微镜观察叶绿
体的形态、数量和分布情况。
叶绿体功能研究
荧光染料或荧光探针可以结合叶绿 体中的色素或蛋白质，通过观察荧 光信号的变化来研究叶绿体的功能 和代谢过程。
叶绿体动力学研究
利用荧光探针标记叶绿体，可以观 察叶绿体的运动和分布情况，了解 其在细胞内的动力学特征。
荧光观察
在荧光显微镜下观察叶绿体，发现叶绿体发出强烈的绿色荧光，表 明叶绿体含有丰富的叶绿素。
细胞壁与细胞质的分离
通过实验操作，成功将细胞壁与细胞质分离，便于后续实验的进行。
结果分析
1 2
叶绿体分离效果
实验结果表明，采用离心和密度梯度离心法能够 获得较为纯净的叶绿体，分离效果较好。
荧光观察的意义
荧光观察能够直观地展示叶绿体的存在和状态， 对于研究叶绿体的功能和结构具有重要意义。
高中生物实验 叶绿体的分离和荧光观察 实验报告
实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。
了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。
掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。
掌握显微数码拍照的方法。
二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。
显微数码拍照。
三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。
离心后可得沉淀的叶绿体。
四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。
2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。
3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。
4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。
5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。
a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。
b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。
c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。
而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。
d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。
保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。
5．显微数码拍照。
五．实验结果。
高中生物 实验四：叶绿体的分离与荧光观察
6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。 7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光 学显微镜观察。使用荧光显微镜观时，将叶绿体悬液滴在 无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料， 盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
8.观察叶绿体的形态结构、测量1~5个叶绿体的长轴和短
【ห้องสมุดไป่ตู้验原理】
某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光 能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间 内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就
称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体
内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧 光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧 光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧 光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用 荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
实验四：叶绿体的分离与荧光 观察
【实验目的】
了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用 荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
【实验原理】
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生 特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿 体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或 0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗 透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在 1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未 被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可 获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温 下进行分离要迅速。
【仪器、材料与试剂】
仪器：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微 镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测 微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴 管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。 材料：菠菜叶片
叶绿体的分离纯化及荧光观察
叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。
叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。
本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。
一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。
可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。
同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。
2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。
接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。
将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。
3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。
首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。
然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。
这个沉淀就是叶绿体。
4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。
最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。
二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。
通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。
2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。
荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。
3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。
将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。
然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。
4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。
例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。
总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。
叶绿体的荧光染色与观察
姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验材料与用品】1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布，载玻片、盖玻片等2. 材料：新鲜菠菜3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察迅速分离和观察。
II.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。
III.①荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。
紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。
叶绿体的分离与荧光观察实验报告
叶绿体的分离与荧光观察实验报告好嘞，今天咱们聊聊叶绿体的分离与荧光观察实验，这可是个既有趣又有点神秘的过程哦。
叶绿体是植物细胞里一个特别重要的小家伙，简直就是植物的太阳能工厂。
它们把阳光转化为化学能，简直像是大自然的魔法师。
今天的实验就围绕着这些小精灵来展开，让我们一起揭开它们的神秘面纱。
咱们得准备好一些材料。
可以用菠菜叶，没错，就是那种绿色的、看起来特别健康的叶子。
选几片新鲜的，感觉就像是在挑选食材一样。
咱们要把这些菠菜叶用刀剪成小块，动作要轻柔点，别把自己给划了，嘿嘿。
剪好之后，准备一个清水盆，把这些小叶子泡进去，让它们稍微放松放松，感受一下水的滋润。
水是生命之源，没错！然后，咱们得准备一台榨汁机，嗯，没错，就是那种能把东西变成液体的机器。
把泡过水的菠菜叶放进榨汁机，倒点水，加点冰块，嘿，榨汁的时候声音可真像在开派对！随着咕噜咕噜的声音，菠菜叶就变成了一杯绿色的汁液，看看这颜色，真是好看得不得了。
这可不是普通的绿色，里面有丰富的叶绿素，嗯，想想都让人开心。
咱们要把这杯绿色汁液过滤一下，把渣滓都捞出来。
用个细网筛或者纱布都行，慢慢来，别心急，毕竟好东西要慢慢来嘛。
过滤完之后，剩下的就是一杯清澈的绿色液体，咳咳，真想来一口，当然不能喝，实验可不能马虎。
现在到了最激动人心的时刻了！准备好荧光显微镜，哇，听上去就让人心跳加速。
把过滤后的液体滴到显微镜的载玻片上，咱们得轻轻地盖上盖玻片，像是在给小家伙们盖被子一样。
然后，把它放在显微镜下，慢慢转动镜头，哇，果然不负所望！当你看到那些小小的叶绿体在光下闪闪发光，简直就像星星在夜空中一闪而过，太美了，心里那个美呀，简直不敢相信自己的眼睛。
荧光显微镜真是个神奇的玩意儿，能让咱们看到那些肉眼看不见的东西，真是太酷了。
叶绿体在荧光下，仿佛是穿上了闪亮的衣服，优雅地在液体中游动，感觉它们都在跟你打招呼呢。
想想看，平时它们在叶子里默默工作，这次终于被我们发现了，心里别提多得意了。
叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离及荧光观察【实验目的】1.学习使用差速离心法获取叶绿体2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。
高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。
、叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。
在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um.叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。
叶绿体含有3种不同的膜：外膜，内膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。
2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。
收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
3.差速离心法特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——内质网与高尔基体——核蛋白体可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
【实验材料】1. 试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。
2. 器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml 烧杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。
叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验报告
叶绿体的分离、纯化及荧光观察实验目的：1、通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法2、熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光实验原理：差速离心法用于分离大小不同的物体。
在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、醉后为核糖核蛋白复合体。
密度梯度离心法是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。
叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
实验用品：新鲜菠菜、提取缓冲液、蔗糖溶液、0.01%吖啶橙、离心机、电子天平、荧光显微镜、剪刀、研钵、移液管、漏斗、滴管、10ml离心管实验步骤：1、选取新鲜嫩绿菠菜叶，去叶梗及粗脉，洗净擦干，称30克放于150ml 0.35M.Nacl溶液中2、将液、叶同装入组织捣碎机中，匀浆3-5分钟，转速5000r/min3、将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min5、取上层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）6、将沉淀用2-3mlMnacl液悬浮7、取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察8、另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙染料，混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察实验结果：普通显微镜下，叶绿体呈橄榄形，绿色，高倍镜下可看到基粒（深绿色小颗粒）。
荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，次生荧光为“橘红色”分析与讨论：1、捣碎叶片式时时间不宜过长，否则会破坏叶绿体2、用荧光显微镜找到物象后，要先拍照后观察，因为荧光会逐渐变弱。
实验三 叶绿体的分离与荧光观察
实验三叶绿体的分离与荧光观察【实验材料】1.器材： 1）主要设备: 普通离心机,粗天平,荧光显微镜；2）小型器材: 剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管, 10ml刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片。
2.材料：新鲜菠菜。
3.试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridine orange).0.01%吖啶橙的配制：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4℃冰箱保存。
放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml稀释。
吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。
阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA 聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。
【实验方法】1、叶绿体的分离（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;（2）加10ml的0.35mol•L-1 NaCl溶液研磨匀浆;（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。
2、叶绿体的观察（1）滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。
在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。
3. 完整细胞中的叶绿体观察（1）用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。
（3）将以上两种制片进行以下两种方式的观察：a在普通光镜下观察。
b在荧光显微镜下观察。
【精选】实验3叶绿体的分离与荧光观察
实验三 叶绿体的分离与荧光观察
植物 细胞核 细胞 过滤 匀浆
线粒体 叶绿体 溶酶体 等
微粒体 细胞质膜 大多聚核糖 体等
核糖体亚基 小多聚核糖体 等
细胞质中 可溶部分
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一、实验目的：
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般 原理和方法。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微 镜的使用方法。
三、实验用品：
1、试剂: ① 0.35mol/L 氯化钠溶液 ② 0.01%吖啶橙荧光染料。
2、材料: 新鲜菠菜 3、器材：150ml烧杯, 50ml 量筒 , 滴管 , 10ml 刻度离心管, 纱 布若干，载片和盖玻 片。 4、设备：离心机、研钵、天平、普通光学显微镜、荧光显 微镜。
四、实验方法与步骤：
3.菠菜叶徒手切片观察 ① 用单面刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面
置于载玻片上，滴加1～2滴0.35mol/L NaCl 溶液，加盖片后轻压，置于普通光镜和荧 光显微镜下观察。 ② 用同样的方法制片，滴加1～2滴0.01%吖啶 橙染液染色1min，洗去余液，加盖片后在 荧光显微镜下观察。
注意事项 ： 1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠）中进 行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 2、分离过程最好在0～4℃下进行；如果在室温下，要迅速 分离和观察。 3、离心时，离心管要平衡。 4、凡是荧光染料都有一定毒性，请注意保护！ 5、汞灯开启后15min内不要关灯，关闭后15min内不要开启。
1.叶绿体的分离 ① 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除粗梗及叶脉，
称取10g叶片于研钵中，先加5ml 0.35mol/L NaCl 溶 液充分研磨，加至50ml，继续研磨。 ② 将匀浆用 4层纱布过滤于150ml 烧杯中。 ③ 取滤液 8ml 在 1000r/min 下离心 2min，弃去沉淀。 ④ 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉 淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体的分离与荧光观察实验目的和原理观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．并熟悉荧光显微镜的使用方法。
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0-5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。
某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光．若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，盖玻片和无荧光油。
实验用品一、器材1、主要设备：普通离心机，组织捣碎机，粗天平，荧光显微镜。
2、小型器材：500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml 刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
叶绿体分离与荧光染色观察
组织碎片
叶绿体经激发光波照射后，自 叶绿体次生荧光的来由, 结 普通光学显微镜下观察到 发荧光呈现火红色，因叶绿体 橘红色为叶绿体的荧光
果 叶绿体的正常结构。离心 在其悬液中呈现点状均匀分 效果，叶绿体的悬液中混
分 不纯导致混有其他组织碎 布，且悬液其他组分无自发荧 有的细胞核碎片中的核
析片
光反应,故观察到斑状分布的 酸经丫啶橙染色荧光反
火红色荧光效果
应呈现绿色
六．思考与讨论
1.注意事项 (１）要得到完整的、有活性的叶绿体,须在低温下迅速提取,涂片后立即观察,注意离心时的
时间及强度。
(２）利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室，会收到许多因素的影响,如温度、光、 淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间,必要时应立即拍照。
(３）在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油。 2．思考题 （１)在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化? 有变化。因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片,激发光会不同， 叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样 （２)游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别， 为什么? 有区别。因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光,所以 最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小,颜色和荧光强度就会有差别。 (3）根据观察到的实验现象，简述自发荧光和次生荧光的区别？ 自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可发荧光的现象，而次生荧光需要染色。因为 发光机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的荧光颜色也会不同。 （4)叶绿体分离的原理是什么?操作过程应注意什么？ 采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同,把叶绿体大小 的颗粒沉降出来。 叶绿体的分离应在等渗溶液（０．３5mol/L 氯化钠或０.4mol/Ｌ 蔗糖溶液）中进行，以免 渗透压的改变使叶绿体受到损伤;分离过程最好在０～4℃的条件下进行;如果在室温下，要 迅速分离和观察。 3.实验小结
生物实验-叶绿体的分离与荧光观察
实验、叶绿体的分离与荧光观察实验目的1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。
将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。
然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。
另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
实验用品一、器材1.主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
二、材料新鲜菠菜。
三、试剂0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
实验方法一、叶绿体的分离与观察1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。
2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3~5min。
3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。
4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
5. 将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即不叶绿体(混有部分细胞核)。
6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮、7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。
叶绿体分离及荧光观察
三、实验用品
1、材料：新鲜菠菜或其它植物叶片 2、器材：普通离心机，组织捣碎机，电子天 平，光学显微镜，烧杯，量筒，滴管，刻 度离心管，纱布若干，载玻片和盖片等。 3、试剂：0.35mol/L NaCl 溶液 0.01％吖啶橙
四、实验步骤
取材→捣碎匀浆→过滤→离心→悬浮 →制片→观察
选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，
实验四 叶绿体的 分离与荧光观察
一、实验目的
1、通过实验，了解细胞器分离的一般原理和 方法 2、了解荧光显微镜的基本结构、原理，掌握 其操作方法，并观察叶绿素的自发荧光和叶 绿体的间接荧光。
二、实验原理
将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心， 是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的 沉降速率取决于颗粒的大小，形状，稠密度，也与 离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心 场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降 速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使 非均一悬浮液中的颗粒按其大小，密度先后分批沉 降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组 分。 叶绿体是高等植物细胞中的重要细胞器，行使光合 作用，将光能转化为化学能
称6g 于30ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，于研钵中研 磨。 将匀浆液用6 层纱布过滤，收集于100m1 烧杯中。 取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。 将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液， 沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。 将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。 取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通 光镜下观察。 取一滴叶绿体悬液在无荧光载片上，再滴加一滴 0.01% 吖啶橙染液染色1min，盖上盖玻片，于荧光显 微镜下观察。可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则 发出绿色荧光。
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姓名孙镭系年级2010级组别齐鲁医学班同组者孙义远科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离，纯化学号201000232117
【实验目的】
1. 通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法
2. 熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光
【实验原理】
1.叶绿体分离的原理：
匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同
依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
2.差速离心特点：介质密度均一速度由高到低，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器沉降顺序：核----线粒体------溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体------核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3.荧光的概念：
光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。
紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。
一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。
某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。
4.荧光显微镜的操作及注意事项接通电源，打开启动装置开关按starter 按钮3-5秒以启动激发光源。
注意starter键不能超过5秒。
启动2-3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main switch。
选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。
放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野。
关闭普通光源后，撤开UV 挡板，即可观察到样品的萤光情况，需要照相时，要及时拍照，否则可能拍不到萤光照片。
观察结束后，关闭main switch，切断电源。
【实验材料】
1. 材料
姓名孙镭系年级2010级组别齐鲁医学班同组者孙义远科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离，纯化学号201000232117
新鲜菠菜
2. 试剂
（1）0.35mol/L的NaCl等渗溶液
（2）0.01%吖啶橙（acridine orange）称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做母液，储存于棕色瓶，置4℃冰箱保存。
临用前取1mL母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9mL。
3．仪器
普通或高速离心机（九阳豆浆机）、荧光显微镜、研钵、滴管、漏斗、离心管，天平，量筒，纱布
【实验步骤】
1. 选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉，洗净擦干，称取30g放于150ml0.35M.的NaCl溶液中。
2. 将叶和液体同时装入组织捣碎机中（豆浆机中），匀浆3-5min，转速5000r/min；
3. 将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml 烧杯中：
4. 将滤液4ml在1000r/min下离心2min
5. 取上清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）
6. 将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液悬浮。
7. 取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察；
8. 另外取一滴悬液滴片，再加一滴0.01%的吖啶橙染料混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察。
【实验结果】
首先撕取菠菜表皮，放在载玻片上，加一滴0.35M.的NaCl溶液，加盖玻片在显微镜下观察保卫细胞与表皮细胞，结果如图
姓名孙镭系年级2010级组别齐鲁医学班同组者孙义远科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离，纯化学号201000232117
将叶绿体悬液在显微镜下观察
将叶表皮放在荧光显微镜下观察，结果如下图
姓名 孙镭 系年级 2010级 组别 齐鲁医学班 同组者 孙义远 科目 细胞生物学实验 题目 叶绿体的分离，纯化 学号 201000232117
将不染色与染色的叶绿体装片分别放于荧光显微镜下，结果如图
左侧为自发荧光，火红色 右侧为次生荧光，显橘红色
气孔
叶绿体
核碎片
在图片中。
会有绿色颗粒，
应该是核碎片
姓名孙镭系年级2010级组别齐鲁医学班同组者孙义远科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离，纯化学号201000232117
【实验结果分析与注意事项】
本次实验主要进行叶绿体的分离，纯化以及在荧光显微镜下的观察，首先在显微镜下观察叶表皮，可以清晰地看出保卫细胞镶嵌在表皮细胞中，也可以看到保卫细胞中的叶绿体，不过有些地方撕的较厚，可以看到底层的叶肉细胞。
然后在显微镜下观察叶绿体悬液，叶绿体呈浅绿色的球形或椭球形，周围还有其他一些物质，可能是核碎片等杂质。
把叶表皮放在荧光显微镜下，可以看见气孔和保卫细胞内一周的火红色叶绿体。
在荧光显微镜下，叶绿体显示为火红色，背景有点淡绿色，这是载玻片的杂质发荧光的原因，再用吖啶橙染色，叶绿体显示为橘红色，其中会有绿颗粒，这是核碎片激发出的荧光。
注意事项：
1.要得到完整的、有活性的叶绿体，须在低温下迅速提取，涂片后立即观察，注意离心时的时间及强度。
2. 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察室，会收到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
3. 在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载玻片、无荧光盖玻片香柏油。
思考题
1.在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？
有变化因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片，激发光会不同，叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样
2.游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别，为
什么？
有区别，因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光，所以最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小，颜色和荧光强度就会有差别。
3.根据观察到的实验现象，简述自发荧光和次生荧光的区别？
自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可发荧光的现象，而次生荧光需要染色。
因为发光机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的荧光颜色也会不同。
4.叶绿体分离的原理是什么？操作过程应注意什么？
采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体大小的颗粒沉降出来
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。