铁皮石斛再生体系的建立

铁皮石斛再生体系的建立宋丽娟;冯玉杰;王爱英;胡鸢雷;祝建波【摘要】目的:采用一年生的铁皮石斛组培苗茎段为外植体,以茎段→原球茎诱导→原球茎增殖分化→幼苗壮苗生根为途径,对铁皮石斛组织培养进行系统研究,以期建立稳定的铁皮石斛再生体系.方法:主要以植物组织培养的方法,研究培养基中不同激素配比对铁皮石斛原球茎诱导、原球茎增殖分化、幼苗壮苗生根等方面的影响.结果:铁皮石斛原球茎诱导最佳培养基为MS+活性炭1.0 g/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,诱导率达31.33％;原球茎增殖最佳培养基为1/2 MS+香蕉100g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L,此条件下培养的原球茎质地紧密,颜色墨绿,不易分化;原球茎分化最佳培养基为MS+香蕉100 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L;壮苗生根最佳培养基为MS+香蕉100 g/L+NAA 1.0 mg/L,生根率达75.00％.结论:在西北地区,有效建立铁皮石斛再生体系,对保护濒危植物和扩大铁皮石斛种植区域具有重要意义,同时,为大规模生产提供相关数据参考.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2015(034)009【总页数】5页(P36-40)【关键词】铁皮石斛;茎段;原球茎;再生体系【作者】宋丽娟;冯玉杰;王爱英;胡鸢雷;祝建波【作者单位】石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室, 新疆石河子832000;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室, 新疆石河子832000;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室, 新疆石河子832000;北京大学生命科学学院, 北京100871;石河子大学生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】S567.23铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)的一种名贵且具有药用价值的多年生草本植物，位居中华九大仙草之首。

据《神农本草》记载：铁皮石斛主伤中、除痹、下起、补五脏虚劳、羸瘦、强阴。

久服，浓肠胃、轻身、延年。

在我国，主要分布在安徽、浙江、福建、贵州、广东、广西、湖南、江西、云南等地，对生长环境要求独特而苛刻，根部不跟土壤接触，根群附着在树干、岩石、峭壁等上生长，有的还可附生于蕨类植物上，铁皮石斛主要依靠根部分蘖生长出新植株，并成丛生长，有时也会在茎节处生根长出新的植株[1]。

喜温暖湿润气候，种子无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，且植株生长发育缓慢，平均自然结实率为0.31%[2]，加之人们长期过度采挖和近几年自然灾害频发，严重破坏了铁皮石斛的生境，造成野生资源濒临灭绝[3]。

因此，为了保护濒危植物，利用植物组织培养技术，高效繁殖铁皮石斛是极其重要而有意义的。

铁皮石斛的主要药效成份为多糖，可提高人体免疫力；而生物碱、氨基酸、菲类、联苄等成分对多种肿瘤细胞具有抑制作用[4]。

随着人们自我保健意识的增强，对铁皮石斛的医药用途逐渐熟知，市场需求量攀升不下，导致形成供不应求的现象，为了缓解供应压力，只能人工培育种植，而种苗的选育、繁殖、继代，特别是种质保护都需依赖植物组织培养技术。

此技术的发展，也为铁皮石斛大规模种植和产业化商品化奠定基础。

铁皮石斛植物组织培养技术是通过植物离体器官诱导出原球茎(Protocorm-likebodies，PLBs)，再经过原球茎增殖、分化培养获得大量丛苗，最后将幼苗壮苗生根的过程。

原球茎是指正在生长分化的体细胞胚胎，具有植株同样的物质代谢和形态发育潜能[5]。

目前，在兰科植物中，常用于诱导原球茎的外植体主要有种胚、子叶、叶片、侧芽、茎段、茎尖、根尖等。

曾宋君等(1998)用种子诱导出原球茎。

Men等(2003)以子叶为外植体，成功诱导出愈伤组织和原球茎的混合体。

叶秀粦(1995)成功用叶片诱导出愈伤组织。

黄萍萍(2003)采用侧芽、芽尖为外植体，成功获得原球茎。

Nayak(2002)、Shiau(2005)用茎段诱导出原球茎，是兰科植物最常用的一种诱导方法。

詹忠根则利用离体根尖培养形成原球茎[8]。

近年来，对于兰科植物的植物组织培养报道日益增多，但是，利用种子、叶片、根部等外植体诱导原球茎的效率低，存在一定难度，不能确保原球茎品质，为了建立高效的铁皮石斛再生体系，选择铁皮石斛茎段为外植体，逐步研究铁皮石斛各阶段的培养条件，为大规模生产提供参考依据。

铁皮石斛购买于云南省，为一年生组培苗。

以MS、1/2 MS为基本培养基，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH=5.5～6.5，添加不同浓度的激素(NAA、6-BA)及附加物(活性炭、香蕉、马铃薯)，分别配制成原球茎诱导培养基、原球茎增殖分化培养基、幼苗壮苗生根培养基。

所有激素均在培养基高压灭菌后加入。

温度(25±2)℃，每天光照10 h，光照强度2 100 lx，相对湿度60%～70%。

1.4.1 原球茎的诱导选取长势健壮，株高3 cm以上，至少带有3个茎节的无菌苗，在超净工作台上，将叶片和根部与茎部分离，将叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的小块，叶面正面朝上；茎段切割时，保留一个茎节，切成0.5～1.0 cm的小段后再纵切，水平放置；根部剪成约1.0 cm的小段，水平放置，将处理好的叶片、茎段和根段分别接入原球茎诱导培养基中，进行铁皮石斛原球茎诱导培养。

基本培养基为MS，添加活性炭1 g/L，激素浓度水平设计见表1。

共9组处理，每组处理做3个平行，每个平行5瓶培养基，每瓶培养基中接种外植体10块。

培养3个月后，调查记录原球茎的诱导率，筛选出最适诱导原球茎的激素配比。

原球茎诱导率(%)=诱导出原球茎的外植体个数/接入培养基的外植体总数×100%。

1.4.2 原球茎的增殖分化将经过诱导形成的原球茎继代培养1次，从中再挑选出生长状态相似的原球茎接种在增殖分化培养基中。

基本培养基为MS，附加香蕉100 g/L，激素配比处理见表2，共11个处理，每个处理做3个平行，每个平行5瓶培养基，每瓶培养基中接入大小一致的原球茎10块，培养2个月后，观察原球茎增殖分化情况，仔细记录原球茎颜色、质地以及分化苗的状态，分析不同激素配比对原球茎增殖分化的影响。

1.4.3 原球茎增殖优化确定原球茎增殖培养基中最佳激素配比后，从经过增殖的原球茎中挑选出墨绿、紧密、大小相似的原球茎，接种于原球茎增殖优化培养基，培养基配制方案见表3。

原球茎增殖培养的2～3个月间，随时观察原球茎生长情况，比较原球茎增殖速度，分析培养基、添加物以及添加物浓度的不同对原球茎增殖的影响。

最终筛选出适宜铁皮石斛原球茎增殖的最佳培养基。

1.4.4 壮苗生根当原球茎分化出的从芽长到2～3 cm时，将从芽分离后接种于壮苗生根培养基中，基本培养基为MS，附加香蕉100 g/L，激素NAA浓度水平方案见表4，共6组处理，每个处理3个平行，每个平行5瓶培养基，每瓶培养基中接种5丛小苗，生根培养2个月后，统计小苗生根率，观察根部状态，研究不同激素浓度对幼苗壮苗生根的影响，以此确定铁皮石斛幼苗最佳壮苗生根培养基。

生根率(%)=生根的幼苗数/接种的幼苗总数×100%。

试验中采用了3种外植体，分别是叶片、茎段、根部，而叶片和根部都没有成功诱导出原球茎，最终叶片变黄死亡，带有根尖的根段会增长，但也无法形成原球茎，可能是因为培养基成分和激素配比不适合，需要调试更换基本培养基和激素种类。

茎段除了能诱导出原球茎外，也可以直接成苗，茎段诱导原球茎的试验结果见表1，当培养基中加入不同浓度的NAA和6-BA时，每个处理都有原球茎形成，保持NAA浓度不变时，随着6-BA浓度的升高，诱导率逐渐提高，但是当6-BA的浓度达到1.0 mg/L时，诱导率有下降现象，说明较高浓度的6-BA对原球茎诱导有抑制作用。

同样，6-BA 浓度不变时，较高浓度的NAA也导致诱导率下降。

处理5的原球茎诱导率明显高于其余处理，诱导率达到31.33%。

可见，原球茎诱导受到激素的相互影响，浓度过高过低都会降低诱导率，且形成的原球茎容易白化或褐化死亡，在培养基中加入一定量的活性炭，就是为了有效降低褐化率。

由试验结果可知，原球茎诱导最佳培养基为MS+活性炭1.0 g/L+NAA 1.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。

培养基中含有植物生长所需的各种成分，其中植物激素对植物的生长调节作用最大，激素种类和浓度配比的不同，直接影响植物的生长形态。

原球茎发育过程要经过5个阶段：原球茎形成期，原球茎肥大期，茎叶分化期，茎叶形成期，茎叶伸长期。

增殖的最佳时期在原球茎肥大期，但由表2可知，原球茎增殖普遍会伴有原球茎分化的现象，说明部分原球茎已经进入茎叶分化期，处理8是唯一没有分化的组合，原球茎颜色呈墨绿，生长紧密，饱满，但是增殖时间较长。

其它处理中增殖的原球茎颜色呈浅绿或翠绿，状态疏松，表面有白色绒毛，易分化。

综合考虑到原球茎的生长状况和后期分化、壮苗等，选取增殖出的原球茎为墨绿色，形态紧密的组合为原球茎增殖最佳激素配比：NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L。

处理7中的原球茎在短期内基本上完全分化，成丛苗状态，矮小，茎部不易伸长，并不断生长出相同类型的小苗，不利于后期壮苗。

而处理9分化出的小苗整齐，翠绿健壮，因此，原球茎分化最佳培养基为MS+香蕉100 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 2.0mg/L。

培养基是原球茎的直接营养来源，基本培养基成分和添加物种类、浓度的不同直接影响原球茎的增殖情况，而原球茎优劣关系到成苗的健壮，为了得到优质的原球茎，对原球茎增殖培养进行优化。

优化结果见表3：选用MS为基本培养基时，原球茎生长速度慢，易分化，出现了严重的褐化死亡现象，导致增殖效率降低，说明原球茎不宜选择MS培养基进行增殖。

在1/2 MS培养基中增殖，可以获得紧密或疏松的原球茎，效果较好。

在培养基中加入不同浓度的马铃薯，发现前1个月，原球茎增殖速度较快，颜色浅绿，疏松，2个月后，已经有大量原球茎生成，但是体态弱小，黄绿色，不易成活。

添加香蕉的培养基中，原球茎在1个月间，增殖速度慢，2个月后，有一定量的原球茎生成，颜色墨绿，紧密，不易分化。

然而，香蕉浓度的不同对原球茎增殖也有一定影响，浓度小于100 g/L时，原球茎颜色黄绿，部分黄化死亡，高于100 g/L时，增殖量多，原球茎较小。

因此，原球茎增殖最佳培养基为1/2 MS+香蕉100 g/L+ NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L。

根部是植物吸收营养的一个重要器官，根部吸收水分、无机盐等营养物质促进茎叶的生长，所以，壮苗生根是植物移栽之前的一个重要步骤，也是衡量植株健壮、营养成分含量的一个侧面标准。