高效液相色谱法知识讲解
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法知识讲解
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下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。 ➢ 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液 建议每天更换。 ➢ 避免溶剂瓶暴露在直射阳光下（尤其对于水、THF等）用氩气置换流动相
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第二节 基本原理
液相色谱根据分离机理的不同可分为：
液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱法 分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)
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（一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用 的不同来分离物质。
Load
Inject
六通阀定量环
通废液口
定量环
进柱
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仪器：自动进样器
样品盘
机械手
自动进样100样品盘/机器手/自动洗针
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色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架 柱温箱
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♪ 当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这
样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇， 并将其流速调至约2－3滴/分钟使溶液流过冲洗装置。(对于二元泵 SL，如果不使用盐溶液可以不开)10％异丙醇有助于降低水的表面 张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。
外挂架
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仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
高效液相色谱知识收藏
高效液相色谱知识收藏1. 分离原理：HPLC利用固定在填料中的固定相和流动相（溶剂）之间的相互作用来分离混合物中的化合物。
固定相通常是多孔填料，而流动相则是溶解样品混合物的溶剂。
在流动相的作用下，样品中的化合物会以不同速率通过固定相，从而实现分离。
2. 设备组成：HPLC主要由溶剂输送系统、样品进样器、固定相柱和检测器组成。
溶剂输送系统用于向柱中输送流动相，样品进样器用于将样品注入HPLC系统，固定相柱用于实现化合物的分离，检测器用于检测分离出的化合物。
3. 应用领域：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全、生命科学研究等领域。
它可以用于分离和测定各种化合物，包括药物、天然产物、食品添加剂等。
4. 操作要点：在进行HPLC分析时，需要注意溶剂的选择、固定相柱的条件、检测器的调试等细节。
同时，样品的预处理和进样器的设定也会影响分析结果的准确性和稳定性。
5. 数据分析：HPLC分析通常会生成大量的数据，包括色谱图谱、保留时间、峰面积等。
对这些数据进行分析和解释是HPLC分析的关键步骤，可以借助数据处理软件进行数据分析和处理。
总的来说，HPLC是一种高效、准确的分析技术，可广泛应用于化学、生物和医药领域。
了解HPLC的基本原理和操作要点，可以有效提高样品分析的准确性和效率。
HPLC是一种高效、准确的分析技术，可广泛应用于化学、生物和医药领域。
了解HPLC的基本原理和操作要点，可以有效提高样品分析的准确性和效率。
在HPLC分析中，固定相柱是至关重要的部分，不同的固定相柱适用于不同的样品类型和分离要求。
以下是一些常见的固定相类型：1. 反相色谱柱：反相色谱利用极性差异来进行化合物的分离，通常用于水溶性化合物的分离。
反相色谱柱的填料通常是非极性的，比如碳链分子。
常见的反相色谱柱填料包括C18、C8、C4等，它们的碳链长度不同，可以实现对不同极性化合物的分离。
2. 正相色谱柱：正相色谱是基于化合物在极性填料上的分离，适用于非极性化合物的分离。
高效液相色谱的基础知识 PPT
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高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法仪器工作原理 高效液相色谱仪的维护 高效液相色谱法仪的注意事项
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高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70 年代初发展起来的一种新型分离分析技术。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度 检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、 操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色 谱法优越性，现从两方面进行比较：
• 高压输液系统 • 进样系统 • 分离系统 • 检测系统
高效液相色谱仪工作原理
其工作过程如下：
高效液相色谱仪的维护 泵的使用和维护
1.防止任何固体微粒进入泵体，输液泵的滤器应经常清洗或更换。 2.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。泵工 作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或 密封环，最终产生漏液。 3.泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏 液。 4.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气 泡，泵就无法正常工作
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法 速度 灵敏度 高速 高灵敏度 经典液相色谱法 极慢 低
自动化
进料方式 效率
高自动化
高压输液设备 高效
低
重力加料 低
如对氨基酸分离，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸； 而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。
高效液相色谱仪工作原理
CAP2000+粘度计使用说明书（下）
• • 样品应完全覆盖锥转子底部表面，并且溢出其边沿 1.0mm。 8. 等待约 1至 3分钟，使锥转子、加热板及样品的温度到达设置温度。
高效液相色谱法知识汇总(全面详细)
高效液相色谱法知识汇总（全面详细）1.与气相色谱相比液相色谱的优点与气相色谱法相比，液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性及相对分子质量的限制，只要求把样品制成溶液即可，非常适合于分离生物大分子、离子型化合物，不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。
此外，液相色谱的流动相不仅起到使样品沿色谱柱移动的作用，而且与固定相一样，与样品分子发生选择性的相互作用，这就为控制和改善分离条件提供了一个额外的可变因素。
而气相色谱法采用的流动相是惰性气体，对组分没有亲和力，仅起运载作用。
2.液相色谱特点高压、高速、高效、高灵敏度、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
3.高效液相相色谱仪的组成高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统。
4.流动相使用前必须脱气常用的脱气方法有：低压脱气法(电磁搅拌、水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气)、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。
5.梯度洗脱用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。
6.高压梯度(内梯度)：特点是先加压后混合，将溶剂用高压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。
低压梯度(外梯度)：特点是先混合后加压。
在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。
7.进样系统要求良好的密封性，最小的死体积，最好的稳定性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。
8.分离系统色谱柱是实现分离的核心部件。
由柱管和固定相组成。
柱管为直型不锈钢管。
一般色谱柱长5~30cm，内径4~5mm，凝胶色谱柱内径3~12mm，而制备色谱柱内径则可达25mm。
一般淋洗溶剂在进入色谱分离柱之前，先通过前置柱。
HPLC 柱的填料颗粒粒径一般约为3~10m，填充常采用匀浆法，色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
9.检测系统用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
高效液相色谱知识大全
高效液相色谱I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
分析化学高效液相色谱法
分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。
下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。
一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。
溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。
2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。
3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。
柱温一般在室温到高温之间进行控制。
4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。
根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。
5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。
根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。
6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。
常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。
二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。
样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。
根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。
HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。
其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。
三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。
1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。
药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。
2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。
高效液相色谱知识
⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度 快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品 甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
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三、HPLC 的组成
• HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、OL Apple系列 色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成 。
• 一、高压输液系统
1、泵的性能 ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至
关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范 围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出 压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积 小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
2、梯度洗脱
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②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到 最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能 高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数 量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高 效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、 热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
• 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高 压梯度（内梯度）。
• 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多 种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯 形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进 行梯度洗脱。
• 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不 断变化，因此带来一些精选特20殊21版问课件题，必须充分重视： 5
高效液相色谱知识
• 一、液相色谱的原理 • 二、HPLC的特点
• 三、HPLC 的组成 • 四、流动相 • 五、缓冲溶液的作用 • 六、梯度洗脱的流动相
高效液相色谱法—认识高效液相色谱法(仪器分析课件)
二、高效液相色谱法的基本原理
基本原理：
混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流动相 和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力的 不同，随流动相在两相间进行反复多次分配过程，经过 一定长度的色谱柱，彼此分离开来，最后按一定顺序流 出。
三、高效液相色交换色谱
固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种 离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。
4. 凝胶色谱（空间排阻色谱）
以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同 孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。
2.分配色谱（液-液分配色谱）
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相，现多为化学键合 固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。
三、高效液相色谱法的主要分离类型
一、高效液相色谱法的基本概念
二、高效液相色谱法的基本原理
三、高效液相色谱法的主要分离类型 四、HPLC与GC的比较
一、高效液相色谱法的基本概念
基本概念：在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵 敏度的在线检测器，是一种新型分离分析技术。
特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。
四、HPLC与GC的比较
1）应用范围不同 液相色谱非常适合分子量较大、难气化等物质的分离分析。
2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 ① 可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离 的选择性。 ② 液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大。 ③ 液相色谱通常在室温下操作。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结一、样品测定1、流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2、样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3、记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4、进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC 系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5、计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6、仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0、1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0、5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0、1~0、3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
第7章高效液相色谱分析法
第7章高效液相色谱分析法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。
它的分离原理是利用样品中不同组分在固定填料（站相）上的分配行为，通过流动相（流动相）的推动，使不同组分在填料上快速分离。
HPLC由于其灵敏度高、分析速度快、分辨率高等优点，广泛应用于药物分析、环境监测等领域。
高效液相色谱分析法的基本步骤包括：样品制备、进样、色谱分离、检测和数据处理。
样品制备是将需要分析的样品处理成可溶解于溶剂体系中的形式，通常需要提取、过滤等步骤。
进样是将样品注入色谱柱中，常用的进样方式有定量进样和体积进样。
色谱分离是指样品组分在填料中的分离过程，选择合适的填料和流动相可以实现对目标物的有效分离。
检测是通过检测器对样品在色谱柱中的分离情况进行监测，常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器等。
数据处理是将得到的检测结果进行定量分析和报告生成。
高效液相色谱分析法具有如下特点：1.分离效率高：由于HPLC使用的填料颗粒细小，色谱柱长度较长，使得分离能力显著提高，可以同时分离多个组分。
2.灵敏度高：HPLC配备了多种灵敏度高的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，可以对很低浓度的组分进行检测。
3.分析速度快：HPLC的柱径较小，填料颗粒细小，流动相的流速较大，使分离速度更快。
可以在短时间内完成大量分析。
4.具有选择性：可以根据目标物的化学性质选择不同的填料和流动相，从而实现对不同化合物的选择性分离。
5.自动化程度高：HPLC仪器配有自动控制系统和数据采集系统，可以实现样品进样、数据处理等自动化操作，提高了实验效率和准确性。
高效液相色谱分析法在实际应用中具有广泛的应用。
比如在药物分析方面，HPLC可以用于药物质量控制、药物代谢动力学研究等。
在环境监测方面，HPLC可以用于有机污染物的检测和分析。
在食品安全方面，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂等。
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
高效液相色谱知识分享
高效液相色谱知识分享总述：根据样品在流动相和固定相中的分配系数的不同将组分分离开来，依次通过紫外检测器检测，再通过色谱工作站输出色谱流出曲线，依据色谱流出曲线我们可以得到：“色谱峰个数——组分最少个数；保留值——定性分析；面积、峰高——定量分析；保留值、区域宽度——判断色谱柱的分离效能；两峰间的距离——评价固定相、流动相的选择及配比是否合适”等信息。
下面从以下几方面进行阐述（原理、设备、注意事项）：I．概论一、液相色谱理论发展简况1、色谱法的诞生色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
2、HPLC的特点和优点2.1 HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速-流速为0.1~10.0 ml/min。
高效-可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
2.2HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
二、基本概念和术语1．色谱图和峰参数1.1 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
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外挂架
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仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
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仪器：化学工作站
进样器 高压泵 流动相 色谱柱 检测器
数据处理
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固定相与流动相
正相HPLC
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性强 流动相(己烷, 庚烷)- 极性弱 极性物质后出峰
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（二）液-液分配色谱
流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液色谱，是利 用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液 相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。
流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配 色谱法。
流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配 色谱法。
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♪ 当泵头安装有柱塞清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这
样就会增加活塞杆运动时的阻力。所以开泵前一定要用10％异丙醇， 并将其流速调至约2－3滴/分钟使溶液流过冲洗装置。(对于二元泵 SL，如果不使用盐溶液可以不开)10％异丙醇有助于降低水的表面 张力，并有抑菌作用。不要用其它溶剂代替。
上层的空气如果应用许可，在溶剂中加人0.0001－0.001 M的叠氮化钠(不适 用于LC/MS)如果允许，可以考虑永远在水相中加入5%或以上浓度的有机 溶剂(甲醇、乙腈)。 ➢ 有时因为有气泡吸附在管壁上而造成气泡难以排出时，可以提起管线，使 吸 入一个大气泡。让大气泡把吸附在管壁上的小气泡一起带走。 ➢ 如果在purge时发现从purge阀一直有气泡流出。这时应考虑并非泵里面仍 有气泡，而是液体从一个内径较细的管路(Purge阀出口内径比较细)流入一 个内径较粗的管线(废液管的内径要粗很多)所引起。
♪ 当泵头安装有冲洗附件而不开启10％异丙醇，会使密封垫及活塞 杆的寿命减短(二元泵SL除外)，泵头如果发出“吱吱”声不影响使 用和泵的精度 如果有必要，可以改变压缩因子（compressibility） 来达到更好的效果。
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下列建议将会延长溶剂过滤器的使用寿命并维持泵的运行。 ➢ 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液 建议每天更换。 ➢ 避免溶剂瓶暴露在直射阳光下（尤其对于水、THF等）用氩气置换流动相
仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统。如果使 用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净。
仪器长期不用时，不建议使用纯乙腈封存。因为乙腈有生成聚合物的趋 势。建议使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。
当有流路堵塞时，可以尝试将之反接后冲洗。污染的溶剂或溶剂瓶里的 藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵和系统的的性能。 这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH 4 至7) 中尤其如此。
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（三）离子交换色谱
（四）离子对色谱法
（五）分子排阻色谱法
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三、HPLC结构组成
1100/1200 HPLC仪器的结构组成：
在线脱气机(G1322A,G1379A/B) 二元/四元泵(G1310A,G1311A,G1312A/B) 自动进样器(G1313A,G1329A/B,G1367A/B/C/D) 柱温箱(G1316A/B) 二极管阵列检测器(G1315A/B/C/D) 数据处理系统
♪ 操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气机30mL，对微脱气机10mL）冲洗真 空脱气机,特别是当泵关闭了一段时间后(例如，过夜)，以及在通道中使用挥发性 混合溶剂时，防止溶剂瓶内的玻璃滤头(过滤器)堵塞及长菌，当滤头表面有黑色 或黄色污染层说明发生了堵塞，应立即清洗或更换。
♪ 定期检查排液阀的过滤白头。检查方法：拧开排液阀，以水作流动相。 -对于标准脱气机(G1322A),流速5ml/min水，若压力大于10bar，则建议更换。 -对于微量脱气机(G1379A),流速2ml/min水，若压力大于5bar，则建议更换
测定对象拓展
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由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制， 因此具有更广阔的应用潜力。经过30多年的迅速 发展，高效液相色谱法在基础理论、仪器装置和 色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现已成为化学 化工、环境、药学、食品等多个领域中最具优势 的分离分析方法之一。
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HPLC是在经典的液相色谱法基础上发展起来的，其 以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色 谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加 精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。与气相色谱 不同的是液相色谱中流动相亦参与组分的分离过程，其组 成、比例和pH值可灵活调节，分离模式多样。在实际操作 中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留 值和选择性，从而使不同样品得到分离。
最低波长,低于该波长后,溶剂会有很强的紫外吸收，从而影响极限的稳 定性、干扰对所分析物质的检测。
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HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0.45μm滤膜过滤过的。建议每天 更换新鲜的水。长期不用时，必须把使用水的管路用有机溶剂置换，防 止长霉。
效率、功能齐全的分析工具。
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高效液相色谱法的应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分 析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、 离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了 气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约 占20% ，而80% 则需用高效液相色谱来分析。HPLC因其具有分离效能高、 分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定 生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析，世界各 国己将该法收载于药典。
消除流量脉冲
并联柱塞泵
减小流量脉冲
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仪器：四元泵
四元泵
Ｍ
Ｇ
Ｇ
Ｖ
在
起 作 用
ＭＧＧＶ：比例阀 ＡＩＶ： 主动阀 ＯＢＶ： 单向阀
不是４个泵／必配真空脱气机／二元泵各控制一种溶剂
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仪器：手动进样器-六通阀/定量环
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高效液相色谱法自20世纪60年代问世以来，由于使用了高压输液泵、 全多孔微粒填充柱和高灵敏度检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏度的分离测定。高效液相色谱由于吸取了经典液相色谱的研制经验， 并引入微处理机技术，极大的提高了仪器的自动化水平和分析精度。现 在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很高，既能控制仪 器的操作参数(如溶剂梯度洗脱、流动相流量、柱温、自动进样、洗脱液 收集、检测器功能等)，又能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，以 及对保留数据和峰高、峰面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高
Load
Inject
六通阀定量环
通废液口
定量环
进柱
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仪器：自动进样器
样品盘
机械手
自动进样100样品盘/机器手/自动洗针
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色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架 柱温箱
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HPLC 系统
溶剂传输系统：心脏 样品引入系统： 样品分离系统：关键 信号检测系统： 数据处理系统：
高压泵
进样器
色谱柱
检测器
软件
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泵的基本原理
往复活塞泵(单向阀)
弹簧隔板/红宝石球
串联柱塞泵
主流
反相HPLC
极性:固定相 < 流动相 固定相 - 极性弱 流动相(甲醇, 乙腈等)- 极性强 极性小物质后出峰
与固定相 极性相近 tR长
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流动相(反相)
常用溶剂：乙腈、甲醇、水等
实际使用：甲醇-水/乙腈-水混合体系
等度洗脱：流动相比例恒定 梯度洗脱：逐步提高有机溶剂比例
• 建议：定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶（可以高温灭菌），每三个月至少 清洗一次
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泵的使用要点
♪ 将装有溶剂瓶的溶剂箱放在泵上面或较高处。当在四元泵上使用盐溶液或有机 溶剂时，建议将盐溶液接 在下面的梯度阀口上，将有机溶剂接在上面的梯度阀 口上，有机溶剂通道最好在水或盐溶液通道的正上面。建议用水定期冲洗所有 MCGV通道除去可能在阀口析出的盐结晶。
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第二节 基本原理
液相色谱根据分离机理的不同可分为：
液固吸附色谱 液液分配色谱 离子交换色谱 离子对色谱法 分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)
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（一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸附作用 的不同来分离物质。
L/O/G/O
高效液相色谱知识讲解
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内容概要
HPLC概述 工作原理 结构组成 常见故障与维护 HPLC应用
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一、HPLC 简介
高效液相色谱法(HPLC)是上个世纪七十年代迅速发展起 来的一项高效、快速的分析分离技术，是现代分离测试的重 要手段。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中 的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用 (吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞 留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层 析法。
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过滤器
• 检查溶剂过滤器
查看过滤器是否变色(尤其是盛放水相的溶剂瓶)–拧开脱气机出口或比例阀 入口管线，此时溶剂会因为重力流出。当脱气机或溶剂过滤头堵塞时，溶 剂会流出不畅或不流出–临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常。