分子病毒学 8病毒载体_PPT课件
分子病毒学 8病毒载体
host cells
• Specific target cells: depending on the viral
attachment proteins (capsid or glycoproteins)
4
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence
病毒载体概述
病毒载体概述引言基因导入系统（gene delivery system ）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105〜110 %。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将 4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA ）插入HSV1病毒的UL44 （糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100 （吴小兵等，1998 ）。
病毒的分子生物学幻灯片PPT
• 腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、 鸟类和两栖类动物中都已分离到。
• 腺病毒科分两个属： 1、哺乳动物腺病毒属 (Mastadenovirus) 2、禽腺病毒属(Ariadenovirus)。
• 腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些 基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致 使细胞的功能失常。
病毒的分子生物学幻灯片PPT
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12.1 病毒分子生物学研究的内容
• 病毒分子生物学是用现代分子生物学的 新理论、新技术和新方法对病毒基因组 的结构与功能，基因组的复制、表达和 调控，病毒与宿主的相互作用关系等进 行研究的一门学科。
• 人类对病毒的研究成果在现代分子生物 学的发展史上，做出了重大的贡献。许 多分子生物学上的重大突破都是以病毒 作为模式或研究材料而进行的。
• 病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于 宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等， 以自我复制的方式进行繁殖。
• 病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。
• 正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出 子代RNA之外，还有mRNA的作用。作为翻 译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链， 然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白 等。
12.2 DNA病毒的分子生物学
• DNA病毒基因组有单链和双链两种结构， 并以线状或环状形式存在，大部分为单 一分子，也有的由数个片段的DNA分子 构成分段的基因组。
• 动物DNA病毒多为双链DNA基因组，腺病毒、 痘病毒、疱疹病毒都是双链线状DNA基因组， 末端有重复序列，经退火能形成环形分子。
• 腺病毒(Aflenovirus)是一种典型的双链DNA病 毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例，简 要介绍DNA病毒的分子生物学。
分子病毒学_8病毒载体
Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
Modification of the tropism of adenovirus vector
• Adenovirus fiber binds to CAR (coxsakie and
adenovirus receptor, CAR), receptor which is ubiquitous
Adeno-associated virus vectors
• Non-pathogenic human parvovirus, non-
enveloped ss DNA virus, 4.6 kilobases
• Dependent on a helper virus ( adenovirus or
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene expression
Adenoviral vectors
• Non-enveloped ds DNA, 36 kilobases • Early proteins (E1A, E1B, E2,E3 and E4), late proteins
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins – Can’t replicate beyond the first cycle of infection
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
分子病毒学
分子病毒学1. 简介分子病毒学是病毒学的一个分支，主要研究病毒的分子结构、遗传物质组成、复制机制以及与宿主细胞的相互作用等方面的内容。
通过研究病毒的分子机制，我们可以更好地理解病毒的生物学特性，并寻找新的抗病毒策略。
2. 病毒的基本结构病毒是一种非细胞性的微生物，它由一个蛋白质的外壳（衣壳或包膜）和包含遗传信息的核酸（DNA或RNA）组成。
根据病毒的外壳和遗传物质的性质，病毒可以被分为多种类型，包括单链RNA病毒、双链RNA病毒、单链DNA病毒和双链DNA病毒等。
病毒的外壳主要由蛋白质构成，这些蛋白质可以形成不同的结构，例如蛋白质的六角形晶格结构、蛋白质纤维结构等。
不同的病毒外壳结构决定了它们对宿主细胞的感染方式和复制机制。
3. 病毒的复制机制病毒依赖于宿主细胞进行复制，它们不能独立生存。
病毒的复制机制可以分为四个主要步骤：吸附、渗透、复制和释放。
首先，病毒需要与宿主细胞表面的受体结合，这个过程被称为吸附。
吸附是病毒感染的第一步，它决定了病毒是否能够进入宿主细胞。
接下来，病毒将其遗传物质注入宿主细胞内，这个过程被称为渗透。
在渗透过程中，病毒释放出其核酸，核酸与宿主细胞的细胞器相互作用，导致宿主细胞的基因表达被病毒控制。
然后，病毒利用宿主细胞的生物合成机制进行复制。
它利用宿主细胞的酶和蛋白质合成机制合成新的病毒颗粒，最后将其装配成熟的病毒。
最后，病毒将新合成的病毒颗粒释放到环境中，这个过程被称为释放。
释放后，病毒可以感染更多的宿主细胞，以完成其生命周期。
4. 病毒与宿主细胞的相互作用病毒与宿主细胞之间存在复杂的相互作用关系。
病毒通过与宿主细胞表面的受体结合，进入宿主细胞；利用宿主细胞的生物合成机制进行复制；并通过改变宿主细胞的基因表达，控制和操纵宿主细胞的机能。
宿主细胞也会对病毒的感染做出相应的反应。
宿主细胞可以通过产生抗病毒蛋白、启动免疫应答等方式来抵抗病毒的侵入。
然而，某些病毒可以通过多种机制来逃避宿主细胞的免疫反应。
病毒载体概述培训课件
神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体
病毒载体包装系统
组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
《分子生物学载体》课件
03
基因敲除与基因沉默的意义
用于研究基因功能、治疗遗传性疾病和癌症等疾病，具有重要的科学和
医学价值。
基因治疗与基因疫苗
1 2 3
基因治疗
利用分子生物学载体将正常基因导入到病变细胞 中，替代或修复缺陷基因，实现治疗疾病的目的 。
基因疫苗
利用分子生物学载体将抗原基因导入到受体细胞 中，表达出具有免疫原性的蛋白质，用于预防和 治疗疾病。
详细描述
病毒载体通常由病毒的基因组DNA或RNA以及外源基因的插入位点组成。通过 将病毒载体导入宿主细胞，可以实现外源基因的高效转移和表达。病毒载体在基 因治疗和疫苗开发等领域具有广泛应用。
人工染色体载体
总结词
人工染色体载体是一种人造的染色体，用于克隆和表达大片段DNA。
详细描述
人工染色体载体通过人工构建的方式模拟天然染色体的结构和功能，可以容纳大片段的外源DNA。人 工染色体载体具有稳定遗传、高容量等特点，适用于克隆和表达大型基因组片段以及功能基因组学研 究。
02
常用分子生物学载体介绍
质粒载体
总结词
质粒载体是一种小型环状DNA分子，常用于基因克隆和表达 。
详细描述
质粒载体具有自我复制能力，可以在宿主细胞内独立于染色 体进行复制，并且可以稳定遗传。质粒载体通常包含多个限 制性酶切位点，用于插入外源DNA片段，同时还有选择标记 基因，用于筛选含有目的基因的克隆。
风险评估与控制
进行全面的风险评估，采取必要的措施控制潜在的风险。
知情同意
确保受试者充分知情并自愿参与研究，签署知情同意书。
隐私保护
采取措施保护受试者的隐私和个人信息，防止泄露。
THANKS
感谢观看
生物制药
病毒载体PPT课件
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
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第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
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1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
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病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
2024版《病毒》PPT精品课件
《病毒》PPT精品课件•病毒基本概念与特性•常见病毒类型及其危害•防护措施与策略部署目•杀毒软件原理及使用技巧•总结回顾与未来展望录病毒基本概念与特性01病毒是一种非细胞形态的生物体，依赖宿主细胞进行复制和生存。
起源理论包括细胞起源、共进化等，目前尚无定论。
病毒与生物圈的关系密切，对生物进化有重要影响。
病毒定义及起源病毒结构与分类病毒结构包括核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳，部分病毒还有脂质包膜。
根据核酸类型，病毒可分为DNA病毒和RNA病毒。
根据感染对象，病毒可分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒（噬菌体）。
组装与释放新合成的病毒核酸和蛋白质在宿主细胞内组装成完整病毒粒子，然后释放到细胞外。
利用宿主细胞原料和酶系统，合成病毒核酸和蛋白质。
脱壳病毒蛋白外壳在宿主细胞内解体，释放核酸。
吸附病毒通过特定部位与宿主细胞结合。
注入病毒核酸进入宿主细胞。
病毒复制周期传播途径包括直接接触传播、飞沫传播、空气传播、水传播、食物传播等。
不同病毒的传播途径和宿主范围各异，了解其特性有助于防控病毒感染。
病毒宿主范围指病毒能感染的细胞类型或生物种类。
病毒宿主范围与传播途径常见病毒类型及其危02害通过计算机网络传播，占用系统资源，导致计算机运行缓慢或崩溃。
蠕虫病毒木马病毒宏病毒隐藏在看似正常的程序中，窃取用户隐私信息，如账号密码、信用卡信息等。
感染Office 等办公软件的宏命令，通过文档传播，破坏数据文件和系统文件。
030201计算机病毒伪装成正常应用，窃取用户隐私信息、恶意扣费、控制手机等。
恶意APP在手机屏幕上弹出大量广告，干扰用户正常使用手机。
广告软件通过蓝牙、Wi-Fi 等无线方式传播，占用手机资源，导致手机运行缓慢或崩溃。
蠕虫病毒手机病毒网络蠕虫和僵尸网络网络蠕虫利用漏洞在计算机网络中传播，占用网络资源，导致网络拥堵或瘫痪。
僵尸网络由被黑客控制的计算机组成，用于发动网络攻击、散播垃圾邮件等恶意行为。
勒索软件与恶意广告勒索软件通过加密用户文件或锁定计算机屏幕，要求用户支付赎金以解锁或恢复数据。
病毒(课件)PPT课件
抗病毒治疗
个人防护措施
使用抗病毒药物抑制病毒复制，降低病毒 载量，缓解症状，缩短病程。
提倡戴口罩、勤洗手、保持社交距离等个 人防护措施，减少病毒接触和传播机会。
国际合作与法规制定
国际组织合作
加强世界卫生组织（WHO） 等国际组织的合作，共同监 测病毒变异情况，分享防控 经验和资源。
国际法规制定
跨国信息交流
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病毒武器的防范与控制
03
国际社会应加强合作，制定严格的生物武器公约，加强防范与
控制措施，防止病毒等生物武器被滥用。
05
病毒的检测与控制
病毒的检测方法
核酸检测
利用特定引物与病毒基因片段进行 PCR扩增，通过荧光信号变化进行病 毒定性或定量检测。
抗原检测
利用抗体与病毒表面抗原结合的原理， 通过显色反应或金标法进行病毒定性 检测。
病毒对人类健康的影响
病毒如流感病毒、新冠病毒等感染人类后，会引起严重的疾病甚至 死亡，威胁人类健康。
病毒在生物武器中的作用
生物武器的发展史
01
病毒作为生物武器的发展历史悠久，如日军侵华战争期间使用
细菌战。
病毒的传播方式
02
病毒作为生物武器可以通过空气、水源、食物等多种途径传播，
造成大规模的感染和死亡。
发现
2002年，广东发生了一种原因不明的传染病，患者多出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，且具有传染性。经过专 家们的调查和实验，证实这是一种新型的冠状病毒，称为SARS病毒。
应对
政府采取了严格的隔离措施，控制疫情的传播。同时，科研人员加紧研究病毒的特性，以期找到有效的治疗方法 和疫苗。
MERS病毒的发现与应对
病毒学基础知识幻灯片
④有襄膜的RNA病毒如副流感病毒，核酸与蛋 白质在胞浆中装配螺旋状核衣壳，并在感 染过程中使病毒特异性Ag成分（如血凝素、 神经氨酸）整合于细胞膜上。当病毒以芽 生方式通过细胞膜时，获得襄膜，并产生 剌突。
第三节 干扰现象与干扰素
一、干扰现象 一种病毒（活病毒或灭活病毒）作用于宿主 细胞后，可导致另一种在免疫学上有关或无 关的病毒株不能在其中正常增殖的现象，称 病毒的干扰现象。
2、衣壳：包围芯髓的蛋白质称衣壳，为二十面体或 螺旋对称。具有抗原性、保护作用、吸附作用。 核酸和衣壳统称为核衣壳。
3、襄膜：由脂质、蛋白质和糖类组成，故对乙醚敏 感。有的病毒在襄膜外还有剌突。
4、触须：某些无襄膜的病毒所具有。
第二节 病毒的增殖
病毒缺乏生物细胞所具有细胞器、新陈代谢必须 的酶系统和能量。其增殖，只能靠宿主细胞提供 原料、能量、生物合成场所（细胞器），在病毒 核酸指控下，合成病毒的核酸与蛋白质等成分， 然后在宿主细胞内装配为成熟的具有感染性的病 毒体，再以特定的方式释放到细胞外，感染其它 易感细胞，病毒的这种增殖方式称为复制。所需 时间称为复制周期。
4、甘油和抗生素：
常用50%甘油生理盐水并加“双抗”保 存病毒病料。
二、病毒的分类
1、按病毒的性质综合来分类： 双股或单股、有无包膜、立体或螺旋体对称、
子粒多少、颗粒大小、对乙醚敏感性等方面对 病毒分类。 2、依传染途径不同分类：
呼吸道病毒、肠病毒、虫媒病毒等。
3、根据寄生宿主不同分类： 细菌病毒、植物病毒、动物病毒。
1、温度：
病毒耐寒不耐热。大多数病毒可在4℃以下 良好生存，尤其在干冰温度（－70℃）和液 氮（－196℃）下更能长期保持其感染性。 而大多数病毒于55-60℃10－30min灭活， 100℃迅速灭活。有的在室温下只能存活数 小时（流感、麻疹病毒），有的在自然界中 可存活数日或数月（肠道病毒群、肝炎病 毒）。但猪瘟Vi可耐受50℃2h，70℃1h， 100℃0.5－1h。
《分子生物学载体》PPT课件
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2.3.2 M13 噬菌体
寄主：大肠杆菌。 DNA长度：6407 bp。 外型: 丝状 组成: 由外壳包装蛋白和正链DNA组成 基因: 至少有10个基因
DNA提纯：RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝 形式存在。 成熟的噬菌体里只包装有 +DNA， 也容易提取。
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5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖
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异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
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2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 • 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一类细 菌病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞， 然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组 中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种 状态还会相互转化。
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• 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和 多酶接头polylinker
• 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异 序列，便于外源基因的整合。
• 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制 子，便于基因能在两种不同的受体细胞中 复制。
• 探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件。
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如何阅读质粒图谱
物。
（2）低拷贝数的质粒载体 不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途。
（3）温控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。
温度低（低于37 ℃），拷贝数很少； 温度增加（>40 ℃）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。
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• Primer binding site (PBS) (origin of replication) • RNA packaging signal • Poly purine tract (important for replication)
Early generations of adenoviral vector (replication defective)
Gutless Adenoviral vector (Amplicon)
Modification of the tropism of adenovirus vector
• Adenovirus fiber binds to CAR (coxsakie and
– Naked DNA (plasmid DNA): injection or genegun – Liposomes (cationic lipids): mix with genes
• Ex-vivo • In vivo
Why use viral vectors
• Virus are obligate intracellular parasites • Very efficient at transferring viral DNA into
Methods of gene delivery
• Viral Vectors:
– Adenovirus – Retrovirus – Lentivirus – Adeno-associated virus (AAV) – Herpes simplex virus (HSV)
• Non-viral vector based
• Advantages
– Integration and persistent expression – No insertional mutagenesis – Infecting dividing and nondividing cells – Safe
• Disadvantages
– Size limitation, 4.9 kb – Low titer of virus, low level of gene eor for gene therapy
• Replication-competent virus • Replication-defective virus
– Amplicon: doesn’t encode structural proteins
– Can’t replicate beyond the first cycle of infection
host cells
• Specific target cells: depending on the viral
attachment proteins (capsid or glycoproteins)
• Gene replacement: non-essential genes of
virus are deleted and exogenous genes are inserted
Adenoviral vectors
• Non-enveloped ds DNA, 36 kilobases • Early proteins (E1A, E1B, E2,E3 and E4), late proteins
(L1-L5)
• Causes a benign respiratory infections in human • Serotypes 2 and 5 are commonly used as vectors
• Disadvantages
– Transient expression ( not good for genetic diseases) – Highly immunogenic – High titers of virus can be toxic – More suitable for cancer immunotherapy
• Elements needed to generate amplicon
– Transfer Vector: plasmid (promoter, gene of interest, ori, packaging signal)
– Packaging vector (cosmid or cell lines): provide the viral structural proteins for packaging of transfer vector
– Helper virus (packaging of transfer vector): deleted Packaging signal sequence
Generation of adeno-associated virus vector
Characteristics of AAV vector
Retroviral vector
• Moloney murine leukemia virus (MuLV) • Generation of replication defective retroviral vector
– Transfer plasmid vector:
• Gene of interest • Long terminal repeats(LTR): promoter, polyA, integration,
adenovirus receptor, CAR), receptor which is ubiquitous
• Modify the fiber protein
Characteristics of adenoviral vector
• Advantages
– High titers – Both dividing and non-dividing cells – Wide tissue tropism – Easily modify tissue tropism