SILAC定量技术方案

SILAC定量技术方案

一样品制备

1.细胞培养和蛋白提取

(1).MEM培养基的准备(配制400mL)

①制备氨基酸储液：分别在20mL L-Arginine缺陷型MEM培养基中配置

0.30mM(50%正常浓度)的13C6L-Arginine hydrochloride和13C6,15N4L-Arginine hydrochloride储存液(均称取26mg)，待充分溶解后，分别用0.22μm的无菌滤器过滤。

②分别加入20mL除菌后的氨基酸储液、10%的透析胎牛血清、1%的青链霉素、2mM的L-Glutamine和2mM的丙酮酸钠并用缺陷型MEM培养基定容

到400mL，贮存于4°C。

每种完全培养基中的氨基酸浓度见表4-1：

表4-1MEM培养基中轻、中、重L-Arginine的浓度

Cell lines Amino Acids M. W.Culture Media Amount(concentration)

A L-Arginine174.2RPMI1640241.9mg/L(1.15mM)

B13C6L-Arginine216.7MEM65.0mg/L(0.3mM) C13C6,15N4L-Arginine220.7MEM65.0mg/L (0.3mM)

(2).细胞培养将A、B、C三种细胞复苏后，分别接种于10cm培养皿中，在常规RPMI1640培养基(添加10%的透析胎牛血清和1%的青链霉素)中培养HL-7702，分别使用仅含有13C6L-Arginine hydrochloride和13C6,15N4L-Arginine hydrochloride的MEM培养基培养B和C，经过5-6个细胞世代的培养后，将细胞数量扩增到107-108左右(5-6盘)。

(3).蛋白提取用500μl全细胞裂解液(50mM Tris，pH7.4；150mM NaCl；1%Triton-100；1mM AEBSF；20μl/μg aprotinin；20μl/μg leupeptin)

2.蛋白质含量测定

(1).采用改进的Bradford法，将BSA分别稀释为从0-1.40mg/ml范围内若干

浓度，待测样品稀释10倍、20倍，各取20μL加80μL0.12M HCl，轻轻混匀。

(2).各管再加入3.5ml过滤的稀释4倍的dye reagent，轻轻混匀，静置5min后测A595值。

(3).取A595值对BSA标准浓度作标准曲线，再根据待测样品的A595值，从BSA标准曲线中确定其浓度。

(4).同位素标记样品与非标记样品按照蛋白含量1:1混合。

3.SDS-PAGE分离和染色

(1).电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶;

(2).2×SDS上样缓冲液的配制：2mL Tris-HCL buffer(0.5M,pH6.8)；2mL

甘油；1mL巯基乙醇；4mL10%SDS溶液；适量水补足体积至10mL，混匀即得。

(3).电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶，先恒流10mA，运行时间0.5h，再

于20mA运行至溴酚蓝前沿到达分离胶底部。

(4).胶体考马斯亮蓝染色方法如下：用10%甲醇，7%乙酸溶液固定

30min，然后用胶体考马斯亮蓝溶液(0.12%G-250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%

甲醇)染色过夜，用蒸馏水或10%甲醇水溶液脱色，清洗胶数遍即可获得背景清

晰的染色效果。

4.胶内酶解、肽段提取

(1).用干净的解剖刀将胶按照从高分子量到低分子量全覆盖切成3-4mm宽

度的胶条，大约切成20个条带左右。然后将每个胶条切成1-2mm2大小的胶块。

(2).100μL50%乙腈/25mmol/L碳酸氢氨浸泡胶粒，超声10min，弃去溶

液，重复1-2次至胶粒的蓝色褪尽。

(3).真空离心干燥至胶粒完全脱水，加入10-15μl10ng/μL的胰蛋白酶

(25mmol/L碳酸氢铵溶解），4°C冰箱放置30-40min，吸走多余酶液或补充

25mM碳酸氢铵覆盖胶粒，37°C保温18-20小时。

(4).80-100μl5%TFA40°C提取1h，期间超声两次，取出上清。80-100μl

2.5%TFA/50%ACN30°C提取1h，期间超声两次，合并上清，离心干燥。

二质谱分析与数据库检索

1.LC-LTQ-FT分析

1).毛细管色谱系统在Agillent1100系统上进行，由自动上样器上样，上样

体积为30μl，上样流速为10μl/min；色谱洗脱在由二元泵系统上进行，洗脱下来

的组份经过ESI离子源直接进入质谱，液相色谱条件为：流动相A：0.1%FA-98%水溶液；流动相B：0.1%FA-80%ACN溶液。洗脱条件：0-90min，流动相比例由2%B 线性升至40%B；90-105min，流动相比例由40%B线性升至100%B；维持15min 后，以100%流动相A平衡色谱柱30min。流动相流速为300nL/min。

2).质谱仪为线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LTQ-

FT，Thermo Finnigan)，磁场强度为7特斯拉。雾化N2气流速(sheath gas)12

L/min；碰撞气为高纯氩气；喷雾电压(spray voltage)为3.2kV；毛细管温度(capillary temperature)为160°C；毛细管电压(capillary voltage)为2.8kV。分析柱为PicoFrit TM反相柱(BioBasic C18,5μm,75μm i.d.x10cm,15μm i.d.spray tip,New Objective,Woburn,MA,USA)。一级质谱的数据依赖的二级质谱扫描模式(Data Dependent MS/MS Scan)；依次选取一级质谱中离子强度最强的5个离子进行CID

二级串联质谱。采用串联质谱扫描的动态排除功能(dynamic exclusion)，设置排

除时间为3min。离子自动增益控制设置为：一级质谱扫描为5×105个电荷，二级

串联质谱为1×104个电荷。一级质谱的在m/z为400处的分辨率为100000。离子传输毛细管温度为200°C；从电喷雾电压1.8KV。二级串联质谱母离子窗口为

4Da，归一化碰撞能量为35%；质谱的一级全扫描质荷比范围是400－2000(Mass range，m/z400-2000)。

三．数据库检索

1.应用DTA supercharge将raw文件转成mgf文件

(1).DTAsupercharge软件可以从网上下载,,网站定

期有版本更新。

(2).安装前需要安装Xcalibur，Bioworks，不同版本的DTAsupercharge对Xcalibur的版本要求不同。安装时若版本不符会有提示。安装Xcalibur时要安

装XDK功能，见下图