试验七过氧化氢酶活力的测定

实验七过氧化氢酶活力的测定

一、实验目的

掌握过氧化氢酶活力测定的原理和方法

二、实验原理

过氧化氢酶（catalase,CAT,EC1.11.1.6）普遍存在于植物的各种组织中，其活力大小与植物的代谢强度和抗寒、抗病能力有一定的联系，故常需进行测定。

过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为：

过氧化氢酶

2H2O2-------------------------2H2O+O2

钼酸铵

H2O2+2KI+H2SO4------------------------I2+K2SO4+2H2O

I2+2Na2S2O3-------------2NaI+Na2S4O6

反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。

三、仪器、试剂和材料

1、仪器：天平，研钵，容量瓶，恒温水浴，移液管，三角瓶，滴定管。

2、试剂：

（1）0.01mol|L的过氧化氢溶液；

（2）1.8mol|L的硫酸溶液；

（3）10%钼酸铵溶液；

（4）0.02mol|L硫代硫酸钠溶液；

（5）1%的淀粉溶液；

（6）20%的碘化钾溶液；

（7）碳酸钙粉末。

四、操作步骤

1、酶液提取：称取新鲜油麦菜0.25g，剪碎置研钵中，加入0.1g碳酸钙和2mL水研磨成匀浆，用漏斗移入50mL的容量瓶，研钵用少量的水冲洗，冲洗液也一并移入容量瓶中，

然后用水定容。摇荡片刻，静置澄清后吸取20.0mL上清液至100ml容量瓶中，加水定容，摇匀后备用。

2、取三个100mL三角瓶编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10.0ml，随即在3号瓶中加入1.8mol|L硫酸5.0ml以终止酶的活力，作为空白溶液。各瓶均加入5.0mL0.01mol|L过氧化氢溶液，每加一瓶即摇匀并开始记时。5min（必须准确）后立即向1、2号瓶各加5.0mL1.8mol|L硫酸溶液。

3、各瓶分别加入1.0mL20%的碘化钾溶液和3滴钼酸铵溶液，然后依次用0.02mol|L的硫代硫酸钠滴定，滴定至溶液淡黄色后加入5滴1%的淀粉溶液，再继续滴定至蓝色消失即到终点，记下各瓶消耗的硫代硫酸钠的体积。

五、结果处理

1、按国际酶活力单位计算

被分解的过氧化氢量（µmol)=1|2 x V Na2S2O3(空白滴定值- 样品测定值）（mL) ×10-3×0.02 x106

被分解的过氧化氢量（µmol) x酶液稀释倍数过氧化氢酶活力（U)=---------------------------------------------------------------

时间（min）x 样品重量（g）

2、酶活力的习惯计算法

被分解的过氧化氢量（mg)=V Na2S2O3（空白滴定值- 样品滴定值）（mL) ×0.02 ×1|2 ×34.02

被分解的过氧化氢量（mg) x 酶液稀释倍数过氧化氢酶活力=---------------------------------------------------------------

样品重量（g) x 时间（min）

其中0.02为硫代硫酸钠的物质的量浓度，34.02是过氧化氢的摩尔质量。

六、思考题

查阅文献，说明测定过氧化氢酶活力的方法有哪些，原理各是什么？

参考资料

郭蔼光，郭泽坤.生物化学实验技术.北京：高等教育出版社，2007:77-79.