生物大分子的提取讲课讲稿
生物化学分析课件第1章生物大分子的分离纯化技术
授课内容及学时分布
理论课 32学时
实验课 16学时
2020/8/1
授课内容 生物大分子分离纯化技术 电泳 酶法分析 免疫分析 氨基酸、蛋白质分析 酯的分析和糖的分析 核酸分析和流动注射分析 过氧化物酶的米氏常数测定 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 酶联法测定血清中葡萄糖的含量 脱辅基血红蛋白的制备与重组
2020/8/1
第1章 生物大分子的分离纯化技术（2）
生物大分子分离纯化的特点与要求
特点：生物材料组成极其复杂，常包含几百乃至几千种化合物； 许多生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤繁多；许多生物大分 子离开生物体内的环境时极易失活，如何防止分离过程中失活是生物 大分子提取制备最困难之处；生物大分子的分离纯化几乎都是在溶 液中进行，温度、pH值、离子强度等参数的综合影响难以准确估计 和判断。
光等分光光度法）、气相色谱和液相色谱法、电泳法、核磁共 振及质谱法等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速 、简便。
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3. 生物大分子的物理、化学性质
在水和各种有机溶剂中的溶解性； 在不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性； 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性； 各种物理性质如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电
蛋白质、酶、核酸与多糖等生物大分子是生命现象的基本体现者，其 结构与功能的研究，对于了解生命活动规律，阐明生命现象本质，指 导工业生产和医药实践，以致整个自然科学都有着重大的理论和实践 意义。 生物大分子结构与功能的研究，是以能够达到足够纯度的生物大分子 的制备工作为前题，否则就无从谈起。 随着生命科学飞速发展对各种专一的工具酶、基因载体质粒、基因片 段等生物制品的需求，使得从各种来源的生物材料中分离、制备各种 规格的大分子并采用高特性方法进行快速灵敏的测定成为一个非常迫 切的要求。
生物大分子提取技术
物活性。
希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总
4、收率：
5、速度：
有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。
越快速越好。
DNA的提取纯化
本质：将DNA从组织或
细胞中分离沉淀出来。 要求：去除杂蛋白、多糖、 脂类等大分子杂质，同时 要快速简便。 常用的提取方法： 酚-氯仿提取法
蛋白质是生物功能的执行者
担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生
长调控以及记忆、识别等多种生理功能。
核酸-DNA与RNA结构
脱氧腺嘌呤核苷A
A-T对
G-C对
5’C G A A TCAGAA3’ 3’G C T T AGTCTT5’
双链DNA
高级结构
核酸的性质
DNA:双螺旋; RNA单链
预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的 结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生
物需要将菌体与发酵液分开。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
二、组织细胞的破碎
应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大 分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放 出来，并保持原来的天然状态和生物活性。
生物大分子分离纯化的一般程序
①材料的选择和预处理
②破碎细胞及提取（有时还需
要进行细胞器的分离）
③分离纯化：包括粗分级分
离和细分级分离
其中前两个阶段为生物大分子
分离纯化的前处理。
一、材料的选择与预处理
选材，科研选材则无需考虑上述问题，只要能 达到实验目的即可。临床选材则要考虑病人的依 从性。
了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染， 还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某 一物质。
生物分子的分离纯化课件
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
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（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估 计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响
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（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
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2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提 法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的 甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质）， 然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和 有机溶剂。
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生物大分子制备的一般步骤：
确定制备的目的和要求 建立相应的可靠的分析测定方法
科研、开发或 发现新的物质
制备的关键
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便
文献调研和预备性实验
掌握目的产物 的理化性质
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生物大分子的分离与纯化省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件
3）透析法纯化过氧化氢酶:将沉淀重溶于 0.05mol/L旳磷酸缓冲液(pH=7.2) 中, 4 ℃ 透析过夜,然后按1∶1旳百分比向透析液中 加入预冷旳正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜. 然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇 层,反复2次,得粗酶液.
2.DEAE2Sep haro se 离子互换层析： 用磷酸缓冲液(0.05 mol/ L , p H =7.2) 平衡 至少4 倍柱体积(20 mL) , 上样5 mL . 用0～1 mol/ LNaCl溶液(含0.05 mol/ L , p H =7.2 旳 磷酸缓冲液) 进行梯度洗脱, 流速30 mL/ h , 每管搜集5 mL , 紫外监测波长为280 nm ; 测 定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量; 搜集活 性较高旳各管酶液, 4 ℃透析过夜, 冷冻干燥 后进行凝胶过滤.
1.粗酶液旳制备：1）称取新鲜鸭肝100 g , 用自来水 洗净, 再用消毒双蒸水漂洗洁净. 按1:5 旳百分比加 入预冷旳0.05 mol/ L 旳磷酸缓冲液(p H 7.2) , 用高 速组织捣碎机捣碎, 置于4 ℃冰箱抽提2 h ; 离心(6 000 r/ min ,4 ℃, 30 min) , 搜集上清液。 2）盐析法粗提过氧化氢酶:加入硫酸铵至40 %饱和 度, 离心(6 000 r/ min , 4 ℃, 30 min) 去沉淀, 上清中 再加硫酸铵至60 %饱和度, 离心搜集沉淀。
试验原理
1.离子互换层析原理:固定相为离子互换剂， 是利用离子互换剂对多种离子有不同旳亲 和力，来分离混合物中多种离子旳层析技 术。
2.凝胶过滤层析原理:也称分子筛层析、排阻 层析。是利用具有网状构造旳凝胶旳分子 筛作用，根据被分离物质旳分子大小不同 来进行分离。
3.电泳法旳基本原理:电泳（electrophoresis）是指 带电荷旳溶质或粒子在电场中向着与其本身所带 电荷相反旳电极移动旳现象。物质分子在正常情 况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不 显示带电性。但是在一定旳物理作用或化学反应 条件下，某些物质分子会成为带电旳离子（或粒 子）。不同旳物质，因为其带电性质、颗粒形状 和大小不同，因而在一定旳电场中它们旳移动方 向和移动速度也不同，所以可使它们分离。
生物大分子(糖类)的分离提取
糖类分类纯化
设计流程：
脱脂—除杂—浓缩—再次去杂—脱色—浓缩—冷却—结晶—进一步纯化
设计方案：
1、脱脂：由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。
2、提取：
①稀碱液浸提法
适合用此方法的多糖主要是不溶性胶类，用冷水浸润红0.5mol/L NaOH提取，提取液用酸中和后浓缩，再加乙醇沉淀即得到多糖。
②温水提取法
对于易溶于温水、难溶于冷水和乙醇的多糖采用这种方法。
材料需要先用冷水浸过，再用热水提取，必要时可加热至80～90℃，搅拌提取，提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白，离心除去杂蛋白的清液，透析后用乙醇沉淀即得到多糖。
3、除杂：
①除蛋白质——沙维积法（Sevag法）
利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇=5：1（V/V）]5：1 混合，振荡，离心，
变性后的蛋白质介于提取液与Sevage 试剂交界处。
此法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。
②除色素：活性炭除色素；
③除低聚糖等小分子杂质：逆向流水透析法。
4、纯化：
①分部沉淀法
由于不同相对分子质量的多糖在不同浓度的低级醇或低级酮中溶解性不同，可以逐步提高溶液中醇或酮的浓度以使不同组分的多糖依相对分子质量由大到小的顺序沉淀，最终达到分离的目的。
②盐析法
利用不同多糖与金属离子成盐后在水溶液中的特异性沉淀作用，用硫酸铵、乙酸钾、氯化钾等盐析剂，将不同的多糖逐步析出。
从生物样品中分离纯化生物大分子ppt课件
4.生物材料的处理：生物大分子来源通常为生物组织 或微生物菌落，首先需要破碎组织。
4.1机械法： 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加
入少量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，
通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用 10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速 分散器)将组织的细胞打碎。(植物微生物）
（2） 防止核酸生物降解 DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂 RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；
复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物
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5.1.2 分离纯化的步骤： (1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质，蛋
白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。 (2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶
5.3.2 多糖的分离纯化：
(一）从生物样品中分离纯化生物 大分子方法
1.提取对象选择
2.制5.生物大分子提取方法
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1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类， 和目标分子的位置。
2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离 高纯度目标分子的方法。
3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料 掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离 途径、
对该酶的特性结果及分子量不 明确，无法利用分子量差异分 离，但可以利用其等电点完成 分离。鉴定过程中利用SDSPAGE电泳技术可以鉴定亚基情 况是否是符合要求。
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概述
1.课题研究背景 2.课题研究内容及创新点 3.课题技术路线 4.仪器及试剂 5.前期研究基础或预实验结果
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生物大分子分离纯化-原理与技术
MacroPrep High Q,High S,DEAE,CM
Bio-Beads S-X介质
➢亲和层析
➢羟基磷灰石介质（CHT）
Profinity IMAC金属螯合介质 Profinity Epoxide环氧亲和介质 Affi-Gel Protein A, Affi-Prep Protein A Affi-Gel蓝胶，DEAE蓝胶，CM蓝胶 Affi-Prep多粘菌素介质
CHT 羟基磷灰石
层析原理与操作
• 最广泛的蛋白质分离纯化方法 – 条件温和 – 维持蛋白质空间结构与活性
• 基于蛋白质对固定相的不同保留达到分离 • 蛋白质溶于流动相中，经过装填固定相的柱子分离
8 精品课件
2020/8/16
层析的5个操作步骤
• 装柱并平衡 • 上样 • 平衡 • 洗脱 • 再生
50.0 0.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.0 -0.010
00:00:00 AU
5 精品课件
Fractions
01:00:00
Hr:Min:Sec
02:00:00
2020/8/16
0.500 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 -0.050
19精品课件
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层析介质结构原理
Unosphere MacroPrep
离子交换层析 Q，S，DEAE，CM
Unosphere Q, S MacroPrep High Q, S MacroPrep DEAE, CM
Vt
有时这里也显示梯 度浓度等检测值
基线
时间或体积，x轴
DNA的提取与鉴定讲解ppt课件
4D不 溶、N解同AD，，和NA而利蛋的当m大D一液在m随逐时ND使用N白o中，氯Na原o溶N，N渐lAC杂这lA／溶浓化质/aa理l的D降L的溶解CC质L解度钠一时N等，ll溶时低溶液溶溶A或为性的沉特，可其解，；解浓溶液液析物淀D以点0D度他在度度解浓浓出质．NN，使最，0又继成度度度A的1A.或D14的低续逐选的最的低量分4N者m。溶增渐溶小浓增于择A在mo相利 在加度增解解；加0ol适不／.l1为用 盐度时大反当而度/4当LL同时最这 溶， 。2的浓，盐度浓的度Na就C能l溶使液D中N溶A解充度分
4.DNA的再溶解。 用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。
5.DNA的沉淀和浓缩。
对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进 一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na＋的 DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可 以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物， 悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰 箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒 （玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。
3.DNA的鉴定： 加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水 浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。
三、实验小结
1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”
2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”
四、实验原理拓展介绍。
1.DNA的释放。 DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释 放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以 大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌 的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释 放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放 的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。 2.DNA与蛋白质分离。 在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解， 析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中 3.DNA的析出与获取。 因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解 度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含DNA 的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶 液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。
生物大分子的分离与制备详解演示文稿
生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难 的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的 鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电 泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个 峰。 产物的浓缩，干燥和保存。
第十五页，共85页。
生物大分子分离纯化的一般步骤和原则
第二十二页，共85页。
2.植物材料：
选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含 生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。
种子须泡胀或粉碎才可使用。 含油脂较多的也要进行脱脂处理。
a.提取核DNA：选用黄化苗（生长7－10天小麦， 水稻），防止叶绿体DNA的干扰
b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。 保存：冷冻采样后尽快放于－4℃――20℃冰箱 内。 DNA,RNA 采样后，N2速冻，至－70℃冰箱。对RNA 样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。
7. 基因克隆8. 基因组构建9. cDNA构建
10. 筛选11. 报告基因检测12. 基因芯片
13. 基因敲除
14. RNAi
15. 转基因动物
第九页，共85页。
生物大分子相互作用分析:
• 生化反应过程实际上是生物分子间的相互作 用过程。生物大分子间的相互作用是它们的 功能基础。随着分子生物学研究的进展，建 立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 术。
生物大分子的分离与制备详解 演示文稿
第一页，共85页。
优选生物大分子的分离与制备
第二页，共85页。
生物大分子 的提取与制备
第三页，共85页。
引
言
❖生物化学研究的三个主要发展阶段：
• 叙述生物化学阶段（1770～1903 年）。又称为静态或形 态生物化学，研究内容以分析生物体内物质的化学组成、 性质和含量为主。
生物大分子的提取与沉淀分离技术课件
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三 核酸的沉淀分离
* 温度： o~4C ，防止变性和 降解 * 加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水解 * 1 有机溶液沉淀法 * 乙醇 * 2 等电点沉淀法 * 3 钙盐沉淀法(氯化钙＋乙醇) * 4 选择性溶剂沉淀法
径等)、蛋白结构有关 * ks越大， 盐析效果越好 * I=(1/2)∑mizi2 * 一定条件下， S取决于I * 分段盐析： ks分段盐析( β一定， pH 、T一定)；
β分段盐析( ks 、I一定，改变pH 、T)
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* 3.1.2盐的选择 * 通常采用中性盐，最常用( NH4 ) 2SO4 ，原因： * 水中S大，温度对S影响小，廉价易得，不易引起蛋
白质变性，分段效果好。
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3.1.3盐析注意事项
* (1)
* (2)
淀配合；
* (3) * (4) * (5)
盐纯度高，沉淀完全后再分离； 分段盐析分离几种蛋白质，与等电点沉
室温或低温进行； 选择合适浓度的样品； 脱盐(透析、电渗析、凝胶层析、超滤)
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* 3.2 等电点沉淀法 * 3. 3有机溶剂沉淀法 * 常用丙酮、异丙酮、乙醇、 甲醇等 * 适用范围： * 缺点：易变性 * 操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加少量无机盐，
* DNA- Pro.与RNA- Pro.在不同浓度电解质溶液 中 溶解度有明显差别：
* 0.14mol/L NaCl: RNA- Pro. 溶解度相当大， DNAPro.溶解度仅为水中1％。
* 1 mol/L NaCl: RNA- Pro. 溶解度小， DNA- Pro. 溶解 度比水中大2倍。
提取生物大分子
沉淀法原理： 由于不同相对分子质量的多糖在不同浓度的低级 醇或低级酮中溶解性不同，可以逐步提高溶液中 醇或酮的浓度以使不同组分的多糖依相对分子质 量由大到小的顺序沉淀，最终达到分离的目的。
盐析法原理： 利用不同多糖与金属离子成盐后在水溶液中的特 异性沉淀作用，用硫酸铵、乙酸钾、氯化钾等盐 析剂，将不同的多糖逐步析出。
*
除杂
Seveg法
三氟三氯乙烷法 三氯乙酸法
酶法
等电点沉淀法
二、纯化方法（ depuration） 由于提取液还含有多种组分的多糖混合物， 因此需要进一步纯化。其方法有： （1）沉淀法（常用乙醇沉淀法） （2）盐析法 （3）季铵盐沉淀法 （4）纤维素柱层析法 （5）离子交换层析法 （6）金属配合物法
*
*
*前期准备
初级提取分离 精细分离纯化 生物材料的选择 及预处理 组织与细胞破碎 纯度鉴定
产物处理
糖类制品的分离及纯化 Isolation and depuration of sugar
制备如下： 脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→脱色 →浓缩 →冷却 →结晶 （→进一步纯化）
*
多糖原料可从动植物器官、菌类及微生物发酵产物中得到。 一般多糖的分离纯化工艺： 一、分离提取方法 (extraction) （1）脱脂 由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。
*1 核酸分离、纯化原则 核酸分离、
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中 核酸的— 全部储存在一级结构之中， 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还
决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
生物大分子的提取
最佳答案2.1 概述在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。
然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。
③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。
④生物材料的破碎和预处理。
⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
⑦产物的浓缩，干燥和保存。
分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。
生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
生物大分子分离与提取 实验教学方案
生物大分子分离与提取实验教学方案实验一鸡蛋黄中卵磷脂的分离、纯化与鉴定实验目的：•了解从生物组织中提取生物分子的一般原理和方法•掌握从鸡蛋黄中提取卵磷脂的原理和方法•掌握卵磷脂的鉴定方法实验材料、药品与设备：•鸡蛋，水浴锅，真空泵，蒸发皿，试管，研钵，氢氧化钠，硫酸铜，乙醇，丙酮，氯仿实验原理：•卵磷脂是生物膜的成分，具有多种生物功能，鸡蛋黄中卵磷脂含量高达8%。
卵磷脂、脂肪都溶于乙醇，而蛋白质、脑磷脂等在乙醇中形成沉淀，因此用乙醇溶液将蛋黄分成两部分。
卵磷脂溶于氯仿而不溶于丙酮，因而可用丙酮将卵磷脂沉淀。
实验步骤：1．卵磷脂的提取：•第一步：1个鸡蛋，煮熟，取蛋黄，研钵中研细，加95%乙醇15ml，再研磨，搅拌均匀。
减压过滤，收集滤液。
残渣移入研钵内，再加同量乙醇，研磨，过滤。
将两次滤液合并。
（注意：滤液应当完全透明）•第二步：将滤液集中到蒸发皿里，将蒸发四置于沸水浴上以蒸发掉乙醇，得到黄色油状物（注意：属于脂类混合物）。
•第三步：冷却后，加入2-3 ml氯仿，搅拌使溶解（注意：各种脂类都溶解于氯仿）。
•第四步：边搅拌边加入10-15 ml丙酮，卵磷脂析出。
搅动使其粘附于玻棒上，溶液倒入回收瓶内。
（注意：所用技术为有机溶剂沉淀法）2. 卵磷脂的鉴定•（1）卵磷脂的水解：将卵磷脂转移到试管内，加入5 ml 10%氢氧化钠溶液，放入沸水中加热10 min，用玻棒搅拌，卵磷脂水解。
冷却后，在玻璃漏斗中用棉花过滤。
收集滤液备用。
•（2）脂肪酸的检查：取棉花上的沉淀少许，加5ml水，搅拌，有何现象？过滤，滤液中加入浓硝酸，再滴10%醋酸铅溶液，观察有何现象？•（3）甘油的检查：取小试管一支，加入1滴5%硫酸铜溶液，2滴10%氢氧化钠溶液，振荡，产生氢氧化铜沉淀。
再加入水解液，沉淀溶解，得深蓝色甘油铜溶液。
•（4）胆碱检测：取1ml水解液，滴加浓硫酸，至中和（用蓝色石蕊试纸检查），然后加克劳特试剂1滴，产生夸红色沉淀。
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生物大分子的提取最佳答案2.1 概述在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。
然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。
λ与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：λ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
λ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。
λ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。
λ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
λ生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：λ①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
λ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。
λ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。
λ④生物材料的破碎和预处理。
λ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
λ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
λ⑦产物的浓缩，干燥和保存。
λλ分析测定的方法主要有两类：λ即生物学和物理、化学的测定方法。
λ生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；λ物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
λ实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。
λ要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
λ②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。
λ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
λ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
λ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
λ⑥对其他生物分子的特殊亲和力。
λ制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。
λ各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：λ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；λ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。
λ目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。
λ 2.2 生物大分子制备的前处理λ2.2.1 生物材料的选择λ制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。
材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。
λ选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。
λ动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
λ植物要先去壳、除脂。
λ微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
λ生物材料如暂不提取，应冰冻保存。
动物材料则需深度冷冻保存。
λ2.2.2 细胞的破碎λ不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
λ (1)机械法：λ1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。
λ2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。
λ(2)物理法：λ1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
λ2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。
破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。
λ3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。
在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
λ4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。
在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
λ(3)化学与生物化学方法：λ1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。
λ2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
λ 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。
λ4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
λλ2.2.3 生物大分子的提取λ“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。
λ影响提取的因素主要有：λ目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；λ由固相扩散到液相的难易；λ溶剂的pH值和提取时间等。
λ通常：λ极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；λ碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；λ温度升高，溶解度加大；λ远离等电点的pH值，溶解度增加。
λ提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
λ⑴水溶液提取：λ蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。
稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。
用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：λ1) 盐浓度（即离子强度）：λ离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。
λ绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。
盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。
λ为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。
向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
λλ2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。
过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
λ3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
λ4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。
λ5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。
因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。
在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。
λ⑵有机溶剂提取λ一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。
λ常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。
λ有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。
λ例如，胰岛素（见讲义p36）。
2.3 生物大分子的分离纯化λ由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
λ为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：λ沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
本章以介绍沉淀法为主。
λ2.3.1 沉淀法λ沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
λ其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
λ在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：λ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
λ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
λ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
λ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
λ⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
λ2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）λ在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。