western blot实验步骤
western blot 实验步骤
Western blot 之生理宝典样品的制备1. 收细胞1.1 从-20℃取出细胞裂解液和蛋白溶解酶抑制剂片剂，每2毫升细胞裂解液加四分之一片蛋白溶解酶抑制剂片剂,置于4℃冰上，此步骤需新鲜配制；1.2 取出灭菌EP管，做好标记，置于4℃冰上；1.3 取出六孔板（含有培养细胞），去培养基，每孔用10ml移液管加入4℃PBS 1ml，移去，每孔用移液枪加入60-100微升细胞裂解液（已加入蛋白溶解酶抑制剂）,吹打，用细胞刮将贴壁细胞刮下，吹打，用移液枪吸到已标记的EP管中，置于4℃冰上，注意细胞刮每次刮完一孔用纸巾擦净，再刮下一个，刮的时候要保证各个方向都刮到。
1.4 如需保存，将EP管置于-80℃。
2. 收组织2.1 向放有组织的EP管中加入细胞裂解液（含PMSF），每250mg组织加入1ml裂解液，不足100µl的，补至100µl。
2.2 将含有裂解液的组织用干净镊子或小剪刀剪碎，越碎越好。
（冰上操作）3. 提蛋白3.1 将含有裂解液的细胞液或组织悬浊液用超声仪裂解（4℃冰上操作），每支离心管超声10次，每次1s。
每管超声后，超声仪金属头部需用PBS或蒸馏水清洗（洗瓶清洗），再用滤纸吸干。
超声仪金属头部不可插入EP管过深，否则会有细胞液溅出。
3.2 充分裂解后，4℃、12000r离心10min，取上清，快速加入到已标记的EP管中。
4. 测蛋白浓度4.1细胞蛋白液细胞密集时，则从原液中抽出5µl，再加30µl PBS，稀释7倍；细胞稀疏时，则从原液中抽出7µl，再加28µl PBS，稀释5倍。
剩余母液放入4℃。
4.2 组织蛋白从原液中抽取2µl，再加38µl PBS，稀释20倍。
剩余母液放入4℃。
4.3 用倍倍稀释法，制作标准蛋白梯度，即0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025µg/µl标准蛋白4.4 在96孔板内加入BCA工作液，每孔100µl，再将各浓度标准蛋白和稀释样品点入含有BCA液体的孔内，每孔10µl（BCA工作液配制时需要多配，以防不够用）。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
western blot实验步骤
一、提取组织蛋白新鲜肺组织取20-30mg，减去气管，组织匀浆机研磨，100W超声3S，12000r/min离心37℃孵育30min，测OD562。
按所得结果定量到50微升计算上样量，将20微升上清分装到一个1.5ml的EP管，加5微升上样缓冲液，-20℃冻存。
二、煮样95℃，煮10min,待温度降到室温关闭机器，煮后的组织离心7500r/min，1min备用三、安装玻璃板，倒入电泳缓冲液，拔梳子，用进样针吸取计算的上样量上样，装好正负极，倒满电泳液，设置80V，30min跑条带，结束后100V，60min，没跑到底酌情延长时间(30min)，准备转膜所需工具：1.剪好6片滤纸，转膜液湿润海绵及滤纸，赶气泡。
2.PVDF膜，准备甲醇激活膜2min，蒸馏水5min电泳时间到关闭电源，取出玻璃板，准备切胶，切好后，按形状切稍大一圈的PVDF膜，覆盖到切好的胶上，标记好上下。
安好夹子，放入电泳槽准备转膜，转膜需冰浴。
四、转膜结束后，将膜取下，TBST清洗3遍，每遍5min。
五、7%牛奶（1.75g，加TBST 25毫升）,封闭2小时，慢摇。
六、封一抗内参：β-actinα-SMA:1：10000配制波形蛋白：1：5000制备杂交袋，放入膜，滴入抗体，封口，4℃过夜七、将过夜的膜放入37℃恒温箱中孵育30min，结束后回收一抗，标记好第几次用，TBST清洗膜3遍，每遍10min。
八、封二抗：羊抗兔HRP(1：5000)稀释，配制10ml，慢摇1小时后回收二抗，标记好第几次。
TBST清洗膜3遍，每遍15min。
九、1：1配制发光液（避光保存），准备眼科镊、滤纸、托盘、曝光，先曝背景再报条带，先自动后手动。
Western blot实验步骤
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
WB实验步骤
Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
western blot实验步骤
蛋白质的提取（整个过程冰上进行）一．组织膜蛋白裂解液bufferA+1%蛋白酶抑制剂蛋白保存液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平4.差速离心33000-35000转（45000g）30min5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存二．组织总蛋白裂解液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存三．细胞总蛋白裂解液RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右4.重复上步4-6次5.4°C离心13500转15min6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。
Western blot实验步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）是蛋白质 分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本 身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在 PAGE 中加入阴离子去污剂 SDS, SDS 将蛋白质的二硫键、氢 键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS 将包裹在变性 蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDS带 有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这 样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS 量，而 SDS 与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比， 即迁移率决定于蛋白质分子量大小 。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 5. 10×电极缓冲液：称取Tris 30g、甘 氨酸144g，加入10％SDS 100ml，定容至 1000ml, pH8.8
• 6. 2X样品缓冲液:甘油2ml（或称取蔗糖2g ），加 入10％SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、 ß －巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。 • （加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, 可以自由通过凝胶孔径, 所以它显示着电泳的前沿位 置,当指示剂到达凝胶底部时, 即可停止电泳）
• 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。
western blot实验实验步骤
western blot实验实验步骤
Western blot实验步骤如下：
收集蛋白样品：使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
SDS-PAGE凝胶配制：参考一些文献资料进行配制。
样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
上样与电泳：将处理后的蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
Western Blot实验步骤
Western Blot实验步骤蛋白抽提①把组织剪切成细小的碎片。
②融解Western及IP细胞裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
③按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解液不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量）。
④用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
在冰上放置30min。
⑤充分裂解后，4o C 13000g离心30分钟，取上清，其中一部分按1uL样品+4uLPBS 稀释后取2uL用于测蛋白浓度。
另一部分煮沸10分钟-20o C保存。
蛋白质定量：采用BCA蛋白测定法①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品，取10微升稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/mL。
用PBS稀释标准品。
③将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20微升加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。
④加上述稀释5倍的样品2uL加到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液，37o C放置30分钟。
注：也可以室温放置2小时，或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低，适量在较高温度孵育，或延长孵育时间。
⑥测定A562的波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳①根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶：本实验浓缩胶为3.9%，分离胶为8%和10%。
使用Whatman 3 mm 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制浓缩胶。
用10mL注射器将浓缩胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。
加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。
放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。
随后轻轻加3ml乙醇液封页面。
静置30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。
取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。
（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。
2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。
(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
Western blot实验流程
Western blot一.仪器及器皿：棕色广口瓶5个(50ml)，灭菌，烧杯3个灭菌，EP管，枪及枪头，分光光度计，超声破碎机，冷冻离心机，灭菌0.9%生理盐水，冰，灭菌水(1000ml)，两套灭菌器械。
二.药品配制：1.TBS×10(Tris Buffered Saline)：2.42 g Tris base8g NaCl100ml H2O, 用HCl调pH 7.6，4°C保存.(配TBST用)TBST=TBS+0.05%Tween 2．TBS：0.303 g Tris base0.4383g NaCl (150mM)0.05gSDS用HCl调pH至8.0(配裂解液用)，50ml约用2.1mlHCl。
3．0.5M Tris-HCl(pH6.8),50ml,:3gTris-base加灭菌水约30ml,用6N盐酸缓缓调pH至6.8（约用1ml），定容至50ml，4℃保存。
(若调小了，用5.6%NaHCO3调回) 。
1.5M Tris-HCl(pH8.8),50ml,9.08gTris-base加灭菌水约40ml,用6N盐酸缓缓调pH至8.8（约用2ml），定容至50ml，4℃保存。
4．5×Running buffer pH8.3,500ml：Tris-base 7.5g,Glycine(甘氨酸) 36g,SDS 2.5g加灭菌水至500ml, 4℃保存,用时若有沉淀析出可提前拿出置37℃，不用调pH值，用时按1：5稀释，即60ml的5×Running buffer加入240ml水。
5．30%acrylamide(丙稀酰胺贮液)：8.76g acrylamide, 0.24g N, N'-methylene-bisacrylamide(亚甲基双丙烯酰胺)，加少许灭菌H2O搅匀，最后定容至30 ml 。
用0.45 µm的过滤器过滤后4°C避光保存6．10%SDS：5gSDS+50 ml H2O,(难溶，需较长时间)，常温保存。
Western_Blot实验方法步骤
Western_Blot实验方法步骤Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n样品制备n电泳分离n蛋白的膜转移n免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐 (TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH 为 7.6n脱脂奶粉或BSAn甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗) Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western blot实验步骤
Western blot实验步骤（1）将玻璃板刷洗干净，用双蒸水冲净，凉干。
配10%过硫酸铵（最好先用现配）。
在凝胶架上安装玻璃板，带有凹槽的向里。
加入少量的去离子水，看是否漏水。
如漏，则重新安装；不漏，则开始配胶。
（2）配分离胶胶、灌胶、水封面。
配12％的分离胶：凝胶储存液2 ml，分离胶缓冲液1.25 ml，双蒸水1.75 ml，10％APS 25μl，TEMED 2.5μl。
轻轻振荡溶液使混匀（过量气泡会影响胶聚合）。
用1000µl枪注胶。
如分离胶液面不平，用手振荡一下凝胶架,振平胶面[19]。
然后用200µl枪在胶上面加去离子水封面（沿玻璃板横着遛着加，避免水冲面），可加至水满这样可将胶表层小气泡赶出。
待分离胶凝固后（约15分钟会再次重现折光面，再过5分钟等胶充分凝固）倾去水并用滤纸吸干。
（3）配5％的浓缩胶：凝胶储存液0.575 ml，浓缩胶缓冲液0.1675 ml，双蒸水0.25 ml，10％APS 7.5μl，TEMED 1.25μl。
配置浓缩胶，用1000µl枪将其缓慢加入到分离胶上面，然后插上梳子，要避免气泡（插梳子时，可将梳子稍倾斜）。
浓缩胶凝固后，样品中用加入上样缓冲液，在沸水浴中煮5-7 min取出，放于冰上冷却至少5 min。
之后10 000 g离心10 min除去不溶杂质。
玻璃板转移至电泳槽中，加少许缓冲液检查是否漏。
如漏，卸下重新安装；不漏，慢慢加电泳缓冲液至加满内槽。
垂直拔出梳子。
然后用20µl枪将样品逐一加入，取15µl 样品上样。
完毕后续加电泳缓冲液，液面要低于分离胶面2 cm，并把内槽中补满液体（电泳缓冲液应在冰箱中提前放置一段时间预冷）。
然后装上电泳仪，将电压量程调为600 V。
先于80 V电压下电泳11 min左右，待样品压成一条线并即将进入分离胶时，切换至120 V电压。
当溴酚蓝刚跑出分离胶时，切断电流。
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
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Western bolt
一、实验目的
通过实验了解western blot技术的原理和操作。
二、实验原理
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。
NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。
第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。
显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。
二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。
三、实验器材
1.电泳槽，胶板架子
2.转膜仪
3.NC膜
4.电泳电源
5.滤纸
6.摇床
7.X射线摄影暗匣
8.X射线胶片
9.塑料薄膜
四、实验试剂
1.runningbuffer
5xrunningbuffer(1L)
Tris 15.1g
Glycine 94.0g
SDS 5.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释5倍
2.Transfer buffer
10×Transfer buffer(1L)
Tris 30.3g
Glycine 144.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇
3.TBS
10×TBS(500mL)
Tris 12.1g
Nacl 40.0g
ddH2O 定容至500mL
用HCl调节溶液的pH值至7.6
4.TBST(1L)
1×TBS:Tween-20=1000:1
ddH2O定容至1L
5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)
脱脂奶粉 2.5g
TBST 定容至50ml
6.一抗溶液
7.二抗溶液
8.显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。
9.SDS-PAGE（配方见下一页）
五、操作步骤
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.1SDS-PAGE胶的配置
①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。
②准备好试剂。
③计算所需要使用试剂的量。
例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要7ml，10块胶，共需要70ml
④将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。
较高的板有正反之分，上面的“up”朝上。
⑤准备配胶按照上面配方依次添加。
注意：1.添加量少的试剂要注意混匀
2.TEMED，APS要最后加
⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。
注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越是浓度高的胶液凝的越快。
⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面，注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢
不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。
⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。
凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。
⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。
配好后倒胶。
每块胶用约3ml。
注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。
且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。
A.分离胶
B.浓缩胶
1.2 凝胶电泳
①将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净，把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。
注意：胶板较短的一侧朝内。
②往电泳槽内注入running buffer，如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要将running buffer加超过上样孔，但也不要漫过胶板最上方。
③根据自己需求上样。
④盖上电泳槽的盖子，注意电极的正负。
插上电源，打开电源，设置时间和电压。
一般需要设置两次时间，浓缩胶100v，0.5h；分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。
分离胶浓度越低，蛋白样跑的越快。
⑤开始电泳。
2.转膜（半干转）
①转一张膜需准备2张比分离胶部分略大的滤纸和1张与滤纸相同大小的NC 膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
在转膜前要将NC 膜先放在去离子水中浸泡几分钟，因为直接将NC膜泡在Transferring buffer 中会导致NC膜变的很皱。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
）
②在加有Transferring buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、一支试管、滤纸和浸过的膜。
③将转膜仪打开，在上面垫浸泡过的滤纸，用试管取一些Transferring buffer
轻轻倒在上面，再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。
④在滤纸上摆放好NC膜,注意膜的中间先与滤纸接触，然后两边慢慢放下。
⑤将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
（撬时一定要小心，玻板很易裂。
）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
记住正反面，切去一角已标记方向。
⑥小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶，后用手拿着胶的轻轻置于NC 膜上，注意胶的中间要先与NC膜接触，然后慢慢放下，以防有气泡。
用手调整使其与NC膜对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
⑦在最上面铺上最后一层滤纸。
⑧用纸吸取多余的Transferring buffer。
⑨盖上转膜仪的盖子，插上电源，打开电源，设置时间和电压，25v，45min。
3.免疫反应
1.取出NC膜于，用剪刀减去多余的NC膜部分，用同样的方法剪去一个角，标记正反。
将NC膜置于TBS中在摇床上摇3次，10分钟/次，倒去TBS液。
2.封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。
3.一抗（1：10000）孵育4℃过夜。
4.取出NC膜，用TBST在摇床上洗三次，每次15min。
5.封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。
6.用同样的方法，二抗（1：10000）孵育，1h。
7.取出NC膜，用TBST洗三次，每次15min。
4.显影
①取两张塑料膜，剪成比膜大的相同的大小。
将其中一张铺在X射线摄影暗匣里。
②按照1：1配制好显影液，混匀。
③将NC膜平铺在第一张塑料膜上，将显影液均匀的铺在NC膜上,左右摇晃X射线摄影暗匣使显影液尽量铺满NC膜。
④将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面，用胶布粘住四边固定。
盖好夹子。
⑤在暗室里，打开夹子，取四张X射线胶片将其小心盖在塑料膜上，覆盖住NC 膜。
注意当X射线胶片盖上后就不能再横向移动，否则荧光会错位影响结果。
⑥在暗室里观察荧光情况，若所用的标签蛋白比较亮，就计时1min；否则，计时10min。
盖上夹子，计时。
⑦小心取出X射线胶片，减掉一个角以表明正反。
然后放入自动显影机中显影。
⑧拿到显影后的X射线胶片，用标签笔标记时间，Marker大小，上样信息等必要的数据。