细胞的传代冻存复苏

细胞计数
血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数
培养细胞活力测定
细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段 之一。
任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、活细胞是困难的。
1. 细胞克隆形成率实验： 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细
细胞冻存器
简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，
通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃
的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮
中。
低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提 高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗 透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞 膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结 过程，能使细胞内水分在冻结前透出细 胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶， 从而减少冰晶对细胞的损伤。
细胞株 cell strain
初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 如细胞系的生存期有限 ，则称之为有限细胞系 （Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。
从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选 的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长：
必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体
瘤细胞
悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表
面。见于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染
4 无毒
实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸
CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、 纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止 小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
慢冻程序
标准程序：
当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min
当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和 稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的 程序。
向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于 某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。
无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。
无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。
1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。
潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
2 细胞的生存环境
目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清
血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌
对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的 复杂成分至今尚未完全清楚．
血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子 或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学 特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。
在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞．
结果的分析。易发生支原体污染
合成培养基:
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量， 用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基， 如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、 无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需
避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干 细胞的研究证
要。
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清．
胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细 胞的增殖能力。 克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠
2.台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞恬力
已淘汰
3. 四唑盐（MTT）比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，
四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干 水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这 种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值
MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、
细胞冻存方法
1预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO
2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适 量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液 （1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)
3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻 细胞名称和冷冻日期。
4 年后，存洁率可达80％一叽％。DMSO液用 培养液配好，
再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一
2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法
使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
各100卑位／毫升
培养基的配制
RPMI-1640培养粉
1袋
碳酸氢钠
2.0 g
青、链霉素
各100单位／毫升
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
调节pH值至7.2
加血清（终浓度 10％）
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。
1.悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后
超净台
超净工作台的工作 原理是利用鼓风机
驱动空气遁过高效 滤器除去空气中的 尘埃颗粒，使空气 得到净化。净化空 气徐徐通过工作台 面，使工作台内构 成无菌环境。
滤器
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ℃ ，14 h)。 ③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
细胞传代、冻存与复苏
细胞培养的基本概念
传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新
的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传
代之前称为原代培养。
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
有限细胞系，无限细胞系
细胞系 cell line
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广
电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃
器皿消毒
滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、
酶液等均采用滤过法除菌
超净工作台：为细胞操作提供无菌环境
紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料
培养皿和培养板等表面消毒
抗菌素的使用：
在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制 可能存在的细菌的生长。
通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、 链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定
完全培养基的组成
基础培养基 血清 碳酸氢钠 青、链霉素
Βιβλιοθήκη Baidu
80％一95％ 5％一20％ 2.0 g/L
贴壁生长细胞传代方法：
1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）
静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液， 分天然培养基和合成培养基。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验
肿瘤放射敏感性实验等。
操作步骤
（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养 基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％
CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小
时。
（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培 养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。
（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果， 绘制
什么时候传代？
细胞消化的最佳程度
细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少 入力、经费，减少污染，减少细胞生物 学特性变化。
冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰 晶。
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养板
培养瓶
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
消化液：
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘 蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常