SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE及ppt课件
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实验八
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
1
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法 • 3.熟悉蛋白印迹技术原理和方法
2
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯 酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种 因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量 的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电 泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
• 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则 主要取决于蛋白质分子大小
4
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
8
9
10
实验操作大致流程图
SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤 维素膜）源自文库封闭 一抗 洗涤 酶标二 抗反应 洗涤 显色或化学发光显影
11
操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净 的小烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封 条和隔离板)
*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀， 防止夹坏玻璃板
50µl
100µl
TEMED
10µl
10µl
13
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或 直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后 加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶 凝
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要 在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶 过程最好一次性完成,避免产生气泡
14
3
SDS的作用
• SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。 因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与 SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合 物。这种复合物由于结合大量带负电荷的 SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而 起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差 异的作用
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
19
？
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完 后,需在其上加一层水,为什么?
• 电极缓冲液中甘氨酸的作用? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? • 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分
钟?
20
浓缩胶的作用
12
配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
6.8ml
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
100µl
10%Ap
6
Gel
5%
10%
200
200
97
97
66
66 45
29 45
29
15%
200 97 66
45 29
7
将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝 酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检 蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异 性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种 属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非 特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测 试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条 带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异 性蛋白的半定量
*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的 气泡全部排出
15
6.上样： （1）marker 5µl （2）细胞样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共 20µl 100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过 高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径 较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝 胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品 液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨 酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离 出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一 起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最 慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超 过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与 低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋 白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面， 使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层
5
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液 的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连 续系统和不连续系统两大类
连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓 度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动 不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应， 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
17
五.分析计算
按下式计算相对迁移率：
蛋白样品距加样端迁移距离 cm 相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其分于量，这样的标难曲线 只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才 具有可靠性
18
注意的问题
蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质
* 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓 缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插 入梳子,静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需 水平
5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液
16
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流 恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA （180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色1小时左右
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
1
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法 • 3.熟悉蛋白印迹技术原理和方法
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二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯 酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种 因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量 的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电 泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
• 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则 主要取决于蛋白质分子大小
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当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样 品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均 为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量
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实验操作大致流程图
SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤 维素膜）源自文库封闭 一抗 洗涤 酶标二 抗反应 洗涤 显色或化学发光显影
11
操作过程
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净 的小烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封 条和隔离板)
*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀， 防止夹坏玻璃板
50µl
100µl
TEMED
10µl
10µl
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3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或 直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后 加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶 凝
* 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要 在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶 过程最好一次性完成,避免产生气泡
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SDS的作用
• SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。 因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与 SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合 物。这种复合物由于结合大量带负电荷的 SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而 起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差 异的作用
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
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？
• 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完 后,需在其上加一层水,为什么?
• 电极缓冲液中甘氨酸的作用? • 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? • 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分
钟?
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浓缩胶的作用
12
配胶
分离胶(10% 10ml) 浓缩胶(5% 10ml)
ddH2O 30%Acr Buffer
10%SDS
4.05ml
3.3ml
1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5ml
100µl
6.8ml
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
100µl
10%Ap
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Gel
5%
10%
200
200
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97
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66 45
29 45
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200 97 66
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将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝 酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检 蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异 性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种 属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非 特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测 试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条 带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异 性蛋白的半定量
*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的 气泡全部排出
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6.上样： （1）marker 5µl （2）细胞样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共 20µl 100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性） 7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过 高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径 较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝 胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品 液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨 酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离 出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一 起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最 慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超 过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与 低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋 白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面， 使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层
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SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液 的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连 续系统和不连续系统两大类
连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓 度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动 不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应， 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
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五.分析计算
按下式计算相对迁移率：
蛋白样品距加样端迁移距离 cm 相对迁移率 =
溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其分于量，这样的标难曲线 只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才 具有可靠性
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注意的问题
蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质
* 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓 缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插 入梳子,静置到胶凝 * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需 水平
5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液
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8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流 恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA （180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色1小时左右
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色 液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析