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2
The expression level of lung tissue mtTFA was measured by western blot in different groups.
DL
DR
OL
OR
UL
UR
研究背景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
讨
论
Discussion
单肺通气诱发肺损伤模型的制备 单肺通气致肺损伤的机制
研究背景
Research Background
FSP-1即成纤维细胞特 异性蛋白-1(Fibreblast specific protein 1)，又 称为 钙结合蛋白A4 FSP-1 （S100A4），为 成纤维细胞特异性蛋白-1 S100家族中的一个重 要成员。是由101个氨 基酸组成的多肽, 分子 量为11. 5 kD ，含 有 2 EF-hand 钙离子 结合结构域 。
abc
left
30.00
20.00
right
10.00
0.00
D
O
U
D
O
U
Group Compare with O Compare with left lung Compare with D
Group Compare with left lung Compare with Dwith O Compare
FSP-1具有 成作用，对 的促进作用 瘤发生、发 病理生理过
人的FSP-1基因 包含4个外显子， 2种剪切体。 FSP-1启动子区 域含有一个 ERBB2反应元件， 其转录受位于第1 内含子的正性和 负性调节元件的 调节。其转录沉 默与其甲基化有 关。
FSP，促进
研究背景
Research Background
研究背景
Research Background
血液透析与动 静 脉 內 瘘
血液透析（hemodialysis，HD）是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之 一，它能建立和维持的一个有足够功能的血管通路(vascular access)，即动静 脉内瘘(AVF)。自体动静脉内瘘是目前终末期肾脏病（ESRD，即尿毒症）患者 进行透析治疗时应用最广泛的慢性血管通路,是保证透析顺利进行和提高患者生 存质量的关键。
谭朝华, 徐军美, 杨昭云, 杨东林, 吕志平. 乌司他丁对急性肺损伤兔炎性细胞因子及氧自由基的影响. 中国医师 杂志, 2004, (10):1360-1362.
ChIP（染色质免疫共沉淀）
Materials and methods
ChIP是研究细胞内基因组DNA的某一区域与特定蛋白质[包括组蛋白 和非组蛋白（如转录因子）]相互作用的有效方法。
研究背景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
结
果
Result
1、 FSP-1启动子区PCR扩增 2、重组质粒构建 TA克
ac
Compare with T0
ac
abc
ac
D O U
Compare with T0 Compare with D
结
果
Result
各组兔肺组织SOD活性和MDA含量的比较
Compare with SOD activity of lung tissue in group
100.00 90.00 MDA assaying of lung tissue 80.00
隆
酶切 连接， 转化
菌液电 泳
提质 粒
3、pGL4-FSP-1系列质粒鉴定 PCR + 酶切
FSP-1启动子区荧光素酶报告载体构建
结
果
Result
结
果
Result
各时间点氧合指数比较
Compare with oxygenation index in groups
600 500 oxygenation index 400 300 200 100 0 T0 T1 Time T2 T3
材料与方法
Materials and methods
location consensus sites
-1832 -1568 -1460 -1452 -1414 -1357 -1198 -815 -692 -366 -178 -168 -161 to to to to to to to to to to to to to -1826 -1562 -1454 -1446 -1408 -1351 -1192 -709 -686 -360 -172 -162 -155
RBP-jk consensus sequence in FSP-1 promoter
ctcccac atgggaa tttccac gcGggaa gagggaa gtgggga gtgggag ttcccac tccccac ctcccac tacccac tgcccac ctgggaa
生物信息学预测启动子区域
Reporter Assay EMSA ChIP
材料与方法
Materials and methods
1、启动子区域的确定
↓ 克隆5 ´ -flanking sequence并连接到报告基因载体上 ↓ 缺失突变 ↓ 荧光素酶活性分析 ↓
确定转录调控区域（启动子区域） 生物信息学预测启动子区域
单肺通气诱发肺损伤模型制备成功
讨
论
Discussion 单肺通气诱发肺损伤机制
单肺通气诱发非通气侧肺损伤比通气侧严重
肺快速复张时，可造 成膨胀和不张肺组织 的交界处产生:
界面切力
本研究结果表明，与O组左侧比较，O组右 侧肺组织肺损伤评分升高、SOD活性降 低、MDA含量升高、mtTFA表达下调。提 肺水滞留 单肺通气转为双肺通气时，产生的 示非通气侧肺组织损伤严重，其机制可能 界面切力和肺水滞留，是引起非通气侧 为非通气侧肺组织长时间萎陷，肺泡Ⅱ型 肺组织受到牵张而损伤严重的重要原 细胞膜上 Na+-K+-ATP酶活性较肺通气侧明 因。 显下降，阻碍肺泡间质内的肺水重吸收， 因此肺泡内渗出液增多。
Notch信号通路
TGF-β,活化notch信号
DAPT,r-分泌酶抑制剂，抑制 Nnotch信号通路
途径可概括为：Delta→Notch→酶切→ICN→进入细胞核→CLS-ICN复合体→基因转
研究Байду номын сангаас景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
研究目的
Research Objective
材料与方法
Materials and methods
材料与方法
Materials and methods
荧光素酶活性分析
材料与方法
Materials and methods
酶切位点
PCR
5′ 3′
3′ 5′
转化
plasmid of pGL4-C ：突变位点 ：缺失突变引物 ：同源序列
未突变的用Dpn I甲 基化酶消化
自身连接
m
Not Transformed
但是，内瘘的使用过程中会因为血栓形成或内膜增生等导致失败。
研究背景
Research Background
血管内膜增生
4、血管重构, AVF狭窄
1、 内皮细胞(EC)损伤
2、动脉平滑肌细胞（SMC）的 迁移、异常分化
3、血管内膜SMC增生、 细胞外基质沉积
自体动静脉内瘘功能障碍
胞特征性标记，用 种器官纤维化进程 中发生的间质化
线粒体转录因子A （mtTFA）
细胞核内DNA
讨
论
Discussion
乌司他丁
乌司他丁是分离纯化 成年男性尿液得到的 蛋白水解酶抑制剂。
覃建明. 乌司他丁的药理作用及 临床应用进展[J]. 中国医药导 报,2008,(11):19-20
减轻炎症反应
研 究 表 明
清除氧自由基
乌司他丁
防止细胞钙超载
抑制水解酶的活性
缺失突变
材料与方法
凝胶迁移阻滞实验(EMSA)
Materials and methods
EMSA是一种在体外研究蛋白质与核酸相互作用的技术，可用于定性和定 量分析
。
仅以DNA与蛋白质相互作用为 例介绍EMSA
材料与方法
凝胶迁移阻滞实验(EMSA)
Materials and methods
材料与方法
小鼠实验研究发现，Notch信号通路是调节血管内皮细胞功能和血管 新生的关键。 激活的Notch/RBP-Jk信号可以增强由CDK引起的血管内膜增生。 同时， Notch信号通路可以调控血管重塑，抑制了Notch信号或者敲 除RBP-Jk，都可以下调FSP-1的表达，阻止平滑肌细胞的迁移，从 而抑制血管内膜增生
肺损伤时肺组织脂质过氧化反应及与mtTFA关系
乌司他丁减轻肺损伤机制
讨
论
Discussion
单肺通气诱发肺损伤模型的建立
动脉血氧合指数比较： O组、 U组通气结束时氧 根据文献，对肺泡结构、肺间质水肿增厚、肺泡内 研究表明，氧合指数 <300 mmHg(1mm Hg=0.133 合指数 <300mm Hg，提示氧饱和下降，出现轻微 渗出、出血、炎性细胞浸润程度进行评分， >3分为 kPa) 时即可认为发生肺损伤。 的低氧血症。 重度损伤 肺组织病理学损伤评分：光镜下单肺通气后肺组 本研究结果表明，光镜下单肺通气后肺组织大部分 本研究结果表明： O组、U组通气结束时氧合指数 织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血 肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血多，间质增厚 <300mm Hg，提示通气结束时氧饱和下降，出现轻 多，间质增厚明显，炎性细胞聚集。 明显，炎性细胞聚集。 微的低氧血症。
O组
U组
结
果
Result
免疫组化法测定各组肺组织mtTFA表达
400 350
300
250 200 150
左肺 右肺
结果表明：与D组 相比，O组肺组织 mtTFA表达降 低；
与O组肺组织 相比较，U组肺组 织mtTFA表达升 高
100
50 0
D组
O组
U组
结
果
Result
结果表明：与D 组相比，O组肺组 mtTFA表达 织mtTFA表达降 低； 1.5 GAPDH 与O组左侧肺 组织相比，O组右 左肺 侧肺组织mtTFA 右肺 1 表达降低； Western blot结果以密度扫描分析：采用美国 Bandscan 5.0 与 O软件对 组肺组织 Westernblot结果进行定量分析，灰度值以累积光密度值（ IOD ）表示， 相比较， U 组肺组 0.5 织mtTFA表达升 结果通过以下公式计算： 高。 与免疫组化法 mtTFA蛋白累积光密度值 mtTFA蛋白半定量 = GAPDH的累积光密度值 测定mtTFA结果 0 一致。 D组 O组 U组
结
果
Result
各组肺组织病理学结果
compare with lung injury scores in groups
400 350
1、长时间单肺通 气肺组织病理学 损伤评分升高。
右肺 左肺
300
250 200 150
100
50 0
2、与单肺通气组 比较，乌司他丁 组肺组织病理学 损伤评分下降。
D组
讨
论
Discussion
单肺通气诱发肺损伤机制
本研究结果表明，与D组比较，O组肺组织SOD 活性下降，MDA含量增加，提示单肺通气致肺损伤 时兔肺组织发生氧化应激反应。 其机制可能为：炎性起始的中性粒细胞募集，释放 MPO
TNF-α
MPO
IL-1
中性粒细胞募集
髓过氧化物酶
细胞超微结构模拟示意图
线粒体超微结构模拟示意图 线粒体环状DNA （mtDNA）
FSP-1通过notch信号参与慢性肾病AVF的机制 研究
汇报人：曾惜
目 录
Contents
研究背景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
研究背景
Research Background
慢性肾脏病(Chronic Kidney Dielace ， CKD),即各种原因引起的慢性肾脏结构 和功能障碍的疾病。近20年来，由于患 病率高、防治率低、病因谱发生显著变 化（糖尿病、高血压等人数迅速上升）， 已成为继心脑血管病、肿瘤、糖尿病之 后的一个威胁人类健康重要疾病。
Compare with MDA assaying of lung tissue in groups.
14.00
SOD activity of lung tissue
a ac
ab
12.00
ac a ab
left right
abc
70.00 60.00 50.00 40.00
10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00
材料与方法
提取基因组 PCR
Materials and methods
+ TAK101-t-vector FSP-1启动子区序列
pGL4-basic vector HindIII+Ec oR V pGL4-basic
TAK101-t-FSP-1 HindIII+Eco RV FSP-1
pGL4-FSP-1 FSP-1启动子区荧光素酶报告载体构建
The expression level of lung tissue mtTFA was measured by western blot in different groups.
DL
DR
OL
OR
UL
UR
研究背景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
讨
论
Discussion
单肺通气诱发肺损伤模型的制备 单肺通气致肺损伤的机制
研究背景
Research Background
FSP-1即成纤维细胞特 异性蛋白-1(Fibreblast specific protein 1)，又 称为 钙结合蛋白A4 FSP-1 （S100A4），为 成纤维细胞特异性蛋白-1 S100家族中的一个重 要成员。是由101个氨 基酸组成的多肽, 分子 量为11. 5 kD ，含 有 2 EF-hand 钙离子 结合结构域 。
abc
left
30.00
20.00
right
10.00
0.00
D
O
U
D
O
U
Group Compare with O Compare with left lung Compare with D
Group Compare with left lung Compare with Dwith O Compare
FSP-1具有 成作用，对 的促进作用 瘤发生、发 病理生理过
人的FSP-1基因 包含4个外显子， 2种剪切体。 FSP-1启动子区 域含有一个 ERBB2反应元件， 其转录受位于第1 内含子的正性和 负性调节元件的 调节。其转录沉 默与其甲基化有 关。
FSP，促进
研究背景
Research Background
研究背景
Research Background
血液透析与动 静 脉 內 瘘
血液透析（hemodialysis，HD）是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之 一，它能建立和维持的一个有足够功能的血管通路(vascular access)，即动静 脉内瘘(AVF)。自体动静脉内瘘是目前终末期肾脏病（ESRD，即尿毒症）患者 进行透析治疗时应用最广泛的慢性血管通路,是保证透析顺利进行和提高患者生 存质量的关键。
谭朝华, 徐军美, 杨昭云, 杨东林, 吕志平. 乌司他丁对急性肺损伤兔炎性细胞因子及氧自由基的影响. 中国医师 杂志, 2004, (10):1360-1362.
ChIP（染色质免疫共沉淀）
Materials and methods
ChIP是研究细胞内基因组DNA的某一区域与特定蛋白质[包括组蛋白 和非组蛋白（如转录因子）]相互作用的有效方法。
研究背景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
结
果
Result
1、 FSP-1启动子区PCR扩增 2、重组质粒构建 TA克
ac
Compare with T0
ac
abc
ac
D O U
Compare with T0 Compare with D
结
果
Result
各组兔肺组织SOD活性和MDA含量的比较
Compare with SOD activity of lung tissue in group
100.00 90.00 MDA assaying of lung tissue 80.00
隆
酶切 连接， 转化
菌液电 泳
提质 粒
3、pGL4-FSP-1系列质粒鉴定 PCR + 酶切
FSP-1启动子区荧光素酶报告载体构建
结
果
Result
结
果
Result
各时间点氧合指数比较
Compare with oxygenation index in groups
600 500 oxygenation index 400 300 200 100 0 T0 T1 Time T2 T3
材料与方法
Materials and methods
location consensus sites
-1832 -1568 -1460 -1452 -1414 -1357 -1198 -815 -692 -366 -178 -168 -161 to to to to to to to to to to to to to -1826 -1562 -1454 -1446 -1408 -1351 -1192 -709 -686 -360 -172 -162 -155
RBP-jk consensus sequence in FSP-1 promoter
ctcccac atgggaa tttccac gcGggaa gagggaa gtgggga gtgggag ttcccac tccccac ctcccac tacccac tgcccac ctgggaa
生物信息学预测启动子区域
Reporter Assay EMSA ChIP
材料与方法
Materials and methods
1、启动子区域的确定
↓ 克隆5 ´ -flanking sequence并连接到报告基因载体上 ↓ 缺失突变 ↓ 荧光素酶活性分析 ↓
确定转录调控区域（启动子区域） 生物信息学预测启动子区域
单肺通气诱发肺损伤模型制备成功
讨
论
Discussion 单肺通气诱发肺损伤机制
单肺通气诱发非通气侧肺损伤比通气侧严重
肺快速复张时，可造 成膨胀和不张肺组织 的交界处产生:
界面切力
本研究结果表明，与O组左侧比较，O组右 侧肺组织肺损伤评分升高、SOD活性降 低、MDA含量升高、mtTFA表达下调。提 肺水滞留 单肺通气转为双肺通气时，产生的 示非通气侧肺组织损伤严重，其机制可能 界面切力和肺水滞留，是引起非通气侧 为非通气侧肺组织长时间萎陷，肺泡Ⅱ型 肺组织受到牵张而损伤严重的重要原 细胞膜上 Na+-K+-ATP酶活性较肺通气侧明 因。 显下降，阻碍肺泡间质内的肺水重吸收， 因此肺泡内渗出液增多。
Notch信号通路
TGF-β,活化notch信号
DAPT,r-分泌酶抑制剂，抑制 Nnotch信号通路
途径可概括为：Delta→Notch→酶切→ICN→进入细胞核→CLS-ICN复合体→基因转
研究Байду номын сангаас景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
研究目的
Research Objective
材料与方法
Materials and methods
材料与方法
Materials and methods
荧光素酶活性分析
材料与方法
Materials and methods
酶切位点
PCR
5′ 3′
3′ 5′
转化
plasmid of pGL4-C ：突变位点 ：缺失突变引物 ：同源序列
未突变的用Dpn I甲 基化酶消化
自身连接
m
Not Transformed
但是，内瘘的使用过程中会因为血栓形成或内膜增生等导致失败。
研究背景
Research Background
血管内膜增生
4、血管重构, AVF狭窄
1、 内皮细胞(EC)损伤
2、动脉平滑肌细胞（SMC）的 迁移、异常分化
3、血管内膜SMC增生、 细胞外基质沉积
自体动静脉内瘘功能障碍
胞特征性标记，用 种器官纤维化进程 中发生的间质化
线粒体转录因子A （mtTFA）
细胞核内DNA
讨
论
Discussion
乌司他丁
乌司他丁是分离纯化 成年男性尿液得到的 蛋白水解酶抑制剂。
覃建明. 乌司他丁的药理作用及 临床应用进展[J]. 中国医药导 报,2008,(11):19-20
减轻炎症反应
研 究 表 明
清除氧自由基
乌司他丁
防止细胞钙超载
抑制水解酶的活性
缺失突变
材料与方法
凝胶迁移阻滞实验(EMSA)
Materials and methods
EMSA是一种在体外研究蛋白质与核酸相互作用的技术，可用于定性和定 量分析
。
仅以DNA与蛋白质相互作用为 例介绍EMSA
材料与方法
凝胶迁移阻滞实验(EMSA)
Materials and methods
材料与方法
小鼠实验研究发现，Notch信号通路是调节血管内皮细胞功能和血管 新生的关键。 激活的Notch/RBP-Jk信号可以增强由CDK引起的血管内膜增生。 同时， Notch信号通路可以调控血管重塑，抑制了Notch信号或者敲 除RBP-Jk，都可以下调FSP-1的表达，阻止平滑肌细胞的迁移，从 而抑制血管内膜增生
肺损伤时肺组织脂质过氧化反应及与mtTFA关系
乌司他丁减轻肺损伤机制
讨
论
Discussion
单肺通气诱发肺损伤模型的建立
动脉血氧合指数比较： O组、 U组通气结束时氧 根据文献，对肺泡结构、肺间质水肿增厚、肺泡内 研究表明，氧合指数 <300 mmHg(1mm Hg=0.133 合指数 <300mm Hg，提示氧饱和下降，出现轻微 渗出、出血、炎性细胞浸润程度进行评分， >3分为 kPa) 时即可认为发生肺损伤。 的低氧血症。 重度损伤 肺组织病理学损伤评分：光镜下单肺通气后肺组 本研究结果表明，光镜下单肺通气后肺组织大部分 本研究结果表明： O组、U组通气结束时氧合指数 织大部分肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血 肺泡结构消失，肺泡腔内渗出，出血多，间质增厚 <300mm Hg，提示通气结束时氧饱和下降，出现轻 多，间质增厚明显，炎性细胞聚集。 明显，炎性细胞聚集。 微的低氧血症。
O组
U组
结
果
Result
免疫组化法测定各组肺组织mtTFA表达
400 350
300
250 200 150
左肺 右肺
结果表明：与D组 相比，O组肺组织 mtTFA表达降 低；
与O组肺组织 相比较，U组肺组 织mtTFA表达升 高
100
50 0
D组
O组
U组
结
果
Result
结果表明：与D 组相比，O组肺组 mtTFA表达 织mtTFA表达降 低； 1.5 GAPDH 与O组左侧肺 组织相比，O组右 左肺 侧肺组织mtTFA 右肺 1 表达降低； Western blot结果以密度扫描分析：采用美国 Bandscan 5.0 与 O软件对 组肺组织 Westernblot结果进行定量分析，灰度值以累积光密度值（ IOD ）表示， 相比较， U 组肺组 0.5 织mtTFA表达升 结果通过以下公式计算： 高。 与免疫组化法 mtTFA蛋白累积光密度值 mtTFA蛋白半定量 = GAPDH的累积光密度值 测定mtTFA结果 0 一致。 D组 O组 U组
结
果
Result
各组肺组织病理学结果
compare with lung injury scores in groups
400 350
1、长时间单肺通 气肺组织病理学 损伤评分升高。
右肺 左肺
300
250 200 150
100
50 0
2、与单肺通气组 比较，乌司他丁 组肺组织病理学 损伤评分下降。
D组
讨
论
Discussion
单肺通气诱发肺损伤机制
本研究结果表明，与D组比较，O组肺组织SOD 活性下降，MDA含量增加，提示单肺通气致肺损伤 时兔肺组织发生氧化应激反应。 其机制可能为：炎性起始的中性粒细胞募集，释放 MPO
TNF-α
MPO
IL-1
中性粒细胞募集
髓过氧化物酶
细胞超微结构模拟示意图
线粒体超微结构模拟示意图 线粒体环状DNA （mtDNA）
FSP-1通过notch信号参与慢性肾病AVF的机制 研究
汇报人：曾惜
目 录
Contents
研究背景
研究目的
材料与方法
结
果
讨
论
结
论
研究背景
Research Background
慢性肾脏病(Chronic Kidney Dielace ， CKD),即各种原因引起的慢性肾脏结构 和功能障碍的疾病。近20年来，由于患 病率高、防治率低、病因谱发生显著变 化（糖尿病、高血压等人数迅速上升）， 已成为继心脑血管病、肿瘤、糖尿病之 后的一个威胁人类健康重要疾病。
Compare with MDA assaying of lung tissue in groups.
14.00
SOD activity of lung tissue
a ac
ab
12.00
ac a ab
left right
abc
70.00 60.00 50.00 40.00
10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00
材料与方法
提取基因组 PCR
Materials and methods
+ TAK101-t-vector FSP-1启动子区序列
pGL4-basic vector HindIII+Ec oR V pGL4-basic
TAK101-t-FSP-1 HindIII+Eco RV FSP-1
pGL4-FSP-1 FSP-1启动子区荧光素酶报告载体构建