基因工程主要知识点整理

第一章基因克隆

基因工程的基本技术有哪些？

答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。

构建基因文库一般使用什么作为载体？

答：一般使用大肠杆菌作为载体

克隆与亚克隆？

答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。

PCR对基因克隆有什么作用？

答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。

第二章分子克隆工具酶

限制与修饰系统？

答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。

使用最广泛的限制酶？

答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶

限制性内切酶的命名？

答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。

如：HindIII

限制与修饰系统分类？

答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。

限制酶识别的序列长度？结构？

答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列

限制酶产生的末端？

答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端

什么是同裂酶？分类？

答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他

限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？

答：

什么是同尾酶？

答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。

酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？

答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH

M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性

DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果

BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。

酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法?

答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。

什么星星活性？抑制其发生的办法？

答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。

影响酶活性的因素有？

答：可分为内因和外因

外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。

内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋）

原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？

答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

DNA聚合酶I的三种活性? 答：

4、置换反应，若体系中只含有一种dNTP，那么会一直重复3过程，直至漏出与该dNTP互补的碱基。

总之在没有dNTP的情况下，外切酶活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在平衡状态中，结果使得双链DNA称为平末端。

切口平移法是什么？

答：切口平移法是作为DNA聚合酶I 的一个应用，

Klenow DNA 聚合酶是什么？有什么特征？有什么应用？

答：Klenow DNA聚合酶是DNA聚合酶I去掉了5’-3’外切酶活性的一种聚合酶。但其3’-5’端的外切酶活性保留。因此应用更为广泛：

T4噬菌体DNA聚合酶是怎么得到的？有什么活性？应用？

答：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌。其活性与KlenowDNA聚合酶相似，但是其3’-5’端外切核酸酶活性要强200倍。且不从单链模板上置换引物，应用：

耐热DNA聚合酶有那些？特征是？作用？

答：耐热DNA聚合酶是指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应。有TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等等。

DNA连接酶和DNA聚合酶作用方法相同吗？应用相同吗？

答：作用方法都是催化磷酸二酯键的形成，但DNA连接酶是连接两个DNA片段，可以是环状DNA可以是单链DNA，而DNA聚合酶是作用一个一个的核苷酸，在复制中发挥作用。

反转录酶的来源和活性？

答：来源于AMV（禽成髓细胞瘤病毒），含有两条多肽链，具有5’-3’DNA聚合酶活性和很强的RNase H活性。后者的活性可以用于反转录后降解掉原RNA。

末端转移酶来源？活性？

答：来源于小牛胸腺，是一种不寻常的DNA聚合酶，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在2价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端，改变DNA分子的末端序列。

连接酶有哪些？T4连接酶的作用过程？

答：有T4 DNA连接酶、大肠杆菌连接酶、Taq连接酶、T4 RNA连接酶

T4连接酶的作用过程：催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。反应物为黏末端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。低浓度的PEG和单价阳离子可以提高平末端连接速度。

T4多核苷酸激酶是什么？有什么活性？

T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP上的磷酸基团转移到DNA分子5’上。

具有两种活性：1、正反应：使本来没有磷酸基团的DNA5’磷酸化。

2、交换反应：使DNA分子5’的磷酸基团转移到ADP上，再让ATP上的磷酸基团转移到该DNA分子的5’上，发生交换反应。

将ATP上的磷酸基团标记，应用广泛。

此酶在高ATP浓度是发挥最佳，N H4+是其强烈抑制剂。

碱性磷酸酶的用途？

答：他们均能催化除去DNA或RNA5’的磷酸的反应，通过去除5’磷酸基团，可以防止DNA 片段发生自连，或标记（5’）前除去DNA或RNA5’磷酸。

核糖核酸酶A的作用？作用方式?

答：广泛用来除去DNA样品中的RNA。除去DNA：RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。

核糖核酸酶H 的作用？

答：特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3’羟基和5’磷酸末端的产物。主要用于cDNA克隆合成第二链之前，除去RNA。

脱氧核糖核苷酸酶I的作用？应用？

答：DNase I 来源于牛胰，是内切核苷酸酶，优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或者单链DNA。在M g2+作用下，独立作用于每条DNA链，其切割位点随机。有M g2+切割ds DNA同一位置，产生平末端或者1~2个核苷酸突出的DNA片段。

其用途广泛：切口平移标记时在ds DNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，将分子截短；除去RNA样品中的DNA。