LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13
徕卡激光测距仪使用说明书
徕卡激光测距仪使用说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1徕卡激光测距仪使用说明书一、使用前的准备（一）电池的装入/更换打开仪器尾部的固定挡板。
向前推卡钮，向下将底座取下。
按住红色的卡钮推开电池盒盖。
安装或更换电池。
关闭电池盒盖，安装底座和卡扣。
当电池的电压过低时，显示屏上将持续闪烁显示电池的标志{B，21}。
此时应及时更换电池。
1、按照极性正确装入电池。
2、使用碱性电池（建议不要使用充电电池）。
3、当长时间不使用仪器时，请取出电池，以避免电池的腐蚀。
更换电池后，设置和储存的值都保持不变。
（二）多功能底底座固定挡板可以在下面的测量情况下使用：1、从边缘测量，将固定挡板拉出，直到听到卡入的声音。
2、从角落测量，将固定挡板拉出，直到听到卡入的声音，轻轻将固定挡板向右推，此时固定挡板完全展开。
仪器自带的传感器将辨认出固定挡板的位置，并将自动设置测量其准点。
（三）内置的望远镜瞄准器在仪器的右部有一个内置的望远镜瞄准器。
此望远镜瞄准器为远距离测量起到辅助的作用。
通过瞄准器上的十字丝可以精确地观察到测量目标。
在30米以上的测量距离，激光点会显示在十字线的正中。
而在30米以下的测量距离，激光点不在十字线中间。
（四）气泡一体化的水泡使仪器更容易调平。
（五）键盘1、开/测量键2、第二级菜单功能3、加+键4、计时（延迟测量）键5、等于[=]键6、面积/体积键7、储存键8、测量基准边键9、清除/关键10、菜单键11、照明键12、间接测量（勾股定律）键13、减-键14、BLUETOOTH（六）显示屏1、关于错误测量的信息2、激光启动3、周长4、最大跟踪测量值5、最小跟踪测量值6、测量基准边7、调出储存值8、储存常数9、主显示10、单位，包括乘方立方（2/3）11、顶的面积12、墙面积13、3个额外显示（如：测量中间值）14、BLUETOOTH蓝牙开/关15、第二级菜单功能开16、硬件故障17、间接测量-利用勾股定律18、间接测量-利用勾股定律-部分高度19、面积/体积20、带常数的测量21、电池充电量显示二、菜单功能（一）设置在菜单中可以改变设置，并将其长久保存，并在关机和更换电池后不改变。
Leica IP S 产品说明书
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Leica IP S
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目录
1. 重要信息 ............................................................................................................................................... 6
4. 仪器安装 .............................................................................................................................................24
2.1 安全说明 ...............................................................................................................................................................................11 2.2 警告 .........................................................................................................................................................................................12
徕卡激光扫描共聚焦显微镜SP8的使用、维护与常见问题剖析
徕卡激光扫描共聚焦显微镜SP8的使用、维护与常见问题剖析石春梅【摘要】本文以华中农业大学园艺植物教育部重点实验室细胞生物学实验平台现有的一套由德国徕卡公司生产的新型号TCS-SP8激光共聚焦扫描显微镜机组(文中简称SP8)为例,结合实际操作经验,从机组组成使用、软件的使用、使用中常见问题、用后维护及保养等方面进行了大量总结和探索,希望能够为初次使用仪器者及致力于该领域的科研工作者提供第一手直观详实易懂的操作规程.%In order to provide reference for the researchers and technologies on how to use the Laser scanning confocal microscope efficiently, taking a set of Laser confocal laser scanning microscope (the model is TCS-SP8) which was produced by Leica corporation in Germany as an example, a lot of suggestions and introdutctions about function, principle, structure, use of sofeware, instrumental management, experimental technology and analysis of common problems in use were disserted in this paper.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2017(026)006【总页数】7页(P570-576)【关键词】激光共聚焦显微镜;功能简介;常见问题【作者】石春梅【作者单位】华中农业大学园艺林学学院, 湖北武汉430070【正文语种】中文【中图分类】R318.51激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是现今细胞生物学研究中不可缺的光影成像系统。
Leica共聚焦操作快速流程
Leica共聚焦操作快速流程（电子版在电脑桌面）开机：1.接通3 个电源插座；2.打开控制器和电脑：按照①→ ②→ ③→ ④→ ⑤→ ⑥的序号依次开机；注意:系统开机时，显微镜的载物台会作初始化 xy 移动，请确保载物台周围没有障碍物！此时也不要放置样品；禁止用手转动物镜！！！关机：1.按照⑥→ ⑤→ ④→ ③→ ②→ ①的序号依次关机；2.拔掉3个电源插座；注意:先关电脑，再关仪器！关激光器后，等5分钟左右，等风扇停止后，再关电源！激光器的开关： ON 钥匙转到垂直位置OFF 钥匙转到水平位置软件快速操作：1.在桌面上，双击打开显微镜控制软件的图标“LAS AF ”：2.出现如下图标，直接点击“OK ”直接点击“ OK ”3.进入软件操作界面后，点击“Configuration ”（1），然后点击“Laser Config ”（2），再打开所需要的激光器开关“ON/OFF ”（3）；1324.点击“Acquire ”；点击“SEQ ”125.选择物镜；注意：禁止用手转动物镜！！！选择物镜6.有多个染料需要多个通道时，点击“+ ”增加通道；7.比如：选中“Seq. 1 ”后，打开405激光器；选择探测器PMT 1；选择染料DAPI；2 138. 然后选中“ Seq. 2 ”后 ， 打开488激光器 （不关Laser 405，激光强度调到0）；选择探测器PMT 2；选择染料Alexa 488； 如果需要DIC 图像，则打开探测器“PMT Trans ”；注意： 探测器探测激发波长的范围 不能 与激光线重合！【 没有特殊需求，不要用“HyD 3”探测器！！ 】123少用HyD3DIC激光强度为09.点击软件左下方的“Live”，进行图像预览；调节“Gain”增加探测器探测信号的灵敏度（一点蓝）；调节“Offset”去背景（一片绿）；注意： Gain值必须小于 800 ！！这里可以结合增加激光强度和Gain值来调荧光信号。
激光共聚焦显微镜操作指南说明书
激光共聚焦显微镜操作指南说明书激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率、高对比度的显微镜，广泛应用于生物医学研究、材料科学等领域。
本操作指南将详细介绍激光共聚焦显微镜的操作流程和基本操作技巧，帮助用户正确、高效地使用该设备。
一、设备准备在开始使用激光共聚焦显微镜前，需要进行以下设备准备：1. 检查电源线和数据线是否连接正常，确保设备供电和数据传输正常；2. 检查激光源是否正常工作，激光功率是否稳定；3. 检查镜头和滤光片是否清洁，清除灰尘和污渍，确保成像质量；4. 准备适当的标本样品，并将其固定在载玻片上。
二、系统启动1. 确保设备处于待机状态，按下电源按钮，等待系统启动；2. 检查系统软件是否正常运行，若出现异常情况，及时联系维修人员进行处理；3. 检查镜头和滤光片的安装是否正确，确保成像时的光路通畅；4. 开启激光源，根据需要选择合适的激光波长和功率；5. 调节扫描镜和物镜的位置，使光线准确聚焦在样品上。
三、图像获取1. 打开激光共聚焦显微镜软件，并根据需要选择合适的成像模式；2. 调节激光功率和增益，确保图像的亮度和对比度适宜；3. 调节扫描镜的扫描速度，根据样品的要求选择合适的扫描速度；4. 调节焦距和聚焦位置，通过手动或自动对焦功能获取清晰的图像；5. 点击图像捕捉按钮，记录当前图像或录制图像序列。
四、图像处理和分析1. 通过激光共聚焦显微镜软件提供的图像处理功能，对图像进行调整和增强，以获得更好的观察效果；2. 根据需要，利用软件提供的计算和分析功能对图像进行进一步处理，如三维重建、光学切片等；3. 对图像进行定量分析时，选择合适的工具和算法，并按照要求设定参数；4. 记录和保存处理后的图像数据，以备后续分析和报告撰写使用。
五、设备关闭1. 停止图像采集和处理工作；2. 降低激光功率，关闭激光源；3. 将扫描镜和物镜返回初始位置，关闭设备；4. 断开电源和数据线，保持设备清洁干燥。
Leica TCS SP8 快速入门指南说明书
Leica TCS SP8 Quick Start GuideA message will appear asking whether you want to initialize the stage. InitializingLower the objective to the lowest position, remove specimen and clean all of the NOTE: Do not turn off scanner and/or CTR control box for the microscope before theThe LAS X software will open in the Acquire tab. There are 3 portions to this window: Scan Parameters Light Path ImageNOTE: Only turn on the laser(s) with the appropriate laser line(s) that will excite the fluorophores you are usingAlternatively, click on the ConfigurationLaser Control WindowSave and Load the customized settingsAlternatively , click on the ControlPanel Icon in the Beam Path SettingsWindow as a short cut to the USBControl Panel WindowObjectives equipped on the microscopeEmission spectrum from a lambda scan can be added to the dye database.Many manufacturer’s will also provide the data for fluorophores that can added to Another great resource is the Leica FluoScout/fluoscout/1. Click On to activatethe lasers 2. Adjust the laser intensity of the appropriate laserline(s) by moving theslider up or by directlyentering the level (startlow as a suggestion).4. Use Autoselect to select the beam splitter3. Select the appropriate objective6. Select the appropriate emission spectrum (if available) from thedye data base to use as a guide8. Define the of emission to be collected with the sliders 5. Click On to activate theappropriate detector(s)7.Select the PseudocolourSelect the dye from the databaseUseaddThe following settings are mode for image acquisition when clicking Apply:•Selection of the laser lines•Selection of the detectors•Setting for the detection range•Assignment of the fluorescent dyes to the respective detectors•Assignment of the appropriate colour look-up table(LUT)for therespective fluorescent dyes\All other settings for image acquisition are made as usualspecimens.Click on the disketteicon to save a setting4.Set the light path configuration forthe new scan5.Repeat if necessaryNOTE: Sequential scan settings can be saved and loaded as an alternative.Acquisition Modes:Select the appropriate••••Z Stack(xyz)1.2.3.4.5.current stage posistionMerge Images for automatic stitching and smoothing of seams after acquisition is complete. Both the single images and merged images are added toOpen the ROI Configuration window by clicking on the “+”. Check on/off the laser line(s) 3.To adjust the laser intensity for the“background”, turn on Set Background and then adjust the laser intensity sliders.4. Adjust Gain of detector5.For DIC, adjust Bias of theobjective prism if necessaryRight Click on an imageAdditional Information -Spectral (SP)Detection System This particular system has 3separate internal detectors for confocal imaging;2PMTs and 1HyDThe Leica TCS SP8does not use emission filters to define the wavelengths of emission collected,but rather utilizes a prism-based approach.The wavelengths of emission are dispersed across the entire visible spectrum and each detector has a set of gates that are positioned and width adjusted to collect the desired wavelengths.PMTHyD Emission from the specimen is dispersed by a prismSliders are adjusted to determine the wavelengths of the emission collected in each of the detection channels EMISSION123Vacuum accelerationover 8.5 kVGaAsP photocathodeElectron bombardmentgainAvalanche gain,~ 0.5 kV HyD Detector Incident photonAmplification overcascade of dynodesgain, ~ 1250V photocathode Incident photon AnodePhotomultiplierTube (PMT)The Hybrid Detectors (HyD)are a new type of detector for laser scanning confocal microscopy available only with the TCS SP8.The HyDs very efficiently detect and amplify the signal from the specimen.This is due to the unique design of the HyD,which which includes a combination of the GaAsP photocathode (45%QE)and the fast,noise-free avalanche amplification rather than the slow and relatively noisy step-wise amplification through a series of dynodes with a standard PMT and a GaAsP-PMT.NOTE:A GaAsP-PMT (often referred to as a GaAsP detector)is not the same as a HyD.For more information:/science-lab/sensors-for-true-confocal-scanning//science-lab/detectors-for-sensitive-detection-hyd//science-lab/step-by-step-guide-to-hybrid-detection-and-photon-counting/Additional Information --Types of DetectorsBrightR with the HyD detectorEnhance dynamic range further -capture both very bright structures and not so amplifies dim structures more than bright onesRetains dynamic information in bright structuresSingle image rather than multiple as with HDR▪Optimize the pixel size to for optimal resolution by adjusting thezoom and format (#pixels) of the image Requires a sampling frequency of at least 2x-3x the highest spatial frequency to accurately preserve the spatial resolution in the resulting Optimal # of pixels –2-3x the resolution limitOptimizing Pixel Format (Resolution)Since the PSF for confocal is ~30%smaller due to the pinhole and thefollowing formula applies。
Leica TCS SPE共聚焦显微镜操作规程(1)
Living up to Life
4. 通过显微镜侧面的“INT”按钮进行 光强调节
5. 按“TL/IL”转至荧光观察，通过前 面板按钮 选择 适宜的 滤块，见下 图，样品观察完毕后按 Shutter 键 阻断荧光光路以保护样品
共聚焦——设置采图条件
1. 按顺时针方向打开激光电源 2. 在Beam Path下调用已存的采图参数， 或重新进行光路设置： 1) 选择合适的激光谱线 2) 调节激光输出功率 3) 选择合适的分光镜 4) 选择合适的接收范围 (可拖动黑色滑块或双 击后输入接收波长范围) 5) 选择适宜的伪彩 6) 调节PMT Gain值 (检测器灵敏度) 和PMT Offset值 (背景值)
Living up to Life
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共聚焦——三维层切
1. 单击 Live进行预览，调至合适的 焦平面，再调节激光强度、接收 范围、PMT Gain和Offset等参数 2. 单击Set Plane记录焦平面位置
Living up to Life
3. 继续预览，改变 z 轴层面以确定 层切的起点和终点，红色表示已 设定
Living up to Life
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共聚焦——波长扫描
1. 选择xyλ模式 2. 单击Live进行预览，调至合适的焦平 面，再调节激光强度、接收范围、 PMT Gain和Offset等参数 3. 停止预览 4. 设定接收总范围的起点和终点 5. 设定接收带宽 (默认值为10nm) 6. 设定 采集帧数 ，或接收带宽的 步进 值 7. 适当增加激光强度并提高PMT Gain 值，单击Start按键进行波长扫描
5. 根据图像调节激光强度、接收范 围、PMT Gain及Offset等参数 6. 如对图像满意，单击Live停止预览 7. 如有必要，单击 Save 保存当前参 数，便于以后调用
Leica激光共聚焦显微镜 操作规程
潍坊医学院医学研究实验中心仪器简明操作规程汇编
激光共聚焦显微镜简明操作规程
1. 启动
开启UPS电源，依次开启右侧手柄上的三个开关，从左至右顺序开启，最后开启激光钥匙。
2. 开启软件
电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面启动共聚焦操作软件。
3. 自检
点击对话框的“OK”键进行自检，结束后进入软件界面
4. 开启激光管
点击屏幕上方的“configuration”按钮进入配置界面→点击左边
按钮→打开所需激光（OFF →ON ），Argon激光还需拖动右方滑块以调节输出功率
5. 设置参数
6. 放置样品进行观察。
7. 观察结束保持数据。
8.关机，做好记录。
激光共聚焦扫描显微镜操作规程
激光共聚焦扫描显微镜操作规程一．开机程序1．开启总电源，确认所有仪器电源状态正常工作2．开启电脑，双击桌面上的LSM510图标，开启显微镜。
3．在初始平面上点击Start Expert Mode 键开启专家拍摄模式。
4．在主菜单中点击File New键，建立新的数据库。
二．软件拍摄1．在主菜单上点击Acquire Laser键，开启需要使用的激光2．在主菜单上点击VIS键，开启显微镜观察模式3．把需要观察的玻片放到载物台上选择需要观察的平面4．在主菜单上点击LSM键，开启进入显微镜激光扫描模式5．在主菜单上点击Config键，选择所需要扫描的模式及参数6．在主菜单上点击Scan Find键，进行图像参数自动校正7．在Scan子菜单下点击Fast X键，进行层面选择8．在连续扫描中调节放大器增益、补偿；激光强度等图像参数来优化图像9．点击图像子菜单上的Save键存储优化好的图像三．关机程序1．完成所有操作后，关掉激光开关，冷却5分钟后，点击主菜单上Exit键，退出所有程序2．关闭电脑3．关闭电源ZEISS 510 MET A二维扫描程序1.在Acquire → config →确定扫描所需的波长，（如果已作过相同方法的扫描，可直接调出一张相同条件的图像，用图像窗中的Reuse确定有关的扫描条件）2.在Acquire → micro →在低倍镜(透射光或荧光)下找到要观察的图像3.在Scan control → mode → find →在显示器上找到图像，选定扫描需用的分辨率4.调节物镜到适当的放大倍数5.Scan control → mode →New，打开一新图像窗6.在Scan control → mode → cont →用zoom将图像大小调至最佳，用Pinhole（一般选1）、Detector Gain（650左右，不宜时间超过800，也不宜低于500）、Amplifier offset（不宜过低），以及选择作算术平均值次数、调节激光强度（488nm不超过25%）等调节图像质量至最佳。
Leica共聚焦操作快速流程
Leica共聚焦操作快速流程（电子版在电脑桌面）开机：1.接通3 个电源插座；2.打开控制器和电脑：按照①→ ②→ ③→ ④→ ⑤→ ⑥的序号依次开机；注意:系统开机时，显微镜的载物台会作初始化 xy 移动，请确保载物台周围没有障碍物！此时也不要放置样品；禁止用手转动物镜！！！关机：1.按照⑥→ ⑤→ ④→ ③→ ②→ ①的序号依次关机；2.拔掉3个电源插座；注意:先关电脑，再关仪器！关激光器后，等5分钟左右，等风扇停止后，再关电源！激光器的开关： ON 钥匙转到垂直位置OFF 钥匙转到水平位置软件快速操作：1.在桌面上，双击打开显微镜控制软件的图标“LAS AF ”：2.出现如下图标，直接点击“OK ”直接点击“ OK ”3.进入软件操作界面后，点击“Configuration ”（1），然后点击“Laser Config ”（2），再打开所需要的激光器开关“ON/OFF ”（3）；1324.点击“Acquire ”；点击“SEQ ”125.选择物镜；注意：禁止用手转动物镜！！！选择物镜6.有多个染料需要多个通道时，点击“+ ”增加通道；7.比如：选中“Seq. 1 ”后，打开405激光器；选择探测器PMT 1；选择染料DAPI；2 138. 然后选中“ Seq. 2 ”后 ， 打开488激光器 （不关Laser 405，激光强度调到0）；选择探测器PMT 2；选择染料Alexa 488； 如果需要DIC 图像，则打开探测器“PMT Trans ”；注意： 探测器探测激发波长的范围 不能 与激光线重合！【 没有特殊需求，不要用“HyD 3”探测器！！ 】123少用HyD3DIC激光强度为09.点击软件左下方的“Live”，进行图像预览；调节“Gain”增加探测器探测信号的灵敏度（一点蓝）；调节“Offset”去背景（一片绿）；注意： Gain值必须小于 800 ！！这里可以结合增加激光强度和Gain值来调荧光信号。
leica共聚焦显微镜使用说明
Leica共聚焦显微镜使用说明Step 1: 打开PC电源——“1”Step 2: 打开汞灯控制开关——“2”Step 3: 打开中控盒——“3”Step 4: 打开计算机主机——“4”，启动计算机。
注：计算机操作系统启动后方可继续开机！！Step 5: 顺序打开激光器电源Scanner—“5”，激光冷却系统LASER Ar/ArKr—“6”★注：须确认冷风开启后方可打开激光电源！！！！！Step 6: 将上图虚线框中激光功率控制旋钮——“6.5”顺时针旋转60°左右。
Step 7: 将上图所示488 nm激光管开关——“7”钥匙沿顺时针旋转约120°至显示灯亮，再将钥匙旋回竖直位置Step 8: 依次将上图所示543/594 nm激光管开关——“8”和633 nm 激光管开关——“9”钥匙沿顺时针旋转约90°至显示灯亮。
Step 9:依次打开半导体激光器电源——“10”和405 nm激光管开关——“11”，（“11”的开启方式同“8”、“9”。
）Leica共聚焦显微镜关机顺序及注意事项Step 1: 关闭软件→拷贝Data→关闭计算机Step 2: 依照开机顺序倒序关闭各个开关，由”11”→”7”, ”5”→”1”。
★注：（1）冷风——”6”不能立即关闭！！须在关闭所有硬件设备30min 后方可关闭，以使激光管完全冷却，延长使用寿命。
（2）PC电源——“1”须在电脑确定关闭后方可关闭！！数据采集Step 1: 实验前扫描样本片观察激光通路是否正常工作。
Step 2: 上样，须轻起轻落科勒照明系统，选择合适倍数物镜，通过FLUO键选择相应荧光通道，调节载物台和焦距，找到合适视野。
Step 3: 点击由Visual→Scan，点击选择扫描模式，如xy, xyz, xyt, xyzt, xyλ etc..点击选择扫描格式（一般为默认值512*512）。
Step 4: 点击打开Beam path setting窗口，对光路和检测器进行设置。
激光扫描共聚焦显微镜使用说明
激光扫描共聚焦显微镜使用说明标签：激光扫描共聚焦显微镜使用说明激光扫描共聚焦显微镜可以：（1）光切片扫描、3D图像处理、时间序列拍摄成像；（2）细胞、绿荧光蛋白、生物荧光样品观察分析；（3）荧光原位杂交分析。
详细实验方法共聚焦显微镜激光扫描法实验方法原理激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
实验材料细胞试剂、试剂盒荧光染料水培养基仪器、耗材激光扫描共聚焦显微镜载玻片洗瓶滴管试管实验步骤一、观察及仪器操作1. 开启仪器电源及光源一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。
以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。
使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
2. 设置相应的扫描方式在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。
切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
3. 获取图像选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
4. 关闭仪器仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。
若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
二、获取三维图像激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书[激光扫描共聚焦显微镜操作指南说明书]引言：本操作指南为用户提供激光扫描共聚焦显微镜的详细操作流程及相关注意事项。
在使用本设备之前，请仔细阅读本指南，以确保能够正确、安全地操作设备，并获得最佳的成像效果。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的显微镜技术，结合了共聚焦成像和激光扫描技术，可以实现高分辨率、三维成像及活细胞观察等功能。
本设备由以下主要部分组成：1. 共聚焦显微镜主体：包括光源系统、光学系统、扫描系统、探测器等核心部件。
请勿对主体进行任何未经授权的拆卸或修改。
2. 控制系统：用于控制设备的开关、成像参数设置、图像采集及处理等功能。
在操作设备之前，请确保控制系统处于正常工作状态。
二、准备工作在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请进行以下准备工作：1. 检查设备：确保设备的电源线、信号线、光纤等连接线路良好，无损坏或松动情况。
2. 准备标本：根据需要观察的样本类型，准备适当的标本片，并在标本片上施加适当的荧光染料。
3. 调整镜片：根据需要选择适当的镜头，并按照设备说明进行安装和调整。
三、操作步骤以下为基本的操作流程，具体步骤可能会因设备型号和厂家而有所不同，请根据实际情况进行操作：1. 打开设备电源：将电源开关置于“开启”位置，待设备启动完全后，检查设备各部分是否正常。
2. 设置成像参数：通过控制系统，设置激光波长、放大倍数、成像模式等参数。
根据标本类型及观察需求，合理选择参数设置。
3. 校准镜片：根据设备说明书，进行扫描头和标本之间的焦距调整，保证成像过程中的清晰度和准确度。
4. 开启激光：根据标本需要，选择相应的激光波长，并逐一打开相应激光。
5. 定位标本：通过显微镜目镜进行初步观察，调整位置和焦距，使标本位于成像区域。
6. 开始扫描成像：在控制系统中选择扫描图像模式，点击“开始扫描”按钮，启动扫描成像过程。
7. 图像采集和处理：根据需要，可设置图像采集的帧数、分辨率等参数，并在采集图像后进行必要的图像处理和分析。
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书操作说明书激光扫描共聚焦显微镜是一种高端的显微镜设备，具有高分辨率、高灵敏度的特点，广泛用于生物学、医学、材料科学等领域。
为了正确且有效地操作激光扫描共聚焦显微镜，本操作说明书将为您提供详细的指导。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜由以下主要部分组成：1. 显微镜主体：负责接收样本的光信号，并进行扫描成像。
2. 激光系统：提供高能量、高稳定性的激光光源，用于激发样本的荧光信号。
3. 探测系统：用于接收样本的荧光信号，并将其转化为图像信号。
4. 控制系统：提供对显微镜参数进行调节和设置的功能。
二、注意事项在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请确保您已熟悉以下注意事项：1. 安全操作：激光光源具有较强的激光辐射，请佩戴适当的激光防护眼镜并避免直接暴露于激光光束下。
2. 样本准备：样本应事先处理好并放置在适当的载玻片上，确保样本表面平整，避免气泡或杂质的干扰。
3. 导入样本：轻轻将载玻片插入显微镜主体的样本台中，并用调节旋钮精确定位样本。
4. 参数设置：根据实验需要，设置合适的激光功率、放大倍数和扫描速度等参数，确保获得清晰的图像。
5. 镜头清洁：定期清洁显微镜镜片，避免灰尘或污渍影响成像质量。
注意使用专用的镜头清洁纸和清洁液。
三、操作步骤基于激光扫描共聚焦显微镜的特点，以下为一般操作步骤的指导：1. 打开设备电源，等待设备启动并进行自检。
2. 调节放大倍数：通过显微镜主体上的放大调节旋钮，调节适当的放大倍数，以便观察到合适大小的图像。
3. 确定激光功率：在控制系统中，设置合适的激光功率以激发样本的荧光信号，避免过高的功率导致样本损伤。
4. 调整扫描速度：通过控制系统中的扫描速度调节器，设置合适的扫描速度，以获得清晰且稳定的图像。
5. 对焦样本：使用显微镜主体上的对焦调节旋钮，将样本调焦至最清晰状态。
6. 开始扫描：通过控制系统中的扫描启动按钮，启动扫描功能，并观察图像显示区域是否居中和清晰。
LeicaSP8STED3X激光扫描共聚焦显微镜的使用研究
引言
激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是随着计算机技术和光电技术的飞速 发展而诞生的新一代显微镜，它不仅能观察固定的细胞和 组织切片，还能对活细胞的微观生命活动在分子和离子水 平进行实时动态观察，实现细胞形态定位、三维结构重组、 定量荧光测定和定量图像分析，在分子细胞生物学领域，
FEATURES
专 论
Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微 镜的使用研究
Research of Using Laser Scanning Confocal Microscopy Leica SP8 STED 3X
狄伶
上海交通大学 分析测试中心，上海 200240 [摘 要] 本文主要介绍上海交通大学分析测试中心配置的Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微 镜的组成、技术参数和工作原理，它在Leica TCS SP8共聚焦显微镜基础上搭载了超分辨模块、活 细胞工作站和双光子模块，既可以开展纳米水平的亚细胞结构和动力学的研究，也可以观察活细 胞中亚细胞器的运动特性及变化，是一个具备多种检测功能的超高分辨共聚焦显微系统。超高分 辨率荧光显微技术主要包括基于调制照明光斑以缩小系统的点扩散函数的超分辨技术和基于单分 子定位的超分辨技术。同时也简述了样品的制备方法和图像采集的参数设置原则，以及日常维护 和管理，具有临床借鉴意义。 [关键词] 激光扫描；Leica SP8 STED 3X；图像采集；共聚焦；显微镜 Abstract: This paper mainly introduced the components, technical parameters, working principle of confocal laser scanning microscope Leica SP8 STED 3X equipped in the Instrumental Analysis Center of Shanghai Jiao Tong University. This microscope, based on the Leica TCS SP8 confocal microscope, is equipped with super resolution model - stimulated emission depletion, live cell station and two-photon module; it can be used to carry out nano-level sub-cellular structure and dynamics study, and can also be used to observe subcellular organelle movement characteristics and changes of living cell, is a ultra-high resolution confocal microscopy system of various detecting functions. Ultra-high resolution fluorescence microscopy includes super-resolution technology based on modulation of light spot to reduce point spread function of the system, as well as super-resolution technology based on single-molecule localization. Meanwhile, preparation method of the sample, parameter setting principle of the image capture, and the routine maintenance and management, were also discussed, which has great significance in clinical practice. Key words: laser scanning; Leica SP8 STED 3X; image capture; confocal; microscope
激光共聚焦显微镜操作手册最终版
徐珏2011.12.3 17:59 于苏州宝石御景园目录标准探测模式（DU4）图像拍摄流程 (1)一、软件开启 (1)二、基本设置 (2)[A1 Setting]界面主要功能区域简介 (2)[Setting]界面功能简介 (4)[Filter and Dye]功能区简介 (6)串色现象解释及Line模式图解 (6)Line模式图解 (7)[scan setting]功能区简介 (7)三、获得图像 (8)[Acquisition]功能区简介 (10)放大方式选择按钮简介 (13)图片扫描参数调用简介 (17)JP2格式图片转化为JPG/TIFF格式图片的操作 (18)各通道荧光图像自由叠加的介绍 (18)数据分析 (21)一、ROI区域分析 (21)二、LUTs调节图像荧光亮度 (23)三、去背景 (25)四、标尺添加 (26)六、长度面积等常规测量 (28)七、细胞计数 (28)[Binary Toolbar]界面简介 (32)光谱扫描模式（SD模式） (34)一、SD模式基本设置 (34)[Detector]标签页功能简介 (35)[Binng/Skip]标签页简介 (36)二、图像获得 (37)三、数据分析 (39)[Spectrum Profile]视窗简介 (40)四、光谱拆分 (40)虚拟滤光扫描模式（VF模式） (47)一、VF模式基本设置 (47)[Detector]设置标签页简介 (48)[Gating Setting]标签页简介 (48)二、获得图像 (48)时间序列拍摄 (49)[Capture Timelapse]视窗简介 (49)[ND]界面简介 (51)[Time Measurement]界面简介 (53)[Capture Z-series]视窗简介 (55)拼大图拍摄 (60)光活化序列拍摄 (61)[Photo Acquition]功能区简介 (62)[Sequential Stimulation]界面简介 (63)常见细胞类型和细胞器形状 (65)常用荧光染料及应用领域 (68)标准探测模式（DU4）图像拍摄流程一、软件开启1、双击桌面NIS-Element图标。
LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13
Leica激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司2013年3月目录：1 系统的组成系统组成 (3)光路示意图 (4)2 系统的使用2.1 开机顺序 (5)2.2 软件界面简介 (7)2.3 在显微镜下观察样品 (8)2.4 采集共聚焦图像 (9)2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11)2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15)2.7 波长扫描（xyλScan） (16)2.8 HyD检测器 (17)2.9 图像的保存及输出 (18)2.10 关机 (20)3 系统的维护 (21)Leica SP8 系统组成图1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）*5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔7STED 激光* 21Fluorifier盘*8Setlight监控二极管22X1出口接口*9AOBS, 及其他选配件23外置检测器*10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜11红外激光耦合25分开的荧光光谱12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器13STED激光耦合*选配组件14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件2系统的使用2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图）（1）因为FSU 和CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机：FSU系统CSU 系统依次打开“PC Microscope”、“Scanner Power ”、“Laser Power ”三个按钮，将“Laser Emission ”上的激光开关钥匙旋至“On-1注意：显微镜控制器的开关 一般是常开的，在打开“PC Microscope ”按钮后指示灯应该点亮，如果不亮，请打开其开关。
激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。
LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。
我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。
使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。
2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。
3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。
4、在熟练使用者的指导下，进行实验。
5、实验结束，及时归还钥匙。
仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。
illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
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Leica激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司2013年3月目录：1 系统的组成系统组成 (3)光路示意图 (4)2 系统的使用2.1 开机顺序 (5)2.2 软件界面简介 (7)2.3 在显微镜下观察样品 (8)2.4 采集共聚焦图像 (9)2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11)2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15)2.7 波长扫描（xyλScan） (16)2.8 HyD检测器 (17)2.9 图像的保存及输出 (18)2.10 关机 (20)3 系统的维护 (21)Leica SP8 系统组成图1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）*5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔7STED 激光* 21Fluorifier盘*8Setlight监控二极管22X1出口接口*9AOBS, 及其他选配件23外置检测器*10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜11红外激光耦合25分开的荧光光谱12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器13STED激光耦合*选配组件14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件2系统的使用2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图）（1）因为FSU 和CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机：FSU系统CSU 系统依次打开“PC Microscope”、“Scanner Power ”、“Laser Power ”三个按钮，将“Laser Emission ”上的激光开关钥匙旋至“On-1注意：显微镜控制器的开关 一般是常开的，在打开“PC Microscope ”按钮后指示灯应该点亮，如果不亮，请打开其开关。
先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打开显微镜控制器 的开关，然后依次打开 “Scanner Power ”、“Laser Power ”两个按钮，将“Laser Emission ”上的激光开关钥匙旋至“On-1（2）打开荧光激发光源（按绿色的Power 按钮，如右图）光源亮度调节旋钮 光闸 Power 按钮（3）电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面“LAS AF”图标启动共聚焦操作软件。
（4）进入配置选择界面后，在“Configuration”下拉菜单中选择需要的配置；（其中带有“simulator”字样的为模拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能拍摄图像，适合处理数据）“Microscope”菜单中选择显微镜型号；（图中“Resonant”选项为快扫功能，可按需要打开或关闭，只有配备了快扫功能的系统才会显示该选项），点击“OK”，系统继续启动。
（5）在“Initialize Stage”提示界面选择是否初始化载物台（如果选择“No”，则Tile scan、Mark&Find和Matrix功能不能使用）。
注意：如果配置的是手动载物台，则不会跳出该提示界面。
（6）系统自检完后，进入LAS AF操作界面，点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面→点击左边“Laser Config”按钮→打开所需激光（OFF→ON），Argon激光还需拖动右方滑块以调节激光输出功率2.2软件界面简介功能界面切换：参数设定（Configration）、扫描取图（Acquire）、图像处理（Process）、定量测量（Quantify）工具和文件管理界面切换：Experiments界面下显示当前拍摄和打开的图片，Acquisition下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数拍摄参数：包括图像像素Format、扫描速度speed、图像放大Zoom factor、视野旋转Rotation等。
三维扫描工具组，用于设定和显示三维扫描的Z轴范围，及其他辅助设定光路显示及设置区域，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置图像显示窗口预设光路选择按钮激光控制栏分光镜选择按钮物镜选择按钮预览按钮，可用于开始和停止预览拍摄图像按钮叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通道叠加后的图像界面缩放调节滑块，左右拖动可以调节界面项目的显示比例界面调整栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围2.3在显微镜下观察样品2.3.1选择物镜：可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives”按钮进行选择（如下图）。
（在显微镜设置软件Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换，在干/油镜之间切换时需要先按一下此按钮才能完成转换）2.3.2明场观察：将样品置于载物台上，按显微（因镜左侧的TL/IL按钮打开明场光路（如右图）显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能打开），在明场条件下选择合适的视野。
通过调焦按钮或旋钮调节至合适的z轴平面，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。
如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节载物台的运动以选择合适的视野（如下图）。
2.3.3按显微镜前面板的荧光滤块选择按钮切换至荧光观察光路（如右图所示），其上的标注与荧光颜色的对应关系为：I3 -绿色，N2.1--红色，A—蓝色，有些配置的显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不同，请以实际情况为准。
再按荧光光闸按钮（SHUTTER）打开荧光，进行样品的荧光观察。
2.3.4观察完毕后，按显微镜前面板上的“SHUTTER”按钮以保护样品2.4采集共聚焦图像2.4.1光路设置：调用已有的设置：选择“Load/Save singlesetting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器gain 及offset都会自动设置，包含几种最常用的荧光染料。
选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进行优化（如后述），并以新的名称保存。
（如右图）修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT 检测范围、调节PMT 的gain 或offset等。
如下图。
建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。
选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。
分光镜选择原则：根据所用激光波长来选择合适的分光镜。
○1405激光选择Substrate；○2其他可见波长的激光根据其波长选择分光镜，如488激光可选择DD488/552、TD488/552/638分光镜。
○3RT 15/85分光镜所有波长激光都可用，但是会损失85%的激光能量和15%的荧光能量，一般在进行光谱扫描的时候选用。
Sequential Scan:若染料的发射光谱有重叠，为减少串色，成像时每种染料要单独激发，或者说，每次只用一种激发光激发，并只检测一种染料。
可用Sequential Scan来实现。
（如右图）激活SequentialScan功能，可在下面的Seq中分别设置各个染料的激发和检测光路。
2.4.2选择扫描模式默认模式为xyz 扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy 扫描和z 轴层切（xyz 扫描）。
还可在下拉菜单中选择由x，y，z，t （时间）以及λ（波长）组合而成的多维扫描模式，如xzy，xyt，xyλ，xyzt，xyzλ，xyzλt 等。
2.4.3设置扫描参数包括分辨率（format）、扫描速度（speed）、针孔大小（pinhole）、线平均（line average）、面平均（frame average）、累加（accumulation）及放大倍数（Zoom）等。
（如右图）分辨率：默认值为512×512。
也可选择更低或更高分辨率。
分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。
扫描速度：默认值为400Hz。
活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。
可选择双向扫描（Bidirectional X）来达到更高速度，这时可能需要进行相位校准（Phase correction）。
针孔大小：默认值为1AU。
如果增大针孔直径，可增加信号强度，但是所获取图像的共聚焦效果会降低，光切厚度也会随之增加。
平均：用于降低背景噪音。
分为线平均（Line average）和面平均（Frame average），可在下拉菜单中选择平均的次数。
累加：仅用于荧光非常弱的样品2.4.4预览图像点击软件Acquire界面左下方的“Live”按钮以预览图像（下图），图像将显示在右侧的显示屏上。
预览开始后，“Live”按钮变为“Stop”，点击“Stop”按钮可停止预览。
注意：一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应快速操作，尽量减少预览的时间。
建议：点击Live按钮之前，可调节format至512×512，speed至600Hz 以获得较快的刷新频率。
预览应达到以下目的：○1找到最适合观察的焦平面；○2使图像亮度动态范围达到最佳。
可通过调节控制面板的“Z Position”旋钮找到最适合观察的焦平面（如下图）；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第8页图）。
图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第9页图）、Smart Gain和Smart Offset（见上图）。
参数的调整原则：（1）Smart Gain的调节：增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。
一般情况下，Gain值的正常范围为500—1000；（2）Smart Offset的调节：可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。
原则上，在保证图像质量的前提下，Digital Offset值越接近于0越好；（3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度：激光强度越高，则信号越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。
当PMT gain值高于800或HyD gain值大于100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度。
在做活细胞或者光切时，应尽量减少激光强度，原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。
图像亮度动态范围的判断方法：理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和，可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。
LUT 按钮（下图红圈）可在LUT（即指定的荧光颜色，也称伪彩）、“Glow Over Under （GlowOU）”和灰度图三档之间切换。
在GlowOU 模式中，灰度值达到饱和的像素点显示为蓝色，而灰度值为0的像素点显示为绿色。