最新GUS组织化学染色
gus染色原理
gus染色原理
Gus染色原理。
Gus染色是一种用于检测β-葡萄糖苷酶活性的方法，它是以β-葡萄糖苷酶的
底物5-氯-4-溴-3-吲哚基葡萄糖（X-葡萄糖）为基础的染色方法。
在染色过程中，
X-葡萄糖会被β-葡萄糖苷酶水解，产生游离的5-氯-4-溴-3-吲哚基（X-吲哚），然后X-吲哚会与染色底物中的氧化剂氧化反应，生成可见的蓝色产物，从而实现对
β-葡萄糖苷酶活性的检测。
Gus染色的原理可以分为以下几个步骤：
1. 底物水解，X-葡萄糖是β-葡萄糖苷酶的底物，当β-葡萄糖苷酶存在时，它
会催化X-葡萄糖的水解反应，将其分解为X-吲哚和葡萄糖。
2. 氧化反应，X-吲哚与染色底物中的氧化剂（如溴化4-溴-3-吲哚苯）发生氧
化反应，生成可见的蓝色产物。
3. 结果观察，通过观察样品的颜色变化，可以判断β-葡萄糖苷酶的活性水平。
活性高的样品会呈现深蓝色，活性低的样品则会呈现浅蓝色或无色。
Gus染色方法具有操作简便、结果直观、灵敏度高的特点，因此被广泛应用于
细菌、植物和动物细胞等生物体系中对β-葡萄糖苷酶活性的检测。
同时，Gus染
色还可以在组织学研究中用于检测β-葡萄糖苷酶的表达情况，为研究者提供重要
的实验数据。
总的来说，Gus染色是一种简单而有效的β-葡萄糖苷酶活性检测方法，其原理清晰，操作方便，结果可靠。
在生物学研究中具有重要的应用价值，为科研工作者提供了有力的实验手段。
通过对Gus染色原理的深入了解，可以更好地应用和优
化这一方法，为科学研究提供更加可靠的数据支持。
【实验】β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS) 组织化学染色检测转基因植物
整理课件
用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的 特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花 和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和 马铃薯这些植物的茎和叶在染色前必须切成薄片。 有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有 所帮助。
整理课件
实验材料和试剂
实验材料：转GUS基因的烟草叶片 试剂：
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物
整理课件
实验目的
学习转GUS基因的植物组织化学染 色方法，掌握染色的原理。
整理课件
实验原理
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用 的一个报告基因。GUS基因是从大肠杆菌中分离出来的，在 GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融 合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检 测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用Xgluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进 行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割 葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧 基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。
1．50mmol/l 磷酸钠缓冲液 A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml 水中。 B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml 水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、 0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
整理课件
用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活 性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累； 3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然， 也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但 这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定， 因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3） 在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象， 但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾 或者二者都加来使这种渗漏减至最少；4）同所有的组织化学方法
gus染色原理
gus染色原理Gus染色原理。
Gus染色是一种用于研究植物组织中β-葡萄糖苷酶活性的常用方法。
这种染色方法利用了β-葡萄糖苷酶对X-葡萄糖苷基苯基酚的水解作用，使得组织中含有该酶的部分在染色后呈现出蓝色的颜色。
下面将介绍Gus染色的原理及其应用。
Gus染色的原理主要是利用了β-葡萄糖苷酶对X-葡萄糖苷基苯基酚的水解作用。
X-葡萄糖苷基苯基酚是一种无色底物，在β-葡萄糖苷酶的作用下，会被水解成苯基酚和葡萄糖。
而苯基酚在碱性条件下会发生氧化反应，生成蓝色产物。
因此，含有β-葡萄糖苷酶的组织在Gus染色后会呈现出蓝色，从而可以直观地观察到该酶的活性分布情况。
Gus染色在植物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究植物生长发育过程中β-葡萄糖苷酶的活性分布情况。
通过对不同发育阶段的植物组织进行Gus染色，可以清晰地观察到该酶在不同组织中的表达情况，从而揭示其在植物生长发育中的作用。
其次，Gus染色还可以用于研究植物对逆境的响应机制。
在逆境条件下，植物体内的β-葡萄糖苷酶活性可能会发生变化，通过Gus染色可以对其进行快速、直观的检测，从而揭示植物对逆境的生理响应。
除了在植物学研究中的应用，Gus染色还可以用于转基因植物的筛选。
在转基因植物中，外源基因通常会与Gus基因进行融合，从而使得转基因植物组织中具有Gus活性。
通过对转基因植物进行Gus染色，可以快速、准确地筛选出具有外源基因表达的植物组织，为转基因植物育种提供了重要的技术手段。
总之，Gus染色作为一种常用的酶活性检测方法，在植物学研究中发挥着重要作用。
它不仅可以用于研究植物生长发育过程中酶活性的分布情况，还可以用于研究植物对逆境的响应机制，以及转基因植物的筛选。
相信随着技术的不断进步，Gus染色方法将在植物学研究中发挥更大的作用。
GUS 组织化学染色-拟南芥
幼苗GUS染色实验GUS洗液配方：0.1 M PBS, pH 7.010mM EDTA2mM 亚铁氰化钾potassium ferrocyanide2mM 六氰合铁酸钾potassium ferricyanide300mL中加0.254 g亚铁氰化钾，0.198 g六氰合铁酸钾，EDTA 6 mL（10 mM）GUS染色液(1mM)就是把5 mg X-Glus（5 mg加100µL DMSO助溶，X-Glus用前离心3min）加到5 mL洗液里即成染色液。
一次配5 mL染色液，1.5 mL离心管每管分装200 µL，锡纸包住-20℃保存。
步骤：一般5d幼苗可进行试验，早上做以方便白天随时观察幼苗着色情况。
1.90%丙酮固定20min；(丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好，因此可用于GUS染色前的固定，可防止GUS信号的扩散。
缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。
一般4℃下20分钟为宜)2. 加1 mL GUS洗液洗去丙酮，洗2遍；3. 加GUS染色液，冰上抽真空15-20 min；4. 37℃放置，隔一阵观察一下，染上色了就进行下面步骤；5. 吸出染色液，加入1 mL 70%乙醇，停止染色反应及脱色；6. 更换几次乙醇直到脱色完全；7. 解剖镜及显微镜拍照观察载玻片上加适量HCG透明液，用镊子取出幼苗在透明液中铺平，盖上盖玻片，解剖镜观察整株，显微镜观察细节并拍照。
实验原理：GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，相当稳定而不易降解。
根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）。
其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。
gus染色原理
gus染色原理Gus染色原理。
Gus染色是一种常用的细胞染色技术，用于检测β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）的活性。
β-葡萄糖苷酶是一种水解酶，能够水解含有葡萄糖醛酸酯的底物，产生游离的葡萄糖醛酸。
Gus染色的原理是利用β-葡萄糖苷酶水解底物后产生的蓝色产物，对细胞或组织进行染色，从而观察β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况。
在进行Gus染色之前，首先需要准备Gus染色液和底物。
Gus染色液通常由染色缓冲液、染色底物和其它辅助试剂组成。
染色底物是一种含有葡萄糖醛酸酯的化合物，一般为5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖醛酸（X-gluc）。
X-gluc在β-葡萄糖苷酶的作用下会产生蓝色的沉淀物，用于显示β-葡萄糖苷酶的活性。
辅助试剂通常包括有机溶剂、金属离子螯合剂等，用于增强染色效果和稳定染色产物。
在实际操作中，将待检测的细胞或组织样品加入Gus染色液中进行染色处理。
在适当的温度和时间条件下，X-gluc会被β-葡萄糖苷酶水解，产生蓝色的沉淀物。
通过显微镜观察染色结果，可以直观地了解β-葡萄糖苷酶在样品中的活性和分布情况。
活性高的细胞或组织会呈现出深色的染色，而活性低的则呈现较浅的染色或无染色。
Gus染色技术在植物学、动物学和微生物学等领域得到了广泛的应用。
在植物学中，可以利用Gus染色观察植物各部位中β-葡萄糖苷酶的表达情况，从而研究植物的生长发育过程和应激响应机制。
在动物学中，Gus染色也可用于研究动物胚胎发育过程中的基因表达和细胞分化情况。
在微生物学中，Gus染色可以用于检测细菌和真菌中β-葡萄糖苷酶的活性，从而研究微生物的代谢特性和环境适应能力。
总之，Gus染色技术是一种简单、直观的细胞染色方法，能够有效地检测β-葡萄糖苷酶的活性和分布情况。
通过对样品进行Gus染色，可以为细胞生物学和生物化学研究提供重要的实验数据，促进对生物学问题的深入理解和探讨。
随着生物技术的不断发展，相信Gus染色技术在生命科学领域中会有更广泛的应用和深入的研究。
GUS染色操作
Updated 03/05/09 powered by Li-WenyangGUS染色操作1．取材（避免夹伤）；2．PBS漂洗3次；3．加入染色液，37C避光反应（如何控制反应时间：” Incubate seedlings at 37C until the desired staining intensity is observed”, ACC培养基上 5X EBS-GUS/Col-0 3天黄化苗经染色约2小时，在根的上半部就会有明显蓝色出现）；4．回收染液；5．PBS漂洗3次；6．固定液室温固定2~4小时，或者过夜；7．95%乙醇（目的是使用接近固定液浓度的乙醇）漂洗数次至脱掉色素（室温或者37C均可）；8．70%乙醇漂洗（目的是让材料在接近生理浓度时恢复形状）；9．透明液室温透明15’，或者过夜（推荐1~24h）；10．临时压片观察，照相。
注明：阴影字为快捷操作步骤，另外绿苗在此操作基础上需要进行脱色／透明操作，快捷步骤为100%乙醇、37C漂洗数次至脱掉绿色。
●PBS：100mM磷酸盐缓冲液A液：3.582g Na2HPO4·12H2O溶解于无菌蒸馏水，定容至10ml；B液：1.56g NaH2PO4·2H2O溶解于无菌蒸馏水，定容至10ml；取5.77ml A试剂、4.23ml B试剂混合，无菌蒸馏水定容至100ml；●staining buffer取40ml PBS，依次加入试剂：0.01861g EDTA0.01211195g 六氰合铁(II)酸钾0.016462g六氰合铁(III)酸钾（加入铁盐的目的：防止无色反应中间产物渗漏）用PBS定容至50ml，加入1% Trrton-X 100，避光保存；●GUS染液用EP管称取适量X-gluc粉末，加入少量DMSO或 N,N-二甲基甲酰胺助溶（一般溶解10mg 粉末约10~20ul二甲基甲酰胺），然后用staining buffer配成终浓度为1mg/ml的GUS染液，避光保存；●固定液无水乙醇：冰醋酸=9：1●透明液：30 ml H2O80 g 水合氯醛10 ml 100%甘油搅拌约1小时，使之充分溶解●背景GUS 基因由大肠杆菌E. coli 菌株K12 中uidA (也称为gusA) 基因座编码。
GUS组织化学染色方法
GUS基因组织化学染色
将共培养后的材料从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，切至0.2cm大小，放入离心管中，加入Buffer A至没过愈伤组织，置于37℃环境中，侵泡1 h。
用移液枪将Buffer A 吸出，加入Buffer B至没过愈伤组织，置于37℃黑暗环境中染色，至材料出现蓝色。
若叶绿素影响观察，可用75%乙醇漂洗材料，做脱色处理。
最后用蒸馏水将材料洗净，观察统计染色数。
Buffer A成分如下：
0.2 M NaPO4 buffer （PH 7.0）25 ml
蒸馏水23.75 ml
0.1 M K3[Fe(CN)6] 0.25 ml
0.5 M Na2EDTA 1 ml
Total 50 ml
其中0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由0.2 M Na2HPO4和0.2 M NaH2PO4配制而成。
每100ml的0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由62 ml 0.2 M Na2HPO4和38 ml 0.2 M NaH2PO4混合而成。
Buffer A置于4℃保存。
Buffer B由Buffer A和X-gluc 1：1混合配制而成。
Buffer B置于-20℃，避光保存。
Gus染色试剂配制及使用方法
Gus染⾊试剂配制及使⽤⽅法●产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D- 葡萄糖苷酸酶)基因是⽬前常⽤的⼀种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是⼀种⽔解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的⽔解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-gluc.htm' target=_blank>x-gluc）分解为蓝⾊的物质，其检测⽅法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
因为绝⼤多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因⼴泛⽤作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中⼴泛应⽤。
该试剂盒包含GUS染⾊的全部试剂，使⽤⽅便，只需将染⾊液和缓冲液按照⽐例混合即配成GUS染⾊液。
该试剂盒可以配制50ml GUS染⾊液。
●贮存和效期：X-gluc染⾊液-20℃保存；GUS染⾊缓冲液4℃贮存。
⾃开封之⽇起有效期⼀年。
●使⽤说明：⼀. GUS染⾊液配制：X-gluc染⾊液为50×浓缩液，使⽤前⽤GUS染⾊缓冲液稀释50倍即配成GUS染⾊液。
如0.1 ml X-gluc染⾊液加⼊到5 ml GUS 染⾊缓冲液中，即配成5 ml GUS染⾊溶液。
该染⾊溶液最好现⽤现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。
⼆. GUS染⾊步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染⾊液中，于25-37℃保温1⼩时⾄过夜。
2.叶⽚等绿⾊材料转⼊70%⼄醇中脱⾊2-3次，⾄阴性对照材料呈⽩⾊。
3.⾁眼或显微镜下观察，⽩⾊背景上的蓝⾊⼩点即为GUS表达位点。
注：⽤于染⾊的植物材料的制备⽅法要因涉及的特定组织和器官的不同⽽异。
例如，拟南芥的根、花和叶⽚以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理⽽直接染⾊。
但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染⾊前切成薄⽚（1-3mm）。
当操作⼤的组织和样品时，可以选⽤真空渗⼊法来帮助底物和酶渗⼊细胞。
GUS能与显⾊底物X-gluc 反应，显现蓝⾊，因⽽可以通过组织化学染⾊定性研究GUS的表达⽔平和表达模式。
GUS 活性检测(总)
GUS 活性检测目的：通过Gus活性测定了解或研究Gus基因是否转化进入植物细胞；Gus基因在植物组织、细胞内的表达部位；Gus基因在植物细胞内瞬时表达量及稳定表达量；外源基因在植物细胞内的表达调控。
材料：转化的植物组织、器官、原生质体、种子的胚及萌发的幼苗等。
一、组织化学染色法试剂：(1)200mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.0）制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。
取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O 调至7.0。
(2)＊说明：GUS活性的精确定位需要有亚铁离。
GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2－，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。
(3)FAA固定脱色液：5％甲醛，5％乙酸，5％乙醇。
材料准备：(1) 瞬时表达检测取浸染后1-5天的材料，稳定表达取转化后处理6周后的材料。
(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。
(3) 悬浮细胞、原生质体低速离收集，无菌等渗液洗涤。
(4) 清洁的愈伤组织可以直接使用直接染色法(1)将准备好的材料浸泡在染液中，于25-37℃保温1小时至过夜。
(2)叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2-3次，到阴性对照材料呈白色。
(3)肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
固定染色法(1)将材料浸入固定液中，必要时可抽真空1分钟，室温下轻摇30-60分钟。
(2)取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3-4次。
GUS组织化学染色
GUS组织化学染色试剂：GUS染色液（200ml）：X-Gluc 100mg； 50mM k4[Fe(CN)6] 2 ml; 50 mM k3[Fe(CN)6] 2 ml；0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 4 ml; 甲醇 5ml；Triton X-100 0.2ml; 加入50mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）补足200ml；无菌膜过滤。
X-Gluc：100mg溶于1ml DMF，保存于4℃50 mM k3[Fe(CN)6]： 0.824g溶于50ml ddH2O，避光保存于4℃50 mM k4[Fe(CN)6]： 1.056g溶于50ml ddH2O，避光保存于4℃50mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）：先配:0.2M Na2HPO4：称取71.632g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水中，0.2 M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水中，然后：62ml的0.2M Na2HPO4与38ml的0.2 M NaH2PO4混合，加蒸馏水稀释至400ml。
二、实验步骤：1. 取新鲜烟草叶片组织于90%丙酮中固定20 min；2. 弃丙酮，加入适量GUS染色液（不含X-Gluc）润洗一遍；3. 加入GUS染色液，真空处理20 min；4. 37℃孵育24h；5. 无水乙醇浸泡24h，除去叶绿素；6. 观察结果并照相。
烟草叶片GUS活性的荧光定量测定MrBAS基因启动子转基因烟草叶片组织器官的GUS活性定量分析以GUS蛋白荧光测定完成,表2 GUS蛋白提取缓冲液TabIe.2 GUS protein extraction buffer组分母液体积50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0) 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0) 50 mL10 mmol/L Na2-EDTA 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL10 mmol/L β-巯基乙醇β-巯基乙醇100μl0.1% TritonX-100 Triton X-100 100μl0.1% SDS 10% SDS 1 mLddH20 补足 100 mL烟草叶片总蛋白的提取1) 取超低温冰箱保存的样品材料并用液氮充分研磨成粉末，分别称取1.2g样品组织于离心管中；2) 向离心管中分别加入1mL GUS蛋白提取缓冲液，涡旋混匀，冰上放置2h至沉淀；3) 4℃ 6000 r/min 离心 20min，收集上清液；4) 滤纸过滤，去除植物组织残渣；5)吸取200μl上清液，保存在4℃冰箱中待用(考虑到GUS蛋白的活性,时间以一周内为宜)。
(推荐)GUS染色
一、原理Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。
Gu s基因来自于大肠杆菌，编码b－葡聚糖苷酶（一种水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X－Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。
二、目的了解转基因植物中基因表达的器官、组织和细胞的特异性，掌握Gus报告基因表达的组织化学定位的方法。
三、材料与试剂1、转基因植物的组织、器官、种胚或幼苗。
t2、同种非转化植物的组织、器官、种胚或幼苗。
3、50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。
4、染色液：100mM K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mM Na2EDTA, 0.001% (v/v) trito n X-100, 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸缓冲液(50mM, pH 7.0)。
5、70％乙醇。
四、操作步骤1、将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37℃恒温条件下保温过夜。
2、转入70％乙醇中脱色2－3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。
3、肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。
4、83％、95％、100％乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
5、常规石蜡切片法切片，番红染色。
6、显微镜下观察、拍照。
五、说明1、要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。
如阴性对照显示兰色，其原因可能是：A）材料和试剂被细菌感染；B）保温时间过长。
2、染色液中的甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。
3、叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测
转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测一、实验目的1、掌握基因GUS的表达的检测方法2、了解GUS基因的应用二、实验原理GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。
β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。
由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。
根据地gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作为反应底物。
将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。
因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
三、实验材料、试剂拟南芥AK12-pro、GUS工作液四、实验步骤1、取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液；2、用镊子夹取转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心管中；3、37℃浸泡过夜。
4、倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；肉眼下观察染色情况；拍照。
如果有GUS基因表达产物，则出现蓝色。
五、实验结果从上述照片中科一看出，将野生型和转基因型拟南芥用含有底物的缓冲液浸泡，转β-葡糖醛酸酶基因将X-Gluc水解生成蓝色产物，说明组织细胞被转入了GUS基因，并表达出GUS，这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性，图中拉瑟比较深，说明Gus活性相对较高。
最新gus染色液配制讲解学习
最新gus染色液配制讲解学习一染色液配制1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺(DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100μL，保存于-20℃。
2）X－Gluc基液（50mM PBS，pH7.0）。
配制方法：50mM NaH2PO4·0.78g/100ml；50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解；Na2EDTA （10mM，372mg），Triton-100（0.1％，100μl）,K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg）染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液需要试剂：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ；NaH2PO4；Na2HPO4 ；Na2EDTA ；Triton-100；K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）二染色方法：1.将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃保温1小时至过夜。
2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3次，至阴性对照材料呈白色。
3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
三实验原理适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。
其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
GUS活性的组织化学检测
GUS染色液的配制GUS染色液的配制主要参照Jefferson（1987）的方法。
(1)配制50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）：A液：称取NaH2PO4.2H2O 3.12g 溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。
B液：称取Na2HPO4.12H2O 7.7g 溶于溶于无菌蒸馏水，定容至100ml。
取39ml A液与61ml B液混合。
(2)配制X-Gluc(5-bromo-4chloro-3indolylglucuronide)母液：称5mg X-Gluc，溶于1mlDMF(二甲基甲酰胺)。
(3)染色液配制：磷酸钠缓冲液50 mmol/L（pH7.0），0.1%TritonX-100, 亚铁氰化钾5mmol/L，高铁氰化钾5mmol/L,X-Gluc 0.5mg/ml。
GUS活性的组织化学检测GUS活性的组织化学检测主要参照Jefferson（1987）的方法。
(1)愈伤组织瞬间表达及稳定转化的GUS检测愈伤组织瞬间表达的GUS检测：用带有重组质粒pOsMT2bL-GUS和35S-GUS的农杆菌EHA105感染水稻愈伤，共培养3d后，从每皿中各取10颗愈伤，用蒸馏水清洗除去愈伤表面附着的农杆菌。
滤纸吸干水分。
同时用未作任何处理的愈伤作阴性对照，将这些愈伤分别浸没在染色液中，37℃保温3-20h。
肉眼或显微镜下观察，愈伤上的蓝色小点即为GUS表达位点。
愈伤组织稳定转化的GUS检测：取经两轮抗性筛选后pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因抗性愈伤，同时用未作任何处理的愈伤作阴性对照，将这些愈伤分别浸没在染色液中，37℃保温3-20h。
肉眼或显微镜下观察，愈伤上的蓝色小点即为GUS表达位点。
(2)根、茎、叶中的GUS检测剪取pOsMT2bL-GUS和35S-GUS转基因水稻及未转基因水稻成熟植株的根、茎、叶、叶鞘、叶舌叶耳结合部（其中根、茎、叶鞘用解剖刀横切），浸没在染色液中，37℃保温3-20h，转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。
GUS活性检测实际操作步骤
2.6 GUS瞬时表达2.6.1GUS组织化学染色底物X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoly glucuronide)在GUS活性作用下水解产生无色的吲哚衍生物，此无色衍生物发生氧化二聚作用形成一种蓝色的不溶性的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，使表达GUS的细胞被染成蓝色。
通过肉眼或者显微镜可明显观察到染色情况，并由此检测GUS的表达情况。
将除菌后的材料转移至微量离心管中，加适量的X-Gluc工作液，置于37 ℃黑暗条件下12 h，观察蓝色斑点的形成情况。
于显微镜下观察染色情况并拍照。
2.6.2实验统计和分析均匀取少量待检测的材料于200 μL的离心管中，每次取10 管，以每管中的蓝色比率进行计算，根据观察可分为四个计数基数分别为0、1/3、2/3、1，求平均值。
2.7 荧光分光光度法测定GUS活性原理：以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide）简写为（4-MUG）为底物，Gus催化其水解为4-甲基伞形酮（4-MU）（4-methylumbelliferone）及β-D葡萄糖醛酸。
4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。
2.7.1药品试剂：（1）GUS提取缓冲液（100mL）：50mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）：96 mL10mmol/L β-巯基乙醇：100 uL0.5mol/L EDTA（pH 8.0）： 2 mL0.1%（V/V）Triton X-100：100 uL10% Sarcosyl (十二烷基肌氨酸钠) ：0.1g（溶于上述溶液中）ddH2O up to 100mL①50mmol/L 磷酸钠缓冲液(PBS)（pH 7.0）：(定容至500 mL)NaH2PO4·2H2O ：1.5215 gNa2HPO4·12H2O ：5.462 g②0.5mol/L EDTA（pH 8.0）：在800 mL水中加入186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶解至pH值至约8.0（约需20 g NaOH颗粒），然后定容到1 L。
最新整理GUS染色整理版知识讲解
1．GUS报告基因的定性检测GUS（β- 葡萄糖苷酸酶）能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。
GUS 染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。
gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。
其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
1.1 GUS染色底物的配制配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。
实验步骤：1.将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；可用抽真空，5min，200mbr。
2.37℃培养箱中温育12h，或有蓝色出现，水中洗涤一次；3.将浸染过的试材转入70%（或95%乙醇）中脱色2-3次（除去叶绿素），每隔1小时更换一次脱色液，至阴性对照材料呈白色为止。
（漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。
脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。
）4.立体显微镜观察拍照。
2．GUS报导基因的定量检测GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。
MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。
因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。
2.1 试剂配制1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。
实验五GUS染色检测基因瞬时表达
GUS染色检测基因瞬时表达
王欢欢 二零一二.九
报告基因
gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因）是目前转基因植物中应用最为广泛的报告基因。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可以 用多种方法检测出来。 绝大多数植物没有葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此gus作为报告基因广泛应用在植 物基因工程中。 标记基因为gus的常用商业载体：pBI121
组织化学法检测
以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（XGluc）作为反应底物，将被检材料用含有 底物的缓冲液浸泡。若组织细胞被转入了
gus基因，并表达出Gus，适宜的条件下，
该酶就可将水解生成蓝色产物。这 是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛 蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现 蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在 一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。 因此利用该方法可观察到外源基因在特定 器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。 gus基因转拟南芥的GUS检测结果
GUS染色
将拟南芥的幼苗或成年植株的组织浸泡于染色缓冲液中，置于真空 罐中0.5Mbar抽真空10 min，使染液充分渗入到组织的内部，然后置于 37 ℃浸泡过夜。移去染液，用0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗2-3次。 再用70%的乙醇脱色，更换乙醇2-3次，记录并拍照。 侵染后的烟草叶片和注射烟草叶片也用同样的方法处理
瞬时表达与稳定表达
瞬时表达
W38侵染叶片
稳定表达
拟南芥1
NB侵染叶片
拟南芥2
拟南芥3 NB侵染下胚轴 拟南芥4 NB注射叶片
拟南芥5
实验报告
实验目的 实验原理（简略写） 实验方法 实验结果及分析（最重要） 思考题（最后一次课给）
gus染色原理与方法
gus染色原理与方法
嘿，你问的是GUS染色原理与方法呀！那咱就来好好说道说道。
先说原理哈，GUS染色呢，其实就是利用了一种酶，叫β-葡萄糖苷酸酶。
这玩意儿能把底物分解，然后产生一些有颜色的物质，这样我们就能通过颜色变化来观察它在细胞或者组织里的情况啦。
就好比一个小侦探，通过特殊的手段让目标显现出来。
那方法呢，也不复杂。
首先得准备好材料，像要染色的样本啦，GUS染色液之类的。
然后把样本处理好，放到合适的环境里，让它和染色液充分接触。
这时候，那个神奇的酶就开始工作啦，如果样本里有它，就会发生反应，慢慢出现颜色变化。
比如说，你要是观察植物的某个组织，把它放在染色液里，过一会儿，可能就会看到有蓝色或者其他颜色出现，这就说明GUS酶在起作用啦。
我给你举个具体例子哈。
比如说你想研究一种植物的根，看看GUS酶在根里面是怎么分布的。
你就把根取出来，小心地处理一下，别弄坏了。
然后把它放到GUS染色液里，就像给它洗个特殊的澡一样。
接着你就耐心等着，可能过几个小
时，你再去看，哇，根的某些部位就变色了。
可能是在根尖啊，或者是根的某个特定区域。
这就告诉你，这些地方有GUS 酶的存在，说不定它在这些地方正忙着参与什么重要的生理过程呢，比如吸收营养啥的。
通过这种方法，我们就能更清楚地了解生物体内的一些情况啦，是不是还挺有意思的呀！反正就是这么个原理和方法，你多试试，多观察观察，就能掌握得更好啦！哈哈，希望你能顺利搞定GUS染色哦！。
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GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。
2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM ED TA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-1004．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。
6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRIT ION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML/plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%2 0for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf /stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalS taining.pdf/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.p dfGus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassium phosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g --->200mlKH2PO4: 27.2g---->200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4----> 300ml 1M potassium phosphate b uffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use. Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2mol/L Na3PO4缓冲液(62mL0.2mol/L Na2HPO4;38mL0.2 mol/L NaH2PO4)，pH7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4·H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5mlK4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1mlNaH2PO4 (0.2M) 100mM 1.9mlX-Gluc 0.1% 10ul Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
Western 可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。
电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。
为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。
硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。
在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。