最新GUS组织化学染色

GUS组织化学染色

1. 实验原理

适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

2．实验材料

1）转基因烟草叶片或试管苗

2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）

3．药品试剂

1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。

2) 底物溶液（染色液）：

3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM ED TA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-100

4．实验器材

小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器

5．实验步骤

1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；

2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；

3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。

6．结果

叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRIT ION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML

/plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%2 0for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf /stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalS taining.pdf

/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.p df

Gus staining

1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassium phosphate buffer (pH7.0) for 3 times.

2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h

3. Rinse in phosphate buffer

4. Fix for 4h or longer

5. Rinse in the same buffer

6. Observe as whole specimens or as sections.

1M potassium phosphate buffer (pH7.0)

K2HPO4: 34.8g --->200ml

KH2PO4: 27.2g---->200ml

184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4----> 300ml 1M potassium phosphate b uffer

(pH7.0)

Gus substrate solution

Volume(500ml)

Final concentration

Potassium ferricyanide

82mg

0.5mM

Potassium ferrocyanide

105.6mg

0.5mM

Potassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)

50ml

100mM

Store at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use. Fix solution

2.5% glutaraldehyde

200mM sodium cacodylate, pH7.2

共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）

0.2mol/L Na3PO4缓冲液(62mL0.2mol/L Na2HPO4;38mL0.2 mol/L NaH2PO4)，pH7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.

1000ml

x-gluc 1000mg （20ml dmso）

Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44

NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11

K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3

K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2

Triton 1ML

Na2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=37

1. 取5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.

2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4·H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH

7.0).

3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.

100ml x-gluc染液配制

x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso

1ml triton 100

Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml

K4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1ml

NaH2PO4 (0.2M) 100mM 1.9ml