各种分子遗传标记简介
各种分子遗传标记简介
紧密关联SNPs的区域，用来绘制人类基因单体型图。 SNP与疾病易感基因的相关性分析
随着大量代谢通路和上百万SNPs的确认，SNP作为新 一代遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜在价值。 SNP研究与药物设计
随着SNP的研究与药物基因组学的结合，根据特定的 基因型来设计药物将成为可能。
动物遗传标记课程作业
分子遗传标记的优越性
➢ 多为共显性； ➢ 在生物发育的不同阶段，不同组织的 DNA 都可用
于标记分析； ➢ 表现为中性，不影响目标性状的表达； ➢ 基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无
限的； ➢ 检测手段简单快捷，易于实现自动化。
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分子遗传标记的分类
Southern杂交为核心的分子标记，如RFLP
原理：基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形 : 成分子量大小不等的随机酶切片段，将特定的人工
合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一 个带接头的特异片段，用含有选择性碱基的引物对 摸板DNA进行扩增。扩增产物经放射性同位素标记、 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上扩增产 物的多态性来检遗传标记课程作业
RAPD的优点
① 引物可随机合成和随机选定，长度一般为9- 10 bp； ② 不同生物基因组可以共用一套引物； ③ 退火温度低，一般为36℃，允许适当的错配； ④ 每个RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板
DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性； ⑤ RAPD 分析所需的DNA 样品量极少。
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1 分子遗传标记概述 2 分子遗传标记优越性 3 分子遗传标记分类 4 主要分子标记技术 5 几种分子标记的比较
分子标记与遗传图谱
分子标记与遗传图谱AFLP的原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。
限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。
选择特定的片段进行PCR扩增，由于在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3’端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3’端严格配对的片段才能得到扩增。
再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
该技术包括三个步骤： DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头 adapter 连接；利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。
利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。
由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA 谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生；这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记；所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
简单序列长度多态性 Simple Sequence Length Polymorphisms,SSLP 限制性片断长度或PCR产物长度因为小卫星或微卫星随机重复数量的变化形成的差异。
SSLP具有多等位性，有两种SSLP常用于作图：小卫星序列：又称可变串联重复，其重复单位为数十个核苷酸。
微卫星序列：或简单重复序列，其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成。
微卫星序列的应用比小卫星序列的应用普遍的多，原因有二：小卫星序列大多集中在染色体的端部；而微卫星序列在整个基因组中分布广密度高；微卫星序列PCR分析：PCR扩增的DNA长度少于300bp时，反应既快速又精确。
分子标记种类及概述
分子标记概述遗传标记主要有四种类型：形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）.分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限,而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用.作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段,即分子标记技术。
与其它标记方法相比,分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题;数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的;多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁;许多标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分.广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
3-分子标记技术原理、方法及应用
细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染 色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等） 和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长 时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细 胞学方法进行检测
生化标记
主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从 组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法 将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影 响较小
缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相 当有限; (2)有些酶的染色方法和电泳技术有一 定难度
分子标记
主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种 差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA 间的差异，也叫DNA标记。
2/片段迁移率的变化要反映分子量的差异 ————DNA在聚丙烯酰胺凝胶上迁移率也受构象 变化影响
RFLP 基 本 步 骤
RFLP patterns in Pinus densata
RFLP
优点: 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响
共显性，非常稳定 起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制
分子标记技术原理、方法 及应用
黄健子 2011.10
一、遗传标记的类型及发展 二、几种常见分子标记的原理及方法 三、分子标记技术的应用
一、遗传标记的类型及发展
遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染
色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一 种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和 可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变 型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标 记、生化标记和分子标记四种类型。
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
分子遗传标记
二、DNA分子遗传标记鉴别的依据
3.DNA分子作为遗传信息的载体具有较高的遗传稳定 性，较蛋白质、同功酶等还有较高的化学稳定性。在 陈旧标本中所保存下来的DNA仍能够用于DNA分子遗传 标记的研究，由于DNA分子所载信息量巨大，并且相 对稳定，PCR技术具有高速、高效和特异性高等特点， 因此用DNA分子遗传标记鉴别中药材品种和对中药复 方制剂中组分的检测具有快速、准确、专属性强、重 现性好等优点。
三、DNA分子遗传标记在生药鉴定中的应用
1.生药真伪鉴定是生药学的重要组成部分 对同属不同种药材鉴定及药材真伪鉴定，保证中医用 药的准确性，维护人们身体健康具有重要意义。传统 的中药鉴定主要依靠颜色、形状、气味、味道和质地 等感性特征，这种鉴定方法的不足之处在于不准确。 利用DNA分子遗传标记技术直接分析药材的DNA多态性， 找出真品特有的DNA片段，对此进行测序，进而制备 DNA探针，来检测相应的药材。是一种便捷、准确的 生药鉴定方法。
三、DNA分子遗传标记在生药鉴定中的应用
4.在药用植物道地性研究上的应用 药材道地性的原因就是植物的遗传物质DNA及初生和 次生代谢过程中的酶系统发生了“道地性”变化。道 地性药材与非道地性药材毕竟同种，甚至同一亚种。 二者在形态和生药性状等特征上，差别往往不明显， 给道地药材的鉴别带来了困难。采用DNA分子诊断技 术并辅以等位酶技术，可以从分子水平上来揭示药材 的“道地性”。对药材的“道地性”研究有重要意义。
重复序列为基础的DNA分子标记技术
卫星DNA(Satellite重复序列为几百~几千个碱 基对)，微卫星DNA (Microsatellite，重复序 列单位为2~5个碱基对)，小卫星DNA (Minisatellite，重复单位为大于5 个碱基对) 等。
分子标记及其在林木遗传育种研究中的应用
1. 引言分子标记，作为一种现代遗传学和生物技术领域的重要技术手段，已经在众多生物学领域得到广泛应用。
其中，在林木遗传育种研究中，分子标记技术的应用也日益受到重视。
本文将从分子标记的基本概念出发，深入探讨其在林木遗传育种研究中的应用，并结合个人理解和观点进行分析和总结。
2. 分子标记的基本概念分子标记是指在分子水平上对遗传多态性进行检测和标记的技术手段，主要包括DNA标记和蛋白质标记两大类。
常用的DNA标记包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机增殖多态性（RAPD）、微卫星标记和单核苷酸多态性（SNP）等。
这些标记可以在不同个体之间表现为差异性，为遗传多样性的研究提供了便利。
3. 分子标记在林木遗传育种中的应用在林木遗传育种研究中，分子标记技术的应用可以帮助研究人员快速、准确地进行遗传多样性的评估和遗传图谱的构建。
通过分子标记技术，可以鉴定和筛选出对特定性状具有重要遗传作用的分子标记位点，从而加快林木品种改良的速度。
分子标记还可以帮助研究人员进行亲本间的亲缘关系分析和遗传图谱构建，为林木杂交育种提供了重要的分子遗传学支撑。
4. 个人观点和理解在我看来，分子标记技术的应用对于林木遗传育种研究具有十分重要的意义。
通过分子标记技术，研究人员不仅可以更加准确地了解林木品种的遗传背景和遗传特性，还可以加速林木品种改良的进程，为林木资源的可持续利用和保护提供强有力的支持。
当然，分子标记技术在林木遗传育种中的应用也面临着一些挑战和限制，例如技术成本较高、大规模应用时的数据处理和分析等问题，这些都需要我们进一步深入研究和探讨。
5. 总结通过本文的探讨，我们对分子标记及其在林木遗传育种研究中的应用有了更加深入和全面的了解。
分子标记技术的应用为林木遗传育种提供了一种快速、准确和精细的遗传学分析手段，为林木资源的可持续利用和保护提供了重要支撑。
希望未来可以有更多的研究人员投入到分子标记技术在林木遗传育种中的应用研究中，推动林木遗传育种领域的发展和进步。
分子标记技术
DNA分子标记 DNA分子标记
第一代分子标记 第二代分子标记 第三代分子标记
RFLP 标记技术
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性 的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是 检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分 布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核 苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或 产生, 导致酶切片段长度的变化。
特点: 特点:
具有共显性的特点； 具有共显性的特点； RFLP标记具有种族特异性 标记具有种族特异性， RFLP标记具有种族特异性， 对于分析一个分离群体的不同 来源的染色体片段具有重要价 值； RFLP标记遍及整个基因组； RFLP标记遍及整个基因组； 标记遍及整个基因组 不足：主要表现在所需DNA量 不足：主要表现在所需DNA量 DNA 步骤复杂，需要的仪器、 大，步骤复杂，需要的仪器、 设备较多，周期长，成本高， 设备较多，周期长，成本高， 检测中利用放射性的同位素， 检测中利用放射性的同位素， 易造成环境污染； 易造成环境污染；
分子标记技术
什么是遗传标记（Genetic Marker） Marker） 什么是遗传标记（
遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某 个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它 具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因 此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为 遗传标记。
遗传标记的类型
形态标记(morphological 形态标记(morphological marker) 细胞学标记(cytological 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular 分子标记(molecular marker)
分子标记种类及概述
分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。
分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。
作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。
与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
DNA遗传标记简介
每个STR的等位基因数是根据能产生 的重复次数来定的，比如D3S1358， 四个碱基顺序的重复次数有8，9，10 ，11，12，13，14，15共8种，其等 位基因数就是8，这8个等位基因可以 产生36种不同的基因型。假设可能的 基因数出现的概率是一样的话，比如 对D3S1358来说，有36个基因型，那 么某个特定的人有某种基因型（9， 15）的概率就是1/36。这样这13个 STR的不同基因型的产生某个特定的 基因型组合就是随机概率是8.8x10(22)。事实上，某个STR的不同基因型 在人群中出现的概率是不同的；同样 的基因型，在不同的人群中出现的概 率也会不同。所以，要先从人群中做 样本调查，建立资料库，建立各种 STR基因不同基因型在不同人群中的 稳定概率，然后算出某个特定基因型 组合随机出现的可能概率。
• STR具有分布广泛，信息量大，有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗 传等优点，目前已广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、 亲子鉴定、 疾病基因定位和物种多态性研究、 组织移植评价等诸多领域。与 RFLP技术及PCR-VNTR技术相比，STR分型更适合微量、陈旧和降解 样本的检验。
7
STR的特点
Alleles distinguishable by PCR product length
12
STR应用领域及商业价值
ABI AmnFLSTR Identifier PCR • AmpFLSTR Identifiler PCR扩增试剂盒采用最新荧光技术（五色荧光，一个泳道），实现
了16个STR位点同时扩增同时检测。在这些位点中D18S51, D19S433, TPOX和vWA用NED 染料标记； Amelogenin, D5S818和FGA用PET染料标记； D2S1338, D3S1358, D13S317, D16S539和TH01用VIC染料标记；CSF1PO, D7S820, D8S1179和D21S11用6FAM染料标记。 • AmpFLSTR Identifiler试剂盒的主要特点： 1. 五色荧光技术:五色荧光技术实现了一色荧光标记分子量内标，其余四色荧光
分子标记技术知识讲解
苷酸多态性） • 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几
个核苷酸的差异，从分子水平上单个核苷酸的差 异进行检测具有重要意义 • 检测SNPs方法a.随机扩增DNA（RAPD）法
的需要量大，在很大程度上限制了该 技术的应用
2.2 第二代分子标记技术
随机引物PCLeabharlann 标记• RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，DNA随机扩增多态性）
• RAPD具有技术简单、检测迅速、灵敏度 高、特异性强、检测容易、DNA样品用量 少的优点，但RAPD为显性遗传，侧你在 共迁移问题，并且重复性较差
1.1分子遗传标记
• 从广义上，是指可遗传并可检测的 DNA序列或蛋白质
• 从狭义上，是指DNA标记，这个界现 在别广泛采纳
• 具有分辨率好和信息量大等优势的分 子遗传标记目前已广泛应用于生物基 因组研究以及生物遗传育种、进化起 源、分类等诸多方面。
1.2DNA分子标记的定义及特征
• 定义：指能反映生物个体或种群间基 因组中某种差异特征的DNA片段，它 直接反映基因组DNA间的差异
• ISSR在引物设计上比SSR简单，无需知道 DNA序列就可用引物扩增，还比RFLP、 RAPD、SSR提供的遗传信息更多，但多 数情况下，不能区别一个位点扩增的DNA 片段
特异引物PCR标记
• SSR（Simple Sequence Repeats,简 单重复序列）
• SSR基本原理：根据微卫星序列两端 互补序列设计引物，通过PCR反应扩 增微卫星片段，由于核心序列串联重 复数目不同，因而能够用PCR的方法 扩增出不同长度的PCR产物，将扩增 产物进行凝胶电泳，根据分离片段的 大小决定基因型并计算等位基因频率
最新分子遗传标记及其应用
分子遗传标记及其应用分子遗传标记及其应用摘要：分子遗传标记育种是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用。
本文介绍了分子遗传标记的概念及应用。
关键字：分子遗传标记，标记辅组选择Abstract：Served as an newly rising genetic marker technique,molecule genetic markers is being widely used on molecule biology,especially in molecule genetic researches. This article gives a brief introduction of the conception and utilization of molecule genetic markers.Keywords:marker assisted selection；molecule genetic markers一．分子遗传标记技术1．1分子遗传标记的定义DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用，由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组的DNA序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定，最为可靠的。
随着现代分子生物学技术的发展，使直接利用DNA序列中核甘酸的变异作为遗传标记成为了可能。
目前，对分子遗传标记较完整的描述，是指易于识别，遵循孟德尔遗传模式的，具有个体特异性或其分布规律具有种质特征的某一类表型特征或遗传物质；其范围包括：①基因或遗传物质的产物的变异特征；②作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异；③基因或遗传物质本身的变异[1]。
1．2分子遗传标记的作用分子遗传标记能够在DNA水平上对编码和非编码序列的遗传变异进行检测，不受内外环境的影响；大多数分子标记多态性的信息含量很高；而且检测迅速、方便，无组织差异。
遗传标记技术及应用资料
对分子标记中共显性的理解
（二）基于PCR 技术的分子标记
PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异 性结合，按照引物类型可分为：
①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用 下扩增产物长度或序列的变异，如：随机扩增多态性 DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, RAPD）等技术；
开发成本和使用成本尽量低廉；
二、分子遗传标记
（一）基于分子杂交的分子标记（如： RFLP：限制性片段长度多态性 等）
（二）基于PCR 技术的分子标记（如： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, RAPD 等）
（三）基于基因芯片等的分子标记（如： SNP：单核苷酸多态性 等）
SSR标记的特点
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；数量几 乎无限。
（2） SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位 基因位点。
（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子。 （4）实验重复性好，结果可靠。 （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的
序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。
（三）基于基因芯片等的分子标记
三、DNA分子标记在植物生 物技术中的应用
DNA分子标记是现代植物生物技术中应用的重要工具， 其应用主要包括以下几个方面：
1、构建高密度的遗传连锁图 ：
在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只 能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分 子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供 了可能，促进DNA指纹的分析。
RAPD标记原理
A
B
C
primer
RAPD标记的特点
分子遗传标记及其应用
分子遗传标记及其应用摘要：分子遗传标记育种是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用。
本文介绍了分子遗传标记的概念及应用。
关键字：分子遗传标记，标记辅组选择Abstract：Served as an newly rising genetic marker technique,molecule genetic markers is being widely used on molecule biology,especially in molecule genetic researches. This article gives a brief introduction of the conception and utilization of molecule genetic markers.Keywords:marker assisted selection；molecule genetic markers一．分子遗传标记技术1．1分子遗传标记的定义DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分子遗传学上得到了广泛的应用，由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组的DNA序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定，最为可靠的。
随着现代分子生物学技术的发展，使直接利用DNA序列中核甘酸的变异作为遗传标记成为了可能。
目前，对分子遗传标记较完整的描述，是指易于识别，遵循孟德尔遗传模式的，具有个体特异性或其分布规律具有种质特征的某一类表型特征或遗传物质；其范围包括：①基因或遗传物质的产物的变异特征；②作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异；③基因或遗传物质本身的变异[1]。
1．2分子遗传标记的作用分子遗传标记能够在DNA水平上对编码和非编码序列的遗传变异进行检测，不受内外环境的影响；大多数分子标记多态性的信息含量很高；而且检测迅速、方便，无组织差异。
分子标记技术
应非定点地扩增DNA片段；
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。
RAPD技术流程：
RAPD分子标记的应用
RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东 栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花， 月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉 米，水稻等多种植物中广泛应用。
RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；
探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA 概念：RAPD技术建立于PCR技术的基础 之上，它是利用一系列不同的随机排列碱 基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研 究的基因组DNA进行PCR扩增，这些引 物在一定的退火条件下，
以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
单核苷酸多态性标记(SNP)
以特定序列为核心的分子标记技术
线粒体DNA分子标记(mtDNA)
三. 几种分子标记介绍
1.限制性片段长度多态性标记 Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP：限制性片段长度多态性，为第一代 多态性记。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分
第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA， 随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代 分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
常用分子标记技术原理及应用 共35页
形态标记（Morphological marker）
形态学上 如何区分
细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（ 染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置 等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位。 缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时 间来培育，难度很大。
分子标记的特点： (相对形态，细胞，生化标记具有的优点)
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育 阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题 ；
（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体 。
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文缩写 RFLP STS RAPD AFLP SSR SNP
英文名称
Restriction fragment Iength polymorphism
Sequence tagged site
Random amplified polymorphic DNA
Amplified frangment length Polymorphism
(2) 有些变异难以用细胞学方法进行 检测。
人类22对常染色体
细胞学标记
细胞分裂中期（Metaphase）
• 染色体组karyotype(Chromosome phenotype) analysis
生化标记（Biochemical Marker）
概念：主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的 蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。
分子标记
SNP (single nucleotide polymorphism) 标记，是同一位点的不同等位基因之间单核苷酸的差异。2005年国际水稻基因组测序计划通过比较两品种发现相应区段差异共有80,127个位点，其中SNP 频率差异因染色体不同而不同，每100bp 发生SNP 的几率从0.53%-0.78%。这为开发SNP 标记提供令人鼓舞的开端。
构建遗传图谱是研究数量性状基因定位的重要工具，而构建图谱必须有合适的标记。目前应用的遗传标记可分为形态标记、细胞学标记、同工酶标记和DNA 分子标记四类。形态标记和细胞学标记曾在上世纪七十、八十年代大量采用，但这些标记数目少，对环境的影响较为敏感，并且人为因素对形态标记的界定影响较大，从而限制了其在植物遗传研究中的应用。同工酶是一种共显性标记，相对表型标记而言数量较多，受环境影响较小。但不同的同工酶系统常常要求特定的检测程序，有些同工酶具有组织和发育阶段的特异性，而且在大多数的育种群体中一般只能找到10-20个具有多态性的同工酶位点，因而限制了该方法的应用。而基于DNA 水平上多态性的分子标记，能直接反映DNA序列水平的差异，覆盖整个基因组，数量几乎无限，而且其遗传相对稳定，不受环境和发育阶段的影响，因此自出现之日起就得到广泛应用和迅相补充，通过各种分子标记的结合应用可提高遗传图谱标记密度。
自PCR 技术问世后，便以其简单、快捷、高效等特点，迅速成为分子生物学研究的重要工具，一些基于PCR 的分子标记也应运而生。
SSR (simple sequence repeat) 标记，也称微卫星DNA (microsatellite DNA)标记，它是一类由1-6 个碱基组成的基序(motif) 串联重复而形成的DNA 序列，如(AT)n、(GTT)n、(AATT)n 等各种形式，广泛存在于基因组的不同位置，长度一般在200bp 以下( Morgant 和Olivieri, 1993)。其两端的侧翼序列多是相对保守的单拷贝序列，可以对它们设计一对特异引物，扩增每个位点的微卫星DNA。SSR 标记是其在数量上的变异和扩增产物在长度上的变化导致产生多态性，它覆盖整个基因组，数量丰富，揭示的多态性高，呈共显性。同时SSR 显带技术用银染代替了传统的放射性技术，从而使之更加快速、安全。2002年，Cornell 大学McCouch 等开发出2240 对新的水稻SSR 分子标记。2005年国际水稻基因组测序计划在Nature 上发表文章指出，水稻基因组总共含有18,828个SSR 位点，平均每Mb有51个SSR 位点。其中第三染色体的SSR 位点密度最高，第四染色体SSR位点密度最低。
应用分子标记研究群体遗传
应用分子标记研究群体遗传分子标记是一种常用的遗传学研究方法，通过分析DNA序列上的特定位点的变异情况，可以揭示群体间的遗传关系和群体遗传结构。
这项技术被广泛应用于种群遗传学、人类遗传学、植物遗传学等领域，为我们深入了解群体遗传特征和进化过程提供了重要工具。
应用分子标记研究群体遗传，首先需要选择适合的分子标记技术。
常见的分子标记技术包括单核苷酸多态性(SNP)、核酸序列重复片段(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、简单重复序列(microsatellites)等。
这些技术在选择位点上的变异性和多态性方面各有特点，可以根据研究需要来选择合适的标记技术。
选择好分子标记技术后，接下来需要对目标群体进行采样。
样本的选择应该具有代表性，并且需要确保样本之间相互独立。
不同种群之间的样本也需要足够多，并且涵盖不同地理区域和群体类型，以便对种群遗传结构进行综合分析。
采样完成后，可以开始进行分子标记的实验操作。
这包括提取样本的DNA、进行PCR扩增、分离PCR产物、检测分子标记的变异情况等。
这些操作需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
得到分子标记数据后，可以使用各种统计方法进行数据分析。
其中，常用的方法包括：遗传距离计算、群体遗传结构分析、群体间遗传差异分析、种群遗传变异性分析等。
通过这些统计分析，可以揭示不同群体之间的遗传关系和与环境因素的关联，进而解析群体的起源、演化历史和遗传多样性等问题。
应用分子标记研究群体遗传有广泛的应用领域。
在种群遗传学领域，可以研究种群的遗传结构、基因流动性、自然选择等问题，为保护和管理野生物种提供科学依据。
在人类遗传学领域，可以揭示人类种群的起源、迁徙历史和遗传多样性差异，为人类进化和人种关系研究提供重要参考。
在植物遗传学领域，可以研究植物群体的基因流动性、克隆传播方式、遗传多样性的维持等问题，为保护和改良植物品种提供理论指导。
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微卫星DNA的优点
① 数量多且均匀分布在基因组中； ② 具有丰富的多态性； ③ 等显性遗传，因此检测可以显示纯合子和杂合子； ④ 检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。
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RFLP的优点
① 较高的可靠性； ② 标记数目是无限的； ③ 标记为共显性； ④ 标记之间无干扰； ⑤ 不受年龄性别以及外界环境的影响。
RFLP的缺点
① 样品纯度要求较高，样品用量大； ② 多态信息含量低； ③ 步骤繁琐、工作量大、成本较高。
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AFLP的优点
① 多态性丰富且清晰可辨，一次AFLP分析可检测到100~150个标记； 被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术；
② 可靠性好，重复性高；
③ DNA需要量少；
④ 引物在不同物种间是通用的； ⑤ AFLP分析的扩增片段较短（30-700bp)，分辨率高。
RFLP的应用
分子水平上选择目的性状 进行品种或品系遗传纯度的测定
改良回交育种技术
生物进化和分类 疾病诊断方面的应用 特别适应于构建遗传连锁图
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2、AFLP (Amplified Restriction Fragment Polymorphism)
扩增片段长度多态性 原理：基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形 成分子量大小不等的随机酶切片段，将特定的人工 合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一 个带接头的特异片段，用含有选择性碱基的引物对 摸板DNA进行扩增。扩增产物经放射性同位素标记、 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上扩增产 物的多态性来检出多态性。
Repeats，SSR)，广泛存在于真核生物基因组中，以1~6个 碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。
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原理：每个微卫星两侧一般是相对保守的单拷贝序列， 据此可设计专一引物，通过PCR技术扩增微卫星片段， 扩增产物经凝胶电泳分离后，不同个体间因核心序列 的重复次数不同而产生DNA多态性。
AFLP的缺点
① 对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感；
② 显性标记，只能表明目的条带的有无，不能区分纯合子和杂合子； ③ 操作复杂，耗时，成本高。
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AFLP的应用
遗传图谱的构建； 基因标记及定位； 种及种下阶元的分类鉴定； 遗传距离及杂种优势的利用；
遗传多样性和系统进化的研究。
杂交优势预测
群体遗传结构分析及遗传关系的分析 在标记辅助选择和标记辅助导入等方面的研究 监测育种和遗传操作效应 亲子鉴定、胚胎移植、混合受精、亲缘关系分析
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6、SNP（Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸多态性标记 概念：SNP指染色体上某个位点单个核苷酸的变 异，包括转换、颠换、缺失或插入等。 特性： ① 高密度；
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分子遗传标记的优越性
多为共显性；
在生物发育的不同阶段，不同组织的 DNA 都可 用于标记分析；
表现为中性，不影响目标性状的表达； 基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无 限的；
检测手段简单快捷，易于实现自动化。
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分子遗传标记的分类
Southern杂交为核心的分子标记，如RFLP
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SSCP的优点
① 操作简便，实验步骤少，周期短； ② 具有高的灵敏性，仅单个碱基差异亦可检测出来，拓展了检 测范围； ③ 能得到更多的图谱信息，更详细的分型结果置和类型，还需进 一步测序； ② 受外界影响较大，电泳条件要求较严格； ③ 易造成漏检。
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RAPD的优点
① ② ③ ④ 引物可随机合成和随机选定，长度一般为9- 10 bp； 不同生物基因组可以共用一套引物； 退火温度低，一般为36℃，允许适当的错配； 每个RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板 DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性； ⑤ RAPD 分析所需的DNA 样品量极少。
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7、mtDNA标记
mtDNA（Mitochondrial DNA）：线粒体DNA 母系遗传、缺乏重组及进化速率快等 动物单亲（母亲）亲缘鉴定、种质资源的起源、分子进化 和分类的研究
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几种DNA分子标记的比较
项目 RFLP RAPD 微卫星 小卫星 AFLP
微卫星DNA的缺点
① 相对的物种专一性； ② 开发困难，费用较高，耗时长； ③ 实际分析时一般每次只分析单个位点； ④ 不同引物退火温度不同，需要探索。
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微卫星DNA的应用
个体及亲缘关系鉴定
种群(品种、品系)内遗传纯度和彼此之间遗传距离
构建遗传连锁图谱 定位功能基因及QTL
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几种分子遗传标记技术简介
报告人：木木木 时 间：2014.1.16
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1
分子遗传标记概述
2 分子遗传标记优越性 3 4
分子遗传标记分类 主要分子标记技术
5 几种分子标记的比较
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分子遗传标记概述
20世纪70年代以来，随着分子生物学的发 展，相继建立了RFLP、RAPD、AFLP、SNP、 SSCP等分子遗传标记检测技术。 分子遗传标记（Molecular Genetic Markers） 是以个体遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记，是 DNA 水平遗传多态性的直接的 反映。
RAPD的缺点
① 重复性差，易受到各种因素的影响； ② 标记呈显隐性遗传。
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5、TRS（Tandem Repeated Sequence) 串联重复序列标记
小卫星（Minisatellite DNA)
微卫星（Microsatellite DNA）
微卫星DNA又称简单序列重复(Sample Sequence
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3、SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性 单链构象多态性检测是一种基于单链DNA构 象差别来检测点突变的方法。 原理：单链DNA分子内的相互作用力使其呈现 复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时， 其空间构象发生变化，这些空间构象存在差异的单 链DNA分子在凝胶中受排阻大小不同。因此，通 过电泳可以将构象上有差异的分子分离开，形成了 单链构象多态性。
遗传特性 多态水平
检测基础 技术难度 费用
共显性 低
分子杂交 难 中等
显隐性 中等
随机PCR 易 低
共显性 高
专一PCR 易 高
共显性 高
分子杂交 难 中等
显隐性 高
专一PCR 易 高
谢谢！
PCR技术为基础的分子标记，如RAPD
分子 标记
核酸序列为基础的分子标记，如SNP
其它分子标记技术，如mtDNA
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主要的分子遗传标记
1、RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism） 限制性片段长度多态性
原理：用限制性内切酶切割基因组DNA后，基因组 DNA在检测区域内发生了重排、插入、缺失或点突变， 导致酶切位点发生改变，从而形成了大小不等、数量 不同的酶切片段，当这些片段通过凝胶电泳时就形成 不同的带，用分子探针杂交并利用放射自显影成像时， 不同程度的RFLP谱带表示其多态性。
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SSCP的应用
基因点突变的监测 大量样本的筛选 cDNA的筛查 检测人类遗传性疾病
病毒的分型和分类
保种和育种
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4、RAPD（Random amplified polymorphism DNA） 随机扩增多态性DNA 原理：以基因组DNA为模板， 以单个人工合成的 随机多态核苷酸序列（通常为10 个碱基对）为引 物，在Taq 酶作用下，进行PCR 扩增。扩增产物 经凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视 仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因 组的多态性。
② 代表性； ③ 易实现自动化分析，标记为双等位标记。
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SNP的应用
人类基因单体型图的绘制 描述人类常见的遗传多态性模式和染色体上具有成组 紧密关联SNPs的区域，用来绘制人类基因单体型图。 SNP与疾病易感基因的相关性分析 随着大量代谢通路和上百万SNPs的确认，SNP作为新 一代遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜在价值。 SNP研究与药物设计 随着SNP的研究与药物基因组学的结合，根据特定的 基因型来设计药物将成为可能。