基因工程实验教学教案

基因工程实验

教学方案

湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室

指导教师：吴娟

实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株

Ⅰ质粒DNA的提取

实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。

实验原理

1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。

2．设计构建体外重组DNA分子

构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。

附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：

仪器材料与试剂

（一）仪器

1．恒温摇床

2．台式离心机

3．漩涡混合仪

（二）材料与试剂

1．含pGEX-mreB质粒的大肠杆菌DH5α

2．含pGEX质粒的大肠杆菌DH5α

3．液体LB培养基

4．100mg/mL氨苄青霉素Amp

5．新捷质粒提取试剂盒

实验步骤

分为两组：一组提取质粒pGEX-mreB，另一组提取质粒pGEX。

1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul 已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。

2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。

3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。

4）13000 rmp 离心10分钟。

5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。

6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。

7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。

8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。

9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。

实验结果

实验安排

3个小时

Ⅱ质粒DNA的转化

实验目的

通过本实验，掌握大肠杆菌转化的方法与技术。

实验原理

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。转化是指质粒DNA或以其为载体构

低渗溶液中，菌细建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃、CaCl

2

胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Amp r等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。

E.coli DH5α是一种用于质粒克隆的菌株。

E.coli BL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失。仪器材料与试剂

（一）仪器

1.超净工作台

2.恒温摇床

3.制冰机

4.高压灭菌锅

(二) 材料与试剂

1.大肠杆菌Bl21感受态细胞

2.质粒DNA： pGEX-mreB、pGEX。

3．固体LB培养基平板（含Amp 120ug/ml）

实验步骤

分为两组：一组加入质粒pGEX-mreB，另一组加入质粒pGEX。

1.取100ul 新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA 2ul混匀，冰上放置30min。同时做一个对照管，仅加入100ul感受态细胞，不加质粒。

2.将管放到42℃热激90s。

3.冰浴2min。

4.每管加400ul LB 液体培养基，37℃培养1h(150r/min)

5．将适当体积（200ul）的复苏细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB培养皿中，正置平皿30min。

6.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。

实验结果

实验安排

这整个大实验从质粒提取到转化需一天，第二天早晨观察结果。

实验二外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测

Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

实验目的

通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

实验原理

将外源基因mreB克隆在含有Tac启动子的表达载体pGEX中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac

操纵子的诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE进行检测，或做蛋白质印迹，用抗体识别表达蛋白。

Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。

仪器材料和试剂

（一）仪器