物理图绘制基因组学概论
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遗传图整合，对YAC物理图进行校正。标记的平均密度 75kb。 多种物理作图法交叉运用，物理图与遗传图彼此衔接， 产生一份具综合性的完全整合的基因组图，成为人类基 因组计划测序阶段的工作框架。
基因组学概论
20
整合的基因组图必将有利于后续的基因组测序
克隆重叠群 指导的测序
基因组物 理图
全基因组直接鸟 枪法测序
3. 物理图绘制
基因组学概论
为什么要绘制物理图？
遗传图的缺陷：
遗传图的分辨率有限
高等真核生物不可能获得大量的子代
遗传图的覆盖面较低
有些染色体区段很少发生重组事件，难以绘制高密度连锁 图
遗传图分子标记的排列有时会出现差错
主要依据子代个体的基因型重组及其分离。环境因素和取 样误差对结果有影响
优点：利用PCR/杂交分析所在STS位置，自动机械化 操作。STS的分析资料可用来估算2个分子标记之间的 相对距离，其原理与连锁分析大同小异。
基因组学概论
16
基因组学概论
17
合格的STS满足2个条件：
序列已知的片段 在染色体中独一无二
寻找STS的方法
表达序列标签EST：cDNA 简单序列长度多态性SSLP：具有多态性并已在连锁分析中
中期染色体：主要用于确定新发现的分子标记属于哪条染色 体，给出十分粗略的染色体定位
机械伸展的染色体：分离与制备中期细胞核，离心，获得伸 展的染色体，长度增加20倍。
间期染色体：已获得基本的位置信息，极度松驰的染色体可 用于小区段分子标记排序研究。
基因组学概论
14
3.4 序列标签位点(STS)作图
最早组建重叠群方法—染色体步移：从基因组文库 中挑取一个指定的或随机的克隆，然后在文库中寻 找与之重叠的第二个克隆。在此基础上再寻找第三 个克隆，依次延伸
染色体步移的速度缓慢，仅适合于小基因组及小区段 染色体的物理图绘制
基因组学概论
11
染色体步移
基因组学概论
12
指纹作图
在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的办法首推克 隆指纹 (clone fingerprinting) 排序。
自主复制起始点：在细胞中启动染色体的复制
缺陷：插入子稳定性问题、同一酵母细胞多个YAC引 起交换产生嵌合
基因组学概论
8
大分子DNA的克隆载体
酵母人工染色体YAC：克隆的DNA片段平均600kb
噬菌体P1载体：与噬菌体载体相似，将天然噬菌体 基因组中的一段区域缺失，容量达125kb
细菌人工染色体 BAC (bacterial artificial chromosome) ：由大肠杆菌中F质粒衍生，容量达 300kb，单拷贝复制，稳定，不会因重组发生嵌合
定位 随机基因组序列：在数据库中寻找所感兴趣的某些序列
基因组学概论
18
STS定位：即将已知的STS定位在染色体或基 因组中的DNA区段
辐射杂种：含有另一种生物染色体片段的啮齿类细 胞
每次从杂种细胞 分离DNA，用 PCR检测杂种细 胞中含有的STS 标记，根据成对 STS出现的频率， 可判断这些标记 是否连锁以及连 锁程度。
个黏粒克隆
基因组学概论
7
大分子DNA的克隆载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)：重组YAC分子只能在酵母细胞中扩增，针对 真核染色体的结构设计的。
着丝粒：在细胞分裂时负责染色体均等分配
端粒：位于染色体端部的特异序列，保持人工染色体 的稳定性
基因组学概论
19
3.5 人类基因组整合图
1987年发表了第一份人类RFLP连锁图,含有393 RFLP 和10个其他多态性标记，来自21个家庭，平均密度为 10Mb
1994年遗传图 4000个SSLP，密度为700kb 1993年 33,000个YAC 1996-1998年间，采取辐射杂种进行STS标记作图，与
序列标记位点（sequence tagged site mapping, STS) （重点）
人类基因组物理图
基因组学概论
5
3.1 限制酶作图
基本思想：比较不同限制酶产生的DNA片段的 大小。
限制性作图只能应用于较小的DNA分子。 通常采用的6碱基对识别序列的限制酶仅适合
50 kb 以下的DNA分子的精确作图。
基因组学概论
6
3.2 基于克隆的基因组作图
3.2.1 载体 质粒 (plasmid)、噬菌体、黏粒 (cosmid)…… 啤酒酵母基因组主要是先构建黏粒文库，然后
建立克隆重叠群完成测序 高等生物基因组
拟南芥1.2X105bp，需要25000个黏粒克隆 人类基因组是拟南芥基因组的33倍，需要的上百万
重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克
隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠
STS作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克
隆进行PCR扩增
基因组学概论
13
3.3 荧光标记原位杂交
FISH：杂交技术的一种延伸，杂交靶子是完整的染色 体，由杂交信号提供作图信息。荧光标记信号在显微 镜下观测，直接显示探针与染色体杂交的位置
限制性作图：快速，信息详细，但不适合大基因组。 重叠群构建程序复杂，费时费力。 指纹作图：对大基因组存在不少问题，如选用的限
制酶不当或重复顺序干扰，会出现误排。 原位杂交：操作困难，资料积累慢，一次实验定位
的分子标记不超过3-4 个。
STS绘图是用于构建详细的大基因组物理图的 主流技术
基因组学概论
基因组学概论
2
物理图谱
遗传图谱
酿酒酵母第3号染色体遗传 图谱与物理图谱的比较
这个物理图谱是通过DNA测 序确定的。
在遗传图谱中最上面这两个 遗传标记（glk1, cha1）的顺 序是错误的。
两个图谱间的其他几对标记 的相对位置也有差异。
基因组学概论
3
为什么要绘制物理图？
遗传图的缺陷：
遗传图的分辨率有限 遗传图的覆盖面较低 遗传图分子标记的排列有时会出现差错
所以对于大多数真核生物来说，在进行大规模 DNA测序前，需要用其他作图方法来检验和补 充遗传图谱。
基因组学概论
4
第三章 物理作图
限制酶作图(restriction mapping)
基于克隆的基因组作图（重点）
荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）
5. STS的分析资料可用来估算2个分子标记之间的相对距离， 其原理与连锁分析大同小异。第三道题改为：两个基因 在染色体中相距越远，他们因交换而分离的频率是越大 还是越小？
基因组学概论
22
遗传图谱和 物理图谱 的对应关系
下节课内容：4 基因组源自文库序和序列组装
基因组学概论
23
P1人工染色体PAC：结合P1载体和BAC载体的优 点
基因组学概论
9
基因组学概论
10
3.2 基于克隆的基因组作图
3.2.1 载体
质粒、噬菌体、粘粒
大分子DNA的克隆载体 (YAC, P1, BAC, PAC …)
3.2.2 重叠群组建
重叠群contig：相互间存在重叠顺序的一组克隆。
指纹fingerprinting：DNA样品所具有的特定DNA片段组成，限
定的序列特征。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段
限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA
条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列
重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用
一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂 交带型，说明重叠
15
STS：sequence tagged site，一小段长度100-500bp的 DNA序列，每个基因组仅一份拷贝，易分辨。
STS作图技术的主要原理是：
STS在基因组中独一无二，在染色体上位置确定
位于染色体上紧邻排列的STS是机械连接的，在外力作 用下断裂DNA时，2个不同的STS出现在同一个片段的 机会取决于他们在基因组中的相对位置。位置越近的 STS有最大的机会同时出现在同一个DNA片段中。
DNA片段内部用鸟 枪法测序
序列组装
序列的物 理位置已 知
基因组学概论
序列组装
用分子标记来确 定组装序列在基 因组的哪个的位 置
21
作业
1. 列举大分子DNA的克隆载体。
2. 用于构建详细的大基因组物理图的主流技术是哪种？
3. 合格的STS满足什么条件？
4. 位于染色体上紧邻排列的STS是机械连接的，在外力作 用下断裂DNA时，2个不同的STS出现在同一个片段的 机会取决于他们在基因组中的相对位置。两个STS在染 色体中相距越远，他们出现在不同DNA片段中的概率越 大还是越小？
基因组学概论
20
整合的基因组图必将有利于后续的基因组测序
克隆重叠群 指导的测序
基因组物 理图
全基因组直接鸟 枪法测序
3. 物理图绘制
基因组学概论
为什么要绘制物理图？
遗传图的缺陷：
遗传图的分辨率有限
高等真核生物不可能获得大量的子代
遗传图的覆盖面较低
有些染色体区段很少发生重组事件，难以绘制高密度连锁 图
遗传图分子标记的排列有时会出现差错
主要依据子代个体的基因型重组及其分离。环境因素和取 样误差对结果有影响
优点：利用PCR/杂交分析所在STS位置，自动机械化 操作。STS的分析资料可用来估算2个分子标记之间的 相对距离，其原理与连锁分析大同小异。
基因组学概论
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基因组学概论
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合格的STS满足2个条件：
序列已知的片段 在染色体中独一无二
寻找STS的方法
表达序列标签EST：cDNA 简单序列长度多态性SSLP：具有多态性并已在连锁分析中
中期染色体：主要用于确定新发现的分子标记属于哪条染色 体，给出十分粗略的染色体定位
机械伸展的染色体：分离与制备中期细胞核，离心，获得伸 展的染色体，长度增加20倍。
间期染色体：已获得基本的位置信息，极度松驰的染色体可 用于小区段分子标记排序研究。
基因组学概论
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3.4 序列标签位点(STS)作图
最早组建重叠群方法—染色体步移：从基因组文库 中挑取一个指定的或随机的克隆，然后在文库中寻 找与之重叠的第二个克隆。在此基础上再寻找第三 个克隆，依次延伸
染色体步移的速度缓慢，仅适合于小基因组及小区段 染色体的物理图绘制
基因组学概论
11
染色体步移
基因组学概论
12
指纹作图
在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的办法首推克 隆指纹 (clone fingerprinting) 排序。
自主复制起始点：在细胞中启动染色体的复制
缺陷：插入子稳定性问题、同一酵母细胞多个YAC引 起交换产生嵌合
基因组学概论
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大分子DNA的克隆载体
酵母人工染色体YAC：克隆的DNA片段平均600kb
噬菌体P1载体：与噬菌体载体相似，将天然噬菌体 基因组中的一段区域缺失，容量达125kb
细菌人工染色体 BAC (bacterial artificial chromosome) ：由大肠杆菌中F质粒衍生，容量达 300kb，单拷贝复制，稳定，不会因重组发生嵌合
定位 随机基因组序列：在数据库中寻找所感兴趣的某些序列
基因组学概论
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STS定位：即将已知的STS定位在染色体或基 因组中的DNA区段
辐射杂种：含有另一种生物染色体片段的啮齿类细 胞
每次从杂种细胞 分离DNA，用 PCR检测杂种细 胞中含有的STS 标记，根据成对 STS出现的频率， 可判断这些标记 是否连锁以及连 锁程度。
个黏粒克隆
基因组学概论
7
大分子DNA的克隆载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)：重组YAC分子只能在酵母细胞中扩增，针对 真核染色体的结构设计的。
着丝粒：在细胞分裂时负责染色体均等分配
端粒：位于染色体端部的特异序列，保持人工染色体 的稳定性
基因组学概论
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3.5 人类基因组整合图
1987年发表了第一份人类RFLP连锁图,含有393 RFLP 和10个其他多态性标记，来自21个家庭，平均密度为 10Mb
1994年遗传图 4000个SSLP，密度为700kb 1993年 33,000个YAC 1996-1998年间，采取辐射杂种进行STS标记作图，与
序列标记位点（sequence tagged site mapping, STS) （重点）
人类基因组物理图
基因组学概论
5
3.1 限制酶作图
基本思想：比较不同限制酶产生的DNA片段的 大小。
限制性作图只能应用于较小的DNA分子。 通常采用的6碱基对识别序列的限制酶仅适合
50 kb 以下的DNA分子的精确作图。
基因组学概论
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3.2 基于克隆的基因组作图
3.2.1 载体 质粒 (plasmid)、噬菌体、黏粒 (cosmid)…… 啤酒酵母基因组主要是先构建黏粒文库，然后
建立克隆重叠群完成测序 高等生物基因组
拟南芥1.2X105bp，需要25000个黏粒克隆 人类基因组是拟南芥基因组的33倍，需要的上百万
重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克
隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠
STS作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克
隆进行PCR扩增
基因组学概论
13
3.3 荧光标记原位杂交
FISH：杂交技术的一种延伸，杂交靶子是完整的染色 体，由杂交信号提供作图信息。荧光标记信号在显微 镜下观测，直接显示探针与染色体杂交的位置
限制性作图：快速，信息详细，但不适合大基因组。 重叠群构建程序复杂，费时费力。 指纹作图：对大基因组存在不少问题，如选用的限
制酶不当或重复顺序干扰，会出现误排。 原位杂交：操作困难，资料积累慢，一次实验定位
的分子标记不超过3-4 个。
STS绘图是用于构建详细的大基因组物理图的 主流技术
基因组学概论
基因组学概论
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物理图谱
遗传图谱
酿酒酵母第3号染色体遗传 图谱与物理图谱的比较
这个物理图谱是通过DNA测 序确定的。
在遗传图谱中最上面这两个 遗传标记（glk1, cha1）的顺 序是错误的。
两个图谱间的其他几对标记 的相对位置也有差异。
基因组学概论
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为什么要绘制物理图？
遗传图的缺陷：
遗传图的分辨率有限 遗传图的覆盖面较低 遗传图分子标记的排列有时会出现差错
所以对于大多数真核生物来说，在进行大规模 DNA测序前，需要用其他作图方法来检验和补 充遗传图谱。
基因组学概论
4
第三章 物理作图
限制酶作图(restriction mapping)
基于克隆的基因组作图（重点）
荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）
5. STS的分析资料可用来估算2个分子标记之间的相对距离， 其原理与连锁分析大同小异。第三道题改为：两个基因 在染色体中相距越远，他们因交换而分离的频率是越大 还是越小？
基因组学概论
22
遗传图谱和 物理图谱 的对应关系
下节课内容：4 基因组源自文库序和序列组装
基因组学概论
23
P1人工染色体PAC：结合P1载体和BAC载体的优 点
基因组学概论
9
基因组学概论
10
3.2 基于克隆的基因组作图
3.2.1 载体
质粒、噬菌体、粘粒
大分子DNA的克隆载体 (YAC, P1, BAC, PAC …)
3.2.2 重叠群组建
重叠群contig：相互间存在重叠顺序的一组克隆。
指纹fingerprinting：DNA样品所具有的特定DNA片段组成，限
定的序列特征。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段
限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA
条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列
重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用
一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂 交带型，说明重叠
15
STS：sequence tagged site，一小段长度100-500bp的 DNA序列，每个基因组仅一份拷贝，易分辨。
STS作图技术的主要原理是：
STS在基因组中独一无二，在染色体上位置确定
位于染色体上紧邻排列的STS是机械连接的，在外力作 用下断裂DNA时，2个不同的STS出现在同一个片段的 机会取决于他们在基因组中的相对位置。位置越近的 STS有最大的机会同时出现在同一个DNA片段中。
DNA片段内部用鸟 枪法测序
序列组装
序列的物 理位置已 知
基因组学概论
序列组装
用分子标记来确 定组装序列在基 因组的哪个的位 置
21
作业
1. 列举大分子DNA的克隆载体。
2. 用于构建详细的大基因组物理图的主流技术是哪种？
3. 合格的STS满足什么条件？
4. 位于染色体上紧邻排列的STS是机械连接的，在外力作 用下断裂DNA时，2个不同的STS出现在同一个片段的 机会取决于他们在基因组中的相对位置。两个STS在染 色体中相距越远，他们出现在不同DNA片段中的概率越 大还是越小？