第11章 基因表达和功能的

11.3 鉴定和研究基因的翻译产物

HRT和HART能够识别克隆基因的翻译产 物（自习）
11.3 鉴定和研究基因的翻译产物
11.3.2 通过体外突变研究蛋白质 不同类型的体外突变 技术（主要是蛋白 质编码序列部分的缺失、插入等的操作 技术）

蛋白质发生了缺失
蛋白质发生了较大插入
11.3.2 通过体外突变研究蛋白质

酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)
局限性：
表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状 态不符，造成结果的不准确 本身就具有转录激活活性 的兴趣蛋白不适合于 该系统 不能定位于核内 的兴趣蛋白不适合于该系统 需要翻译后修饰的蛋白 不适合该系统

其他定点突变
C、定点诱变的PCR方法
根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物A和A’(引物A和A’ 互补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变； 分别以左侧引物A和右侧引物A’进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性和 退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合酶的 及外侧引物B和C的作用下，形成其突变位点是位于靶DNA 序列中但远离两端的突变体。
1、利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录 合成标准第一链cDNA。
2、利用逆转录酶具有末端转移酶的活性，使末端加 上寡聚C。

3、人工合成的接头引物的3’末端具有寡聚G，与寡聚C配对合 成第二链cDNA。 4、利用基因特异的引物作为下游引物和用一个含有部分接头 序列的通用引物(universal primer,UPM)作为上游引物扩增基因 的5‘末端。
11.2 基因表达调控的研究
研究调控区域的存在以及所发挥的作用 研究调控区域DNA分子的蛋白结合区域

11.2 基因表达调控的研究
12.2.1 识别DNA分子的蛋白结合区(DNA-蛋 白的相互作用的方法) 凝胶阻滞实验 DNA酶I足迹法 修饰干扰实验

Electrophoretic mobility shift assay, EMAS
第十一章 基因表达和功能的研究
主要内容
克隆基因转录的研究 对基因是否有内含子以及转录的起始点和终止 点进行的研究
基因表达调控的研究 鉴定和研究克隆基因的翻译产物
11.1. 克隆基因转录的研究
对于转录的起始点、终止点和基因是否 具有内含子等的研究 11.1.1电子显微镜分析核酸分子
TTAA
Melt and anneal oligos T4 polynucleotide kinase
优点： 快速高效 无异源双链的形成 无需DNA聚合酶 缺点: 需要在目标序列的两侧 具有限制性内切酶的位点
Gel purify vector DNA
·· ·A ·· ·TTTCGA
AATTC·· · G·· ·
Bait gene
Prey (Y) Bait (X)
AD Gal4激活域
BD Gal4结合域
operator
LacZ
Repoter gene
Trp-
NH2
Gal4
BD
X
COOH 共转化
Gal4
+
Gal4 Gal4
? BD X
AD
NH2
Aຫໍສະໝຸດ Baidu cDNA Leu-
COOH Promoter Reporter
AGCT
GTAC
Xho I
Sph I
利用混杂寡聚核苷酸方法的突变
11.3.2 通过体外突变研究蛋白质
其他定点突变
B、人工基因合成方法 1、原理 利用一段人工合成的150甚至更长的碱基 （内含需要突变的位点）,通过部分重叠 和DNA聚合酶的延伸完成整合基因的多个 位点的突变。
11.3.2 通过体外突变研究蛋白质
cDNA library
酵母双杂交系统的小结
用途：

快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，
发现新基因 验证 已知蛋白间的相互作用及作用强度
酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)
优点：
根据兴趣蛋白的基因序列 即可筛选与其作用 的目的蛋白 蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质 之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种 蛋白质的瞬时结合也可被检测出来 可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以 初步判断目的蛋白的结构和功能。
11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作用的 研究
D、肽库与被测试的靶蛋白分子经过一定时间孵 育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争 受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体 E、洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增， 进行下一轮洗脱 F、经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶 分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的 噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特 性的目标噬菌体。
用寡核苷酸在克隆基因上导入点突变 借助于M13单链和双链的特殊形式，将 目标突变导入，筛选出一半突变了基因。 并通过表达载体上突变了基因的表达， 研究点突变对蛋白质功能的影响。具体 的过程如P207，图11.25
11.3.2 通过体外突变研究蛋白质
其他定点突变 A、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序 列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征

11.1.2 通过核酸酶处理来研究 DNA-RNA杂交物
确定基因是否含有内含子 确定基因转录起点的位置

消化单链部分
碱性条件下降解RNA
缺点：不能确定不同的片段在基因上的确切位置
确定转录起始的位置






首先将可能的包含转录起 始点以及上游的DNA克 隆进入载体，获得单链的 DNA片段 加入转录物，进行温育， 退火，杂交 用S1核酸酶降解单链部 分，获得RNA-DNA杂合 双链 通过碱变性，降解RNA 检测被RNA保护的DNA 片段的长度 判断所克隆的DNA片段 中转录起始点的位置
11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作用的 研究
2 酵母双杂交系统 原理
A、转录激活因子GAL4

N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD) C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。 GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列 (upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活 域则能激活UAS下游的基因进行转录。

(a)
Primer A Primer A’ 5’ PCR Primer A’ 5’ Primer C PCR PCR
(b)
5’ PCR Primer A 5’ Primer B
5’ 3’
5’ 3’
Mix,denature and anneal
DNA plotmerase
(c)
5’
+
3’
5’ 3’
3、用一个含有部分接头序列的通用引物UPM (universal primer, UPM)作为下游引物。 4、以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的 DNA片段扩增出来。 5′-Oligo(dT)16~30MN-3′, M=A/G/C;N=A/G/C/T
SMARTTM 5‘-RACE的原理是:
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
盒式突变举 例1
HindIII
Eco RI
Mutagenic oligonucleotides
·· ·AAGCTT·· ·target· GAATTC·· · · · AGCT ·· ·TTCGAA·· ·target· CTTAAG·· · · ·

反转录PCR（见第八章）
11.1.4 其他研究RNA转录的技术
cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends, RACE） 5’-RACE 3’-RACE

SMARTTM 3‘-RACE的原理是: 1、利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点， 以连有SMART寡核核酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN 作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。 2、然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作 为上游引物。
Bait gene
Prey (Y) Bait (X)
AD Gal4激活域
BD Gal4结合域
LacZ
Repoter gene operator
LacZ
Repoter gene
operator
BD gene Bait plasmid
AD gene prey gene prey plasmid
诱饵与靶蛋白之间 的相互作用激活了 报告基因的表达
B、酵母双杂系统的组成部分 （1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋 白称诱饵蛋白（bait）； （2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达 的蛋白称靶蛋白（prey）； （3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。 C、酵母双杂系统的工作原理
BD gene Bait plasmid
AD gene prey gene prey plasmid
11.1.3 通过引物延伸来研究转录物
确定转录起始点的研究
获知转录物的部 分序列 设计引物 通过反转录对引 物延伸 对产物进行检测 确定转录的起始 点位置

11.1.4 其他研究RNA转录的技术
Northern杂交（自习） 定义 应用的范围
11.1.4 其他研究RNA转录的技术
AGCT
TTAA
T4 DNA ligase
Transformed into E coli
盒式突变举 例2
Arg Glu
Ile
*** Glu Met *** Glu Ala Val Ser Met
AG ATG C
G C TCGA GAA ATC NNG GAG ATG NNC GAAGCGGTT
CTT TAG III CTC TAC III CTT CGC CAATC
非变性聚丙稀酰氨凝胶
原理: 蛋白与DNA结合 后,保护这段被结合的DNA 不被内切核酸酶降解,电泳检测不到这段被覆盖的 蛋白,形成类似脚印的区域. 具体实验过程描述:P197
修饰干扰实验

碱基被修饰后,影响了其与蛋白质的结合能力, 对目标DNA中的碱基进行修饰 从能被蛋白结合的到不能被蛋白结合.
检测被修饰的碱基的位置
11.2.2 通过缺失分析来识别调控序列
报告基因 通过报告基因转入宿主中,区别原有的在 基因组中的基因的拷贝 报告基因具备的两个特点(P201)


缺失分析 将具有不同程度缺失的调控序列与报告基因融 合的载体,转化给宿主,检测宿主中报告基因的 表达模式以及强度的方法
(d)
3’
+
3’
PCR with primer B and primer C
11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作 用的研究
1、噬菌体展示技术原理 A、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因 或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋 白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳 蛋白融合表达。 B、融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬 菌体表面。 C、被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间 结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。