HPLC及HPLCMS分析方法的开发及其在药物分析中的应用
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• 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 • 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即
可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
定量
限度试验
准确度
+
+
*
精密度
+
+
-
专属性
+
+
+
检测限
-
-
+
定量限
-
+
-
线性
+
+
-
范围
+
+
*
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
10
类型3
* + * * * * *
类型4
鉴别试验
+ -
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
pH 2.0
去甲阿米替林
pH 7.0
阿密曲替林
26
固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留 时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！
准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）
6
方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes
Fl DO
Fe
P
HSS C18 SB
Fl
D
P
IA
Fe
O
0.00
1.20
2.40
3.60
4.80
23
Minutes
ຫໍສະໝຸດ Baidu
Acetonitrile,
0.1% formic acid (pH 3)
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N] P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
固定相
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
O-Si
O-Si OH O-Si O-Si OH
O-Si OH O-Si O-Si O-Si
OH O-Si O-Si
双重保留机理:
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
IA
Fl D
P Fe
Fl
O I AO
Fl O
D
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N]
碱性及中性化合物
Fe
P
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
33
PD Fe
% Improvement
20 – 40% 15 – 20% > 400%
影响分离度的因素
17
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发!
• 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查
• 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
• 可自动选择色谱柱和流动相
• 拖尾因子
– T2
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
8
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
9
方法验证- USP<1225>
验证的内容
类型1
类型2
非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
- 用一个确定方法来挑战现实的分析环境 - 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ - 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
5
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
10
12
Hybrid Particle pH Range
32
Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18 pH 10, ACN
PD
Fe
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
浓度2:80% 原料及制剂
浓度3:100% 原料及制剂
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药
浓度3 原料药
浓度4 原料药
浓度5 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
方法验证的复杂性
2
3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B)
1
5. 1-Pyrenesulfonic acid (A)
6. Imipramine (B)
7. Amitriptyline (B)
8. Flavone (N)
9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB)
27
固定相
丧失浸润现象： 100%水溶液中保留完全丧失
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
起始：填料完全浸润 － “Wetted”
停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 －“De-Wetted”
0
2
4
Vo：被分析物没有保留
28
6
8
10
Minutes
流动相
• 甲醇
– 质子化溶剂 [氢键供给者] – 洗脱能力较乙腈弱 – 粘度较乙腈高 – 低紫外波长下有吸收
– 再进行方法优化 • 梯度/温度
15
影响分离度的因素选择性最为重要
Rs N 1 k 4 k1
Maximized in UPLC Separations by:
▪Ultra-low dispersion system ▪Small [< 2 µm] particles ▪Higher pressure capability ▪Well-designed columns
• 乙腈
– 非质子化溶剂 [氢键接受者] – 洗脱能力较甲醇强 – 粘度较甲醇低 – 低紫外波长下透光性好
29
流动相
2
10 11
RP18Low pH (pH 3)
1
5 6
8
12
100% ACN
9
34
7
2
No10 11 12
5,7 8
1:1 ACN:MeOH
1
6
9
Image 3 4
10,11
1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB)
分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
3
实验室获得方法及运用过程
方法开发 方法验证 方法确认 方法转移
4
分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） 及优化（梯度、柱温、流速等）
准确度，精密度，专属性，检测限， 定量限，线性，范围，耐用性
法定检验方法在使用环境中适用性评 估（人员、仪器、样品、试剂）
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
IA
Fl O
D
酸性化合物
Fe
P
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
34
PD Fe
Fl
I
OA
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
7
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 精密度/进样重复性
• RSD 1%, n 5 • 分离度
– Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
固定相
传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性 化合物峰形的影响
流动相 pH 7
Propranolol and Butylparaben
Naphthalen e
Acenaphthe ne
铝杂质含量 ~375 ppm Tf USP = 6.5
Amitriptylin e
5
15
25
35
45
Minutes
24
Impact on Resolution
Double N
Double k
16
Double α
Maximized in UPLC Separations by:
▪Range of column chemistries ▪Multiple particle substrates ▪Wide usable pH range ▪High retentivity ▪Wide range in selectivity
HPLC及HPLC/MS分析方法的开发 及其在药物分析中的应用
HPLC及HPLC/MS法
• 基于分离分析科学技术
– 小颗粒填料的色谱柱 – 以光谱、质谱技术作为检测手段
• 专属性、分离效率及灵敏度
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
2
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品
固定相
端基封口基团 合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
22
键合相(配体)：C18 残留硅羟基
硅胶基质
固定相
CSH C18
Fl
I A
D
O
P
Fe
AU
CSH Phenyl-Hexyl
I A
Fl
D
O
Fe
P
CSH Fluoro-Phenyl
0.04
IA
0.02
0.00
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真
实变化
11
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max
实验参数 2 Min & Max
实验参数 3 Min & Max
实验参数 4 Min & Max
12
线性 Day 1-3
浓度1: 60% 原料及制剂
• 四元溶剂或二元混合使方法开发更方便
18
影响选择性的主要因素
固定相 有机溶剂 流动相pH值 梯度
19
固定相
20
固定相
传统硅胶颗粒基质
硅羟基
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
Polyethoxysilane
Tetraethoxysilane (TEOS)
21
31
流动相pH值
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大
40
中性化合物的保留不受pH影响
Retention Factor (k)
35
30 酸性
中性化合物
25
20 酸性保留增强 [HA]
15
碱性保留增强 [B]
10
5 碱性
0 0
2
4
6
8
pH
Im SilicN a a pHo Rg ange e
H+N(CH3)2
O-Si
O-Si O-
离子交换作用
O-Si
O-Si
O- (CH) H+N OO-S- i 3 2
O-Si
O-Si
O-Si OO--Si
O-Si
当流动相为 pH68时, 硅醇基带负
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
Fl
I
OA
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18 pH 10, ACN
PD
Fe
Fl D
P Fe
Fl
O I AO
Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
13
液相色谱的方法开发
14
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合
10. Diclofenac (WA)
11. Dioseb (A)
12. Octanophenone (N)
30
34
8,9
12
6
5 7
100% MeOH
Jenkins, Diehl
流动相pH值
• 影响带有可离子化官能团的分析物 –胺 – 羧基 –酚
• 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团
• 改变流动相pH将使选择性发生极大改变
可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
定量
限度试验
准确度
+
+
*
精密度
+
+
-
专属性
+
+
+
检测限
-
-
+
定量限
-
+
-
线性
+
+
-
范围
+
+
*
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
10
类型3
* + * * * * *
类型4
鉴别试验
+ -
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
pH 2.0
去甲阿米替林
pH 7.0
阿密曲替林
26
固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留 时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！
准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）
6
方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Minutes
Fl DO
Fe
P
HSS C18 SB
Fl
D
P
IA
Fe
O
0.00
1.20
2.40
3.60
4.80
23
Minutes
ຫໍສະໝຸດ Baidu
Acetonitrile,
0.1% formic acid (pH 3)
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N] P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
固定相
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
O-Si
O-Si OH O-Si O-Si OH
O-Si OH O-Si O-Si O-Si
OH O-Si O-Si
双重保留机理:
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
IA
Fl D
P Fe
Fl
O I AO
Fl O
D
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N]
碱性及中性化合物
Fe
P
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
33
PD Fe
% Improvement
20 – 40% 15 – 20% > 400%
影响分离度的因素
17
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发!
• 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查
• 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
• 可自动选择色谱柱和流动相
• 拖尾因子
– T2
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
8
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
9
方法验证- USP<1225>
验证的内容
类型1
类型2
非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
- 用一个确定方法来挑战现实的分析环境 - 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ - 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
5
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
10
12
Hybrid Particle pH Range
32
Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18 pH 10, ACN
PD
Fe
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
浓度2:80% 原料及制剂
浓度3:100% 原料及制剂
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药
浓度3 原料药
浓度4 原料药
浓度5 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
方法验证的复杂性
2
3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B)
1
5. 1-Pyrenesulfonic acid (A)
6. Imipramine (B)
7. Amitriptyline (B)
8. Flavone (N)
9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB)
27
固定相
丧失浸润现象： 100%水溶液中保留完全丧失
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
起始：填料完全浸润 － “Wetted”
停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 －“De-Wetted”
0
2
4
Vo：被分析物没有保留
28
6
8
10
Minutes
流动相
• 甲醇
– 质子化溶剂 [氢键供给者] – 洗脱能力较乙腈弱 – 粘度较乙腈高 – 低紫外波长下有吸收
– 再进行方法优化 • 梯度/温度
15
影响分离度的因素选择性最为重要
Rs N 1 k 4 k1
Maximized in UPLC Separations by:
▪Ultra-low dispersion system ▪Small [< 2 µm] particles ▪Higher pressure capability ▪Well-designed columns
• 乙腈
– 非质子化溶剂 [氢键接受者] – 洗脱能力较甲醇强 – 粘度较甲醇低 – 低紫外波长下透光性好
29
流动相
2
10 11
RP18Low pH (pH 3)
1
5 6
8
12
100% ACN
9
34
7
2
No10 11 12
5,7 8
1:1 ACN:MeOH
1
6
9
Image 3 4
10,11
1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB)
分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
3
实验室获得方法及运用过程
方法开发 方法验证 方法确认 方法转移
4
分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） 及优化（梯度、柱温、流速等）
准确度，精密度，专属性，检测限， 定量限，线性，范围，耐用性
法定检验方法在使用环境中适用性评 估（人员、仪器、样品、试剂）
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
IA
Fl O
D
酸性化合物
Fe
P
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
34
PD Fe
Fl
I
OA
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
7
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 精密度/进样重复性
• RSD 1%, n 5 • 分离度
– Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
固定相
传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性 化合物峰形的影响
流动相 pH 7
Propranolol and Butylparaben
Naphthalen e
Acenaphthe ne
铝杂质含量 ~375 ppm Tf USP = 6.5
Amitriptylin e
5
15
25
35
45
Minutes
24
Impact on Resolution
Double N
Double k
16
Double α
Maximized in UPLC Separations by:
▪Range of column chemistries ▪Multiple particle substrates ▪Wide usable pH range ▪High retentivity ▪Wide range in selectivity
HPLC及HPLC/MS分析方法的开发 及其在药物分析中的应用
HPLC及HPLC/MS法
• 基于分离分析科学技术
– 小颗粒填料的色谱柱 – 以光谱、质谱技术作为检测手段
• 专属性、分离效率及灵敏度
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
2
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品
固定相
端基封口基团 合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
22
键合相(配体)：C18 残留硅羟基
硅胶基质
固定相
CSH C18
Fl
I A
D
O
P
Fe
AU
CSH Phenyl-Hexyl
I A
Fl
D
O
Fe
P
CSH Fluoro-Phenyl
0.04
IA
0.02
0.00
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真
实变化
11
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max
实验参数 2 Min & Max
实验参数 3 Min & Max
实验参数 4 Min & Max
12
线性 Day 1-3
浓度1: 60% 原料及制剂
• 四元溶剂或二元混合使方法开发更方便
18
影响选择性的主要因素
固定相 有机溶剂 流动相pH值 梯度
19
固定相
20
固定相
传统硅胶颗粒基质
硅羟基
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
Polyethoxysilane
Tetraethoxysilane (TEOS)
21
31
流动相pH值
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大
40
中性化合物的保留不受pH影响
Retention Factor (k)
35
30 酸性
中性化合物
25
20 酸性保留增强 [HA]
15
碱性保留增强 [B]
10
5 碱性
0 0
2
4
6
8
pH
Im SilicN a a pHo Rg ange e
H+N(CH3)2
O-Si
O-Si O-
离子交换作用
O-Si
O-Si
O- (CH) H+N OO-S- i 3 2
O-Si
O-Si
O-Si OO--Si
O-Si
当流动相为 pH68时, 硅醇基带负
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
Fl
I
OA
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
I A
C18 pH 10, ACN
PD
Fe
Fl D
P Fe
Fl
O I AO
Test Probes: P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
13
液相色谱的方法开发
14
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合
10. Diclofenac (WA)
11. Dioseb (A)
12. Octanophenone (N)
30
34
8,9
12
6
5 7
100% MeOH
Jenkins, Diehl
流动相pH值
• 影响带有可离子化官能团的分析物 –胺 – 羧基 –酚
• 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团
• 改变流动相pH将使选择性发生极大改变