37高效液相色谱法标准操作规程
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程高效液相色谱仪操作技巧任何颗粒物进进高效液相色谱仪后都会在柱子进口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力加添并使色谱峰变形。
因此，要实行各种防备措施，包括操纵步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或削减颗粒物进进高效液相色谱仪中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并进步数据的牢靠性。
在高效液相色谱仪中，颗粒物的紧要来源有三个途径：活动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、被测样品使用针筒式过滤器不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会或多或少的丢失。
丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。
2、活动相无论是高效液相色谱仪HPLC级的水还是在试验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2μm微孔滤膜。
任何一种缓冲液中加进了固体物，必定活动相过滤将。
少量杂质颗粒存在于活动相中必定成为残渣。
解决方法：2.1.活动相制备仅接受HPLC级液体时不需要过滤，反之全部活动相构成在使用前必需过滤。
2.2.在连接储液瓶和泵的输液管的末端进口接受下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很紧要的。
这个过滤器的规格为≥10μm的微孔物质，所以它不能取代活动相过滤步骤，但是它能除往系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的牢靠性。
2.3.推举在HPLC系统中接受一个0.45或0.5μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。
这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如接受一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又便利（几分钟就可更换）。
若接受在线过滤，高效液相色谱仪检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升确定值，例如25%或加添500psi，应当更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。
3、仪器系统部件的磨损物最后，在高效液相色谱仪HPLC系统中颗粒物的另一个紧要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。
高效液相色谱法流动相配制标准操作规程
更换流动相时应及时更新《流动相标签》。
流动相效期
流动相类别
效期
纯甲醇
3 个月
纯乙腈
1 个月
5%的甲醇/乙腈水溶液
15 天
缓冲盐溶液
3天
纯化水
1天
甲醇与缓冲盐混合溶液
7天
乙腈与缓冲盐混合溶液
7天
例如：纯甲醇使用日期是 2015 年 06 月 11 日，有效期至 2015 年 09 月 10 日；甲醇与缓冲盐混
装置中，润洗后抽滤，再将抽滤后的纯有机溶剂倒入量筒中润洗，待用。
记录填写
流动相配制后，配制人员将配置过程记录在实验记录本或检验记录上。
注意事项
流动相配制应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水。
过滤流动相时应注意区分水系膜和油系膜的使用范围，防止误用。
配制不含水流动相的抽滤器具及储存容器应清洁干燥，不得带水。
流动相的配制 含水流动相和不含水流动相的配制所用量筒应区分开。配制不含水的有机溶剂类流动相所用量筒 必须是干燥的，不得有水。 根据流动相配制规定的体积比例，在清洁的带塞量筒中分别倒入相应的溶剂；若该流动相需加入 适量酸或碱，则戴上一次性手套，用专用注射器吸取规定体积的酸或碱，加入量筒；盖上塞子， 摇匀，振摇过程中应注意排气。 含盐的缓冲液类流动相的配制应根据流动相配制规定的体积比例，分别称取规定重量的盐于清洁 的带塞量筒中，加入适量纯水，振摇；待固体完全溶解后，再加纯水至规定刻度，盖上塞子，摇 匀。 若该流动相对 pH 值有特殊要求，根据流动相配制规定的体积比例，用酸/碱调节 pH 值，用 pH 计 测定，直至流动相的 pH 值在规定范围内。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。
2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。
3责任：QC人员对本SOP实施负责。
4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。
GMP认证全套文件资料37-高效液相色谱法标准操作规程
高效液相色谱法标准操作规程目的：建立高效液相色谱法标准操作规程。
适用范围：高效液相色谱法。
责任：质检员实施本操作规程，检验室主任负责监督本规程正确执行。
程序：高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1.对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2.系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整。
应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数（n ） 在选定的条件下；注入供试品对仪器或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R /（W h/2）计算色谱柱的理论板数。
如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改普通色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
高效液相色谱法标准操作规程
范围：原料、产品职责：检验室对本规程的实施负责正文：1.原理——高效液相色谱法是将具一定性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
——高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
2.操作前的准备2.1流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
凡规定PH值的流动相、应使用精密PH计进行调节。
配制好流动相应通过适宜的0.45µm滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相及时待用。
2.2供试溶液的配制供试品用规定溶剂配制成供试溶液定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。
供试溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45µm滤膜滤过。
必要时在配制供试溶液前，样品需经提取净化。
以免对色谱系统产生污染或对色谱干扰。
3.系统适用性试验——按各品种项下要指法训练对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。
3.1色谱柱理论板数（n）在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54(tR/ Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。
如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
3.2分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：2（tR2- tR1）R=W1+W2式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W 1及W2为此相邻两峰的峰宽。
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程高效液相色谱仪（HPLC）是一种重要的分析仪器，广泛应用于化学、生命科学、环境监测等领域。
为了保证色谱仪的正常运行和准确分析结果，需要遵守以下操作规程：1. 准备工作a. 首先，确保色谱仪及其附件的电源已接通，并确认仪器处于正常工作状态。
b. 检查溶剂桶内的溶剂是否充足并无杂质，并确认管路连接正常。
c. 检查流动相液位是否正常，并调整泵的流速和梯度程序参数。
2. 样品制备和准备a. 样品应充分溶解并过滤净化，以避免样品中的杂质对色谱分离产生干扰。
b. 选择合适的进样方式（自动或手动），并根据进样方式调整进样器的参数。
3. 进样器操作a. 将样品注射器插入进样口，并注意不要损坏色谱柱。
b. 设置进样体积和进样速度等参数，并进行一次空白进样以清洗进样器。
4. 色谱柱准备a. 定期检查色谱柱是否损坏，并根据需要更换。
b. 根据实验需要选择合适的色谱柱，并注意记录色谱柱的批号和使用次数。
5. 柱温控制a. 根据分析需要选择合适的柱温，并使用温度控制系统保持恒定。
b. 注意避免温度突变和波动，以保证分析结果的准确性和重复性。
6. 检测器操作a. 根据需要选择合适的检测器，如紫外-可见光检测器（UV-Vis）、荧光检测器、电导检测器等。
b. 设置检测器的参数，如波长、增益和灵敏度，并进行基线校准。
7. 数据采集与处理a. 启动数据采集系统，并设置采集参数，如采样率、数据类型和运行时间等。
b. 对采集到的数据进行处理和分析，如峰识别、定量分析和峰面积计算。
8. 清洗和维护a. 实验结束后，关闭色谱柱和进样器的阀门，并用溶剂清洗色谱柱和进样器，以防止堵塞和降低杂质残留。
b. 清洗完成后，注意关闭色谱仪的电源，并按照要求对色谱柱和进样器进行维护和保养。
总结：高效液相色谱仪的操作规程包括准备工作、样品制备、进样器操作、色谱柱准备、柱温控制、检测器操作、数据采集与处理以及清洗与维护等。
遵守这些规程可以确保色谱仪的正常运行和准确分析结果，提高实验效率。
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程1．开关机顺序●开机顺序：打开LC各单元电源－控制器电源－电脑－LC-Solution工作站，开机后能听到“哔”声。
●关机顺序：与开机顺序相反，即先关闭LC-Solution工作站－控制器－LC各单元电源2．流动相及样品的准备●流动相配制所用的有机相必须是色谱级的，所用的水必须是双重蒸馏水。
流动相必须经0.45um 的微孔滤膜过滤后方能进入LC系统。
水和有机相所用的微孔滤膜不同，有机相（如甲醇）的过滤用F膜，水用水膜。
●样品溶液亦必须用0.45um 的微孔滤膜过滤后才能进样。
3．工作站的进入及系统的开启●双击桌面上的“labsolution”图标，选择“operation”项并单击，在弹出窗口后按OK进入工作站。
●首先打开A、B泵上的排空阀（open方向旋转180度）。
然后按二泵面板上的“purge”键开始自动清洗A、B流路3分钟，然后在分析参数设置页中设置流速1ml/min，BCONC 0％，并设置合适的检测波长，柱温，停止时间。
在完成后点击“Download”将分析参数传输至主机。
●分析方法的保存：选择file－save method file as－取名保存文件●系统的启动：点击“instrument on/off”键开启系统（此时泵开始工作。
4．进样准备●观察基线及柱压，待基线平直（－5～80mv），压力稳定（0.5Mpa内）时方可进样。
5. 进样●点击助手栏中的“single start”键，弹出对话框，在对话框中输入“sample name”“method”“data file”等。
●填完后点击“start”，出现触发窗口，进样，仪器开始自动采样分析。
6. 数据文件的调用及查看●点击助手栏中的“Postrun analysis”键，打开数据处理窗口。
●打开文件搜索器，定位至数据文件所在文件夹，选择文件的类型，双击文件名即可打开数据文件（此时可以查看峰面积、保留时间等参数）。
高效液相色谱仪使用与操作规程
4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正
常。
第二步、开 机
接通电源，依次开启不间断电源、四 元泵、自动进样器、柱温箱、检测器，待 泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、
主机，最后打开色谱工作站。
一）参数设定
1、 波长设定： 2 、流速设定： 3 、流动相规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积
的流动相。
检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。
观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如
超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操
作。
观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声
二、样品
1、采用过滤或离心方法处理样品，
确保样品中不含固体颗粒； 2、用流动相或比流动相弱（若为反
相柱，则极性比流动相大；若为
正相柱，则极性比流动相小）的 溶剂制备样品溶液，尽量用流动
相制备样品液；
3、手动进样时，进样量尽量小，使 用定量管定量时，进样体积应为 定量管的3～5倍；
第四步、注意事项
人的方法及实验结果；
3、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒， 洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针
筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
4、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过 滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用 5%稀硝酸溶液浸泡后再洗
四、出现肩峰或分叉
1.样品体积过大
1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰 的15% 2.样品溶剂过强 3.柱塌陷或形成短路通道 4.柱内烧结不锈钢失效 2.采用较弱的样品溶剂 3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
高效液相色谱法标准操作规程
一、目的：建立高效液相色谱法标准操作规程，确保检验人员正确操作。
二、适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。
三、职责：检验员负责本操作规程的执行。
四、正文：1 定义及概述：1.1 高效液相色谱系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法，注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统和处理色谱信号。
2 仪器与用具：高效液相色谱仪、进样器、电脑、试液瓶（1000ml）。
3 试液与试药：色谱甲醇、超纯水等。
4 对仪器的一般要求和色谱条件。
4.1高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9-4.6mm，填充剂粒径为3-10um。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2um）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
4.2 色谱柱4.2.1反相色谱柱以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
4.2.2正相色谱柱用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
4.2.3离子交换色谱柱用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
4.2.4手性分离色谱柱用手性填充剂填充而成的色谱柱。
4.2.5色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密及均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
4.2.6温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果，可适当提高色谱柱温度，但一般不宜超过60℃。
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程1 溶剂输送泵操作1.1 安装后的准备1.1.1 在烧杯中装入大约100mL异丙醇，在烧杯中放入吸滤器，将一段SUS 管的一端连接在泵出口，而另一端放入烧杯中。
1.1.2 将排液管的一端连接到排液管接口上，另一端放入废液瓶中。
1.1.3 打开电源ON，显示初始屏幕。
1.1.4 逆时针方向转动排液阀180度，打开排液阀。
按purge键，泵开始运行，指示灯亮。
1.1.5 冲洗完毕后，按一次func键，进入流速设定状态，并且设定流速1mL/min。
1.1.6 将排液阀旋钮顺时针方向旋转到底，关闭排液阀。
1.1.7 按pump键，泵启动，指示灯亮。
大约3--5分钟后，再按pump键，泵停止运行，指示灯灭，完成操作准备。
1.2 运行的检查1.2.1 开始运行前务必确保：储液瓶中装有流动相，并且吸滤器已经放入储液瓶中。
排液管的另一端已经放入废液瓶中。
1.2.2 将排液阀旋钮逆时针方向旋转180度，打开排液阀。
1.2.3 按CE 键返回到初始屏幕。
按pump键，泵大约以1ml/min的流速运行（指示灯亮）。
1.2.4 观察流动相流出排液管大约10秒钟。
在此期间，流动相应连续流出并且无气泡出现。
1.2.5 再按pump或purge键，泵停止运行，指示灯灭。
1.3 上面两步完成后仪器进入工作状态。
2 紫外—可见检测器操作2.1 按下电源开关，打开仪器，将发生如下情况。
2.1.1 显示板上所用光点及指示灯亮。
自动检查内存，瞬间显示控制程序的版本号。
2.1.2 预热大约20sec，仪器的单色器找到其初始位置（大约1分钟）。
2.1.3 （使用氘灯的亮线（656nm）自检波长的准确性（大约10 sec）。
2.1.4 如果没有检查出错误，显示正确信息，几秒钟后，由初始屏幕代替原信息2.1.5 如果自检没有错误，屏幕显示正确，此时可以进行操作。
为初始状态，将显示初始屏幕。
2.2 设定测定波长2.2.1 按CE键。
高效液相的标准操作规程(SOP)
WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）1流动相的处理1.1过滤溶剂溶剂在使用前要用过滤器过滤，有机相和纯水相通常可以不过滤，如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。
同时一些缓冲盐溶液过夜后易生菌，使用前要抽滤或者重新配制。
实验室应有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择（反光面朝上），过滤水相时，要先用1-2ml 水润湿过滤膜，有助于快速抽滤。
1.2保持储液瓶的清洁用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。
流动相瓶子要保持清洁。
1.3保证溶剂的质量一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。
1.4 故障及解决方法1.4.1 流动相脱气不充分流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。
可试用下列方法解决问题：a、流动相再脱气；b、采用更有效的脱气方法（如抽滤）或两种方法配合使用；c、改系统内混合为系统外预混合。
1.4.2 流动相供给不畅流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。
应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。
输液管道上装滤头沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。
过滤器阻塞会引起管道和泵腔进气泡，压力不稳。
压力不稳时，如果已经排除流动相混合不均匀的状况，则观察滤头外部是否长毛（一般水相滤头易长毛），去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，是过滤器被微粒所阻塞或长霉。
解决方法：a、换上新的过滤器（滤头）。
b、将滤头拆下，先用纯水超声15min，再换50%甲醇水溶液超声，再换纯甲醇超声，如果是水相的滤头，在安装前还需要用纯水超声。
如果上述还不能解决问题，则使用10%稀硝酸水溶液超声滤头，可起到除去菌类微生物的作用。
1.4.3 检测器和流动相管路被污染由于污染，噪音越来越大，检测器被污染。
高效液相色谱法操作规程(2015版药典)
范围：原料、中间体、成品检验。
责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。
内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
1.1色谱柱反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。
常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程
《高效液相色谱仪操作规程》
一、实验目的
本实验旨在通过高效液相色谱仪分析样品，准确测定目标化合物的含量，并学习高效液相色谱仪的操作方法和技巧。
二、实验设备
1. 高效液相色谱仪
2. 注射器
3. 色谱柱
4. 移液管
5. 色谱仪软件
三、操作步骤
1. 打开高效液相色谱仪的电源并进行系统初始化，启动色谱仪软件。
2. 调整流速，进样量等参数，使得实验条件符合要求。
3. 将样品通过移液管注入色谱柱中，注意避免样品泡沫和气泡的产生。
4. 设置色谱条件，如梯度洗脱，流速等，启动色谱分析。
5. 记录实验数据和结果，并进行数据处理和分析。
6. 清洗色谱仪，保持设备清洁。
四、实验注意事项
1. 在操作色谱仪时，要严格按照操作步骤进行，严禁随意更改参数。
2. 在进行样品进样时，要小心操作，避免产生气泡和样品泡沫。
3. 在进行色谱分析时，注意梯度洗脱条件的设置，保证分析结果准确。
4. 在实验结束后，及时清洗色谱仪，保持设备干净。
五、实验结果
根据实验数据和结果，可以得出目标化合物的含量和纯度，并进行结果的解释和分析。
通过《高效液相色谱仪操作规程》的学习，使我们更加熟悉高效液相色谱仪的操作方法和技巧，能够准确进行样品分析，为科研工作的开展提供了重要的技术支持。
高效液相色谱法操作规程与注意事项
高效液相色谱法操作规程与注意事项1.程序1.1.仪器及性能要求：所用的仪器为高效液相色谱仪，由泵系统，进样系统，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。
1.1.1.泵系统：HPLC泵系统通过高压力管和设备从溶剂瓶中吸取计量的流动相到柱子中。
现行的泵系统有一元或多元计算机控制的计量泵组成，这些泵可以按照梯度洗脱的要求改变流动相的比例或者是按等度洗脱的要求混合流动相。
1.1.2.进样系统：化合物被溶解在流动相或合适的溶剂中，可以通过手动进样器或定量环，或自动进样器转移到流动相中。
自动进样器由可存放进样瓶的卡盘组成，进样瓶的顶部有一个可以刺入的隔膜，进样针通过这个隔膜将样品转移到一个定量环中然后输送到色谱系统中。
1.1.3.色谱柱：最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅胶和氨基键合硅胶）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂量；分子排阻色谱系统凝胶或系统高分子多孔微球等；对映异构体的分离通常使用手性柱。
除另有规定外，柱温为室温。
1.1.4.检测器：常用的检测器包括紫外分光检测器，示差折光检测器，二极管阵列检测器。
固定波长检测器在单一波长下运行，典型的波长是254nm，通过低压力的汞灯发射。
可变波长的检测器包含持续的能源，例如氘灯或高压力氙灯，通过单色器或干涉过滤器产生一定波长的单色光。
1.2.系统适用性试验1.2.1.为了确定最终运行系统的有效性，应当进行系统适用性试验。
整个系统可以用以下指标来评价：信噪比、理论塔板数，分离度，重复性，拖尾因子，其指标及计算方法应在相关分析方法中予以规定，如果没有专门的规定，按以下方法进行计算：信噪比：用于评价色谱系统检测微量物质的能力，美国药典的计算公式：S/N=2H/h，H为峰顶到基线的距离，h为基线中噪声峰最大值与最小值的差，该段基线需取≥5倍半峰高宽的距离，如果有可能，目标峰两侧取相等的距离（如图1）。
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程1 定义及概述：1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求：2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备：3.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH 计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45µm适宜的滤膜滤过，用前脱气。
高效液相色谱法操作规程与注意事项
⾼效液相⾊谱法操作规程与注意事项⾼效液相⾊谱法操作规程与注意事项1.程序1.1.仪器及性能要求：所⽤的仪器为⾼效液相⾊谱仪，由泵系统，进样系统，⾊谱柱，检测器和⾊谱数据处理系统组成。
1.1.1.泵系统：HPLC泵系统通过⾼压⼒管和设备从溶剂瓶中吸取计量的流动相到柱⼦中。
现⾏的泵系统有⼀元或多元计算机控制的计量泵组成，这些泵可以按照梯度洗脱的要求改变流动相的⽐例或者是按等度洗脱的要求混合流动相。
1.1.2.进样系统：化合物被溶解在流动相或合适的溶剂中，可以通过⼿动进样器或定量环，或⾃动进样器转移到流动相中。
⾃动进样器由可存放进样瓶的卡盘组成，进样瓶的顶部有⼀个可以刺⼊的隔膜，进样针通过这个隔膜将样品转移到⼀个定量环中然后输送到⾊谱系统中。
1.1.3.⾊谱柱：最常⽤的⾊谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相⾊谱系统使⽤⾮极性填充剂，以⼗⼋烷基硅烷键合硅胶最为常⽤，⾟基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅胶和氨基键合硅胶）也有使⽤。
正相⾊谱系统使⽤极性填充剂，常⽤的填充剂有硅胶等。
离⼦交换⾊谱系统使⽤离⼦交换填充剂量；分⼦排阻⾊谱系统凝胶或系统⾼分⼦多孔微球等；对映异构体的分离通常使⽤⼿性柱。
除另有规定外，柱温为室温。
1.1.4.检测器：常⽤的检测器包括紫外分光检测器，⽰差折光检测器，⼆极管阵列检测器。
固定波长检测器在单⼀波长下运⾏，典型的波长是254nm，通过低压⼒的汞灯发射。
可变波长的检测器包含持续的能源，例如氘灯或⾼压⼒氙灯，通过单⾊器或⼲涉过滤器产⽣⼀定波长的单⾊光。
1.2.系统适⽤性试验1.2.1.为了确定最终运⾏系统的有效性，应当进⾏系统适⽤性试验。
整个系统可以⽤以下指标来评价：信噪⽐、理论塔板数，分离度，重复性，拖尾因⼦，其指标及计算⽅法应在相关分析⽅法中予以规定，如果没有专门的规定，按以下⽅法进⾏计算：信噪⽐：⽤于评价⾊谱系统检测微量物质的能⼒，美国药典的计算公式：S/N=2H/h，H为峰顶到基线的距离，h为基线中噪声峰最⼤值与最⼩值的差，该段基线需取≥5倍半峰⾼宽的距离，如果有可能，⽬标峰两侧取相等的距离（如图1）。
高效液相色谱（HPLC）操作规程
高效液相色谱（HPLC）操作规程一操作1.准备工作⑴流动相的准备应根据实验选择合适的流动相，所有流动相原则上应选择HPLC级别，水应选择超纯水，并应保持新鲜。
所有流动相在进行实验前应经过相应的脱气处理，脱气时间应根据流动相的量相应增加，但一般超声脱气不应少于20min。
在实验过程中应保证足够的流动相，流动相的量与流速、洗脱时间等有关，应根据具体情况进行准备。
⑵样品的准备对于待测的样品，在进样之前应经过滤膜过滤，根据样品的不同选择不同种类、不同直径的滤膜。
2. 排气打开purge阀，键入stop→prime，直到无气泡停止stop。
B泵同样操作。
关闭purge阀。
3. 开机打开电脑主机和显示器，点击Galaxie，进入工作站。
选择系统，点击Agilent HPLC.点击overview，可观察仪器各部分状态。
打开泵及检测器的电源。
二 分析方法建立1.进入工作站系统界面。
点击数据，文件→新建→方法，出现视窗，点击前进即可。
键入方法名和相应描述→点击ok后出现方法文档。
2.210的设定点击控制→210图标→Elution。
选择流动相A和B的种类。
Compressibility、Pressure Constant以及Refill Time属于内置参数无需设定。
设置A、B流动相的比例，通过改变B的比例设定。
如需梯度洗脱，则根据方法对Equilibrium Time 和Hold Time进行设定。
点击Misscellaneous。
Start Mode选择Inject Trigger on Pump A。
End of Sequence 选择Leave Pump on。
210设定结束。
3.325的设定点击325图标，选择Signal。
其中Detector Bunch Rate建议设置成2（10Hz），Noise Monitor Length建议设定成64，Response Time建议设定0.5。
根据方法设定相应波长。
高效液相色谱法标准操作规程
1.目的：规范高效液相色谱法检验操作，保证检验的质量。
2.范围：适于本公司原辅料、成品的高效液相色谱法操作。
3.责任：质量管理科、中心化验室、检验员。
4.检验依据：《中国药典》2015年版四部高效液相色谱法操作方法。
5.内容：5.1 简述◆高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
◆高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
◆高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。
检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
◆高效液相色谱仪的使用要求◆按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705－90）”的规定作定期检定，应符合规定。
●仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
◆具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
5.2 操作前的准备◆流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查．应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色谱法标准操作规程
目的：建立高效液相色谱法标准操作规程。
适用范围：高效液相色谱法。
责任：质检员实施本操作规程，检验室主任负责监督本规程正确执行。
程序：
高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1.对仪器的一般要求
所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2.系统适用性试验
按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和
调整。
应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数（n ） 在选定的条件下；注入供试品对仪器或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R /（W h/2）计算色谱柱的理论板数。
如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改普通色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
(2)分离度 定量分析时，为便于准确测量，要求定时峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R ）的计算公式为：
(
)2
1122w w t t R R R +-=
式中 2R t 为相邻两峰中后一峰的保留时间；
1R t 为相邻两峰中前一峰的保留时间；
W 1及W 2为此相邻两峰的保留时间；
除另有规定外，分离度应大于1.5。
(3)重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。
也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。
(4)拖尾因子 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子
拖尾因子公式为：
1
05.02d W T h
=
式中W 0.05h 为0.05峰高处的峰宽； d 1为峰极大至峰前沿之前的距离。
除另有规定外，T 应在0.95～1.05之间。
3.测定法
定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。
测定杂质含量时，须采用峰面积法。
(1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量注入仪器，记录色谱图。
测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
()R
R S
S C A C A f //=
校正因子
式中 A S 为内标物质的峰面积或峰高； A R 为对照品的峰面积或峰高； C S 为内标物质的浓度； C R 为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面或峰高，按下式计算含量：
()S
R X
X C A A f C /•
=含量
式中A X 为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；
C X 为供试品（或其杂质）的浓度。
f 、A S 和C S 的意义同上。
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。
(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：
()R
X
R
X A A C C =含量 式中各符号意义同上。
(3)加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。
在建立方法时，按各品种项下规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。
此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分（面积约为通常条件下满量程峰积分值的10%）。
然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成
分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分峰面积比较，依法计算各杂质含量。
(4)不加校正因子的主成分自身对照法当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。
同上述（3）法配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应与成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。
若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。
色谱图I上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。
然后依法计算。
(5)面积归一化法
由于峰面积归一化测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品的杂质含水量。
除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。
方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂以外的总色谱面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率，即得。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好。