凝胶层析.
凝胶层析法
聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
42
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
43
Sepharose
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝
胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分
离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达 相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，
其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳 糖相结合的链状多糖。
这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝 胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性
远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构
破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～ 40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
20
第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
分离的目的。
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶 质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
凝胶层析实验报告结论
一、实验目的本次实验旨在通过凝胶层析技术，对混合溶液中的不同组分进行分离，验证凝胶层析法的原理，并探讨影响分离效果的因素。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
凝胶作为一种具有多孔结构的材料，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子量物质的分离。
实验中，混合溶液中的组分通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于无法进入凝胶孔道，只能沿着凝胶颗粒之间的缝隙流出，而分子量较小的物质则可以进入凝胶孔道内部，从而在凝胶层析柱中停留更长时间，最终实现分离。
三、实验结果与分析1. 实验现象（1）观察实验过程中，不同组分在凝胶层析柱中的洗脱顺序。
根据实验结果，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出。
（2）观察凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况。
实验过程中，凝胶颗粒对分子量较大的组分吸附作用较弱，而对分子量较小的组分吸附作用较强。
2. 实验数据分析（1）通过计算不同组分的洗脱时间，可以得出其分子量大小。
实验结果表明，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
（2）分析凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况，可以发现分子量较小的组分在凝胶层析柱中停留时间较长，说明凝胶颗粒对其吸附作用较强。
四、实验结论1. 凝胶层析法可以有效地对混合溶液中的不同组分进行分离，实现不同分子量物质的分离。
2. 凝胶层析法的分离效果受分子量大小、凝胶孔径、洗脱液等因素的影响。
在本实验中，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。
3. 凝胶层析柱中凝胶颗粒对分子量较小的组分吸附作用较强，导致其在凝胶层析柱中停留时间较长。
4. 实验过程中，凝胶层析柱的装填、洗脱液的选择、流速的控制等操作对实验结果有较大影响。
在实际操作中，应严格控制实验条件，以提高分离效果。
五、实验展望1. 在今后的实验中，可以尝试改变凝胶孔径、洗脱液等因素，进一步优化实验条件，提高分离效果。
2. 探索凝胶层析技术在生物、医药、化工等领域的应用，为相关领域的研究提供技术支持。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
凝胶层析技术(凝胶过滤).
3、样品的加入吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。
打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩展洗脱，用试管将洗脱液。
4、洗脱：加去离子水洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。
5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线：以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称。
6、凝胶的回收。
四、凝胶层析的特点 1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，重复性高。
2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素（一）凝胶的选择：（二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。
100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对称和狭窄。
250-400目为最细粒。
250-400 （三）洗脱流速对分离效果的影响：一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。
（四）离子强度和附值（五）样品液体积对分离效果的影响通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。
（六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系（七）Vo和Vi。
生物制药工艺学 7凝胶层析
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。
Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。
生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的 物质。
分离不溶水的有机物质。
常用的商品化凝胶介质
一
第三节 凝胶层析的实验条件 和操作
如：Sephadex G－25加入羟丙基
Sephadex LH－20
2.交联葡聚糖凝胶
将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂
交联葡聚糖离子交换剂
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3.Sephacryl 系凝胶
葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。
优点：
1.分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大 于Sephadex 的范围。所以它不仅可以用于分离一 般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较 大的病毒颗粒。
②Kd=l时，Ve=V0பைடு நூலகம் Vi 对于完全可以进入凝胶内部的 小分子(全渗透)，其洗脱体积就等于外水体积和内水体积之 和。
③0<Kd<l时，Ve=V0+ KdVi.表示凝胶颗粒内部 一部分空隙可以被不同大小的分子利用，可以有不 同程度的渗入，Ve在V0与V0+Vi之间变化.
④Kd>l时,表示凝胶有一定的吸附作用,此时 Ve>V0+ Vi
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 3-氯-1，2-环氧丙烷为交联
剂，形成三维网状结构的高 分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
Sephadex G
编号意义： 1、吸液量：吸液量（ml/g）的10倍 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围： 蛋白质、多糖
凝胶色谱层析定义以及分离原理
凝胶色谱层析是一种基于分子大小差异进行分离的色谱技术，也称为凝胶层析或凝胶过滤。
其定义如下：
凝胶层析是一种利用多孔凝胶作为分离介质的色谱技术。
在凝胶层析中，样品混合物被流动相带入凝胶柱或凝胶片中。
由于不同大小的分子在凝胶层中的扩散速率不同，大分子先被流动相冲出柱体，而小分子后流出。
因此，大小不同的分子被分离。
关于其分离原理，可以这样理解：
凝胶色谱的分离原理基于分子在凝胶基质中的不同扩散速率。
样品在多孔凝胶柱中随着流动相的移动，待分离的组分沿凝胶颗粒间的孔隙移动。
大分子由于尺寸较大，只能通过凝胶颗粒间的孔隙，因此移动路径较短，先流出色谱柱。
而小分子由于尺寸较小，可以扩散进入凝胶颗粒内部，因此迁移路径长，后流出色谱柱。
这样，不同大小的分子就实现了分离。
以上内容仅供参考，建议查阅专业生物化学书籍或者咨询专业人士以获取更准确的信息。
凝胶层析知识
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五、多孔玻璃微球(Bio-glas)
特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、硅羟基存在对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。
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六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物 质。 分离不溶水的有机物质。
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层析床横截面所允许的最大压力
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三、凝胶层析操作
（一）样品和加样 样品浓度过大往往导致粘度增加， 使分表率降低，一般样品粘度小于 0.01Pa·s。 蛋白质类样品浓度:不大于4%。
样品粘度对洗脱曲线的影响 柱：交联葡聚糖G-25，4×85cm； 流速180ml/h； 样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠； （1）相对粘度为0.118； （2）相对粘度为0.042； （3）相对粘度为0.010 52
生物凝胶的编号反映出它的分离界限，如BioGel P-100，编号乘以1000正是它的排阻上限。
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（一）琼脂糖凝胶
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和 β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
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琼脂糖凝胶特点
1、链状分子，没有共价键的交联，结合力仅为氢键。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差，只能在pH4～9范围使用。 4、非特异性吸附力低。 5、分离分子量范围大。 6、颗粒强度差。
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（二）凝胶柱的装填
常用的支持物：棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃 等。要求：不漏不堵，不吸附样品，能保持一定的流 速。 空柱中应留约 1/5 的水或溶剂（避免胶粒直接冲撞支 溶胀后装柱前倒掉浮在上层 持物） 的凝胶碎片 层析柱始终保持垂直，进胶过程必须连续、均匀，不 要中断，不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶 分层和胶面倾斜。 凝胶浓度也要控制好，过浓难均匀装柱，过稀因体积 太大装柱费时，不易连续装柱而出现断层。
《凝胶层析法》课件
改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件，减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质，提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中，确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部，确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测，观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析，确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果，分析实验 误差和影响因素，总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据，应采用适当的统计方法进行处理和分析， 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失，应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一：分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异，利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离，大 分子不能进入凝胶孔洞，而小分子可以进入凝胶孔洞，从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代，最 初用于蛋白质的分离。
目前，凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高，凝胶层析法逐渐应用于更多 领域，如生物技术、制药、环境科学 等。
凝胶层析
第一节：基本原理 第二节：基本操作 第三节：应用
第一节
基本原理
当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大 分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微 孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。 而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移 动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质 量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的 目的。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质、这是由于其每克干 胶含10－20ug当量的羧基基团所致。该基团能与分 离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有 NaCl的缓冲液作洗脱液。
二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中提纯的，主要由D半乳糖 和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。 琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于 缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模 板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。
↓
标定凝胶过滤 柱的Vi
测定一系列已知 分子量的标淮样 品在柱上的洗脱 体积Ve
↓
以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和 1ogMw 作图
or
测得了待测分子量的样品的Ve
↓ ↓
以标准样品的分子 量的1ogMw对Ve作 图
由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)从标准曲线上可以求得未知样品的分子量
4、高分子溶液的浓缩
二、加样与洗脱
1．加样
加样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品 含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少，否则反之。 一般来说，加样量越少，或加样体积越小(样品浓度高 时)，分辨率越高。但是，当用于样品的制备和脱盐时、 加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积 多少为宜?这要视被分离物在层析柱的分配系数(Kav)或 洗脱体积(Ve)来决定。假设，A、B两个被分离物在层析 柱中的洗脱体积分别为Vea 、Veb，A、B洗脱体积之差 称为分离体积，以Vs表示。则 Vs=Vea—Veb
凝胶层析
原理简单说就是分子量不同通过凝胶柱的速度也不同凝胶是一种具有多孔,网状结构的分子筛.利用这种凝胶分子筛对大小,形状不同的分子进行层析分离,称凝胶层析 .凝胶层析的应用范围:凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质,酶,多肽,激素,多糖,核酸类等物质.分子大小彼此相差25%的样品,只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开.利用凝胶的分子筛特性,可对这些物质的溶液进行脱盐,浓缩,去热源和脱色.凝胶层析的优点凝胶层析具有设备简单,操作方便,分离迅速及不影响分子生物学活性等优点.目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化.-,凝胶层析的基本原理凝胶层析的原理l 分子大小不同混合物上柱; 2 洗脱开始,小分子扩散进人凝胶颗粒内,大分子被排阻于颗粒之外;3 大小分子分开: 4大分子行程较短,已洗脱出层析柱,小分子尚在进行中凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱;反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.而中等大小的分子,它们也能在凝胶颗粒内外分布,部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离.1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
凝胶层析
凝胶层析凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析凝胶种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
各种葡聚糖凝胶的分离范围与用途：Sephadex G-10 葡聚糖凝胶G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-25 葡聚糖凝胶G-25 分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-50 葡聚糖凝胶G-50 分离范围1500-30000Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
凝胶层析名词解释
凝胶层析名词解释
凝胶层析是一种分离和纯化生物分子的技术，它基于分子在凝胶基质中的不同迁移速度。
这种层析技术通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质。
在凝胶层析中，样品通常是通过电泳或重力作用在凝胶基质中移动。
凝胶基质中的孔隙大小可以根据所需分离的分子大小来调整。
较大的分子在凝胶中移动速度较慢，而较小的分子则移动更快。
通过调整凝胶的孔隙大小和运行条件，可以实现对不同大小和电荷的分子进行有效分离。
凝胶层析广泛应用于生物学和生物化学领域，用于分离和纯化蛋白质、核酸和多肽等生物分子。
它可以用于分析样品中的特定分子量组分，研究分子间的相互作用以及纯化目标分子。
凝胶层析的优点包括操作简单、成本低廉和对生物分子的保持较好。
然而，它的分辨率有限，不适用于分离非常相似的分子。
总的来说，凝胶层析是一种常见且有效的分离和纯化生物分子的技术，它在生物学研究和工业应用中具有重要的地位。
凝胶层析
遇水为不溶解的固相 化学惰性物质
离子基团含量少
颗粒大小和网眼均匀
机械强度较强
具有可选择的多种孔径
LOGO
凝胶的种类和性质
Text
葡聚糖凝胶
（Sephadex）
修饰葡聚糖凝胶
（Modified Sephadex） 典 型 其 它
聚丙烯酰胺凝胶
（Bio-Gel P）
多孔玻璃微球
（Bio-glas）
商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺 交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。
特点： 1、通过控制交联剂用量可制成各种 型号凝胶； 2、稳定性好、强度高； 3、保存方便。
LOGO
凝胶的种类和性质
3.琼脂糖凝胶（Sepharose; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)
LOGO
操作步骤
3
样品的加入 吸取样品溶液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品， 注意加样时勿将柱床冲起。 打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用 上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水。
4
洗脱
待样品完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，控制流 速，直至两条区带分开为止。
5
比色测定
绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。
通过SephadexG-50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子 量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同观察血红蛋 白和硫酸铜的洗脱速度。
一．材料 1．仪器 层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量 筒；试管。 2．试剂 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液 二．方法 （一）凝胶的准备。 （二）样品制备 1．血红蛋白(Hb)溶液的制备 取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟 (2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml 蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。 2．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。
凝胶层析.
第七章凝胶层析凝胶层析的别名很多，如分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限制扩散层析等。
它是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析（色谱）方法。
凝胶层析第一节凝胶层析的基本原理第二节凝胶的结构和性质第三节凝胶层析的实验条件和操作第四节色谱峰变宽的问题第五节凝胶层析的应用第一节凝胶层析的基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质（交联聚苯乙烯，多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等）填料的柱中进行的。
柱的总体积为V A，它包括填料的骨架体积V GM，填料的孔体积V i(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。
V A=V1+V0+V GM原理当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。
V e=V0+V i K这里V e是淋出体积，V0是粒间体积，V i K是对某种大小的溶质分子来说可以渗透进去的那部分孔体积，K为分配系数。
平衡排除理论当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。
扩散分离理论溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。
苯乙烯的分子小，扩散速度快，容易在两相之间达到平衡，所以淋出曲线是一个很窄的峰，并且不太受流速的影响。
聚苯乙烯分子大，扩散速度小，在较高流速下两相之间来不及建立平衡，因此淋出曲线变得又宽又斜，淋出曲线呈现出流速依赖性。
流动分离理论多孔填料颗粒，每个孔相当于一个毛细管，管子的排除效应使得有些较大的溶质分子不能进入它，而液体在管子外面的流速大于在管内的流速。
对于那些能够落入管中的较大的分子又由于被流速场集中到管子的中心部分而加快了速度。
较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。
凝胶层析法
型号 G10 G15 G25 G50 G75 G100 ＜700
分离范围 （分子量）
吸水量 （ml/g） 1.0±0.1 1.5±0.2 2.5±0.2 8.0±0.3 7.5±0.5 10.0±1.0
床体积/干凝胶 （ml/mg） 2~3 2.5~3.5 4~6 9~11 12~15 15~20
三．凝胶层析分离的过程
5 ． Ve (elution volume) 洗 脱 容 积 ： Ve=Vo+KdVi 。 自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰） 出现时所流出的容积。 6．Kd：样品组分在两相间的分配系数。 7．Kd: 通过实验可求得。 Ve=V0+Kd•Vi Kd=(Ve-Vo)/Vi
二．样品 积 为 柱 床 体 积 的 1~4%； 制备分离时，样品体积为柱床体积的 25~30%。 2. 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2） 当样品体积≥Vsep时，两个相邻组分不能 完全分离。
三．操作压的影响
1．洗脱时维持流速的恒定。 2．用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。
分子量的测定和计算
一般都采用标准曲线法。只要测得几种标 准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的 相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一 直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中 确定它的相对分子质量。
凝胶层析法
第一节：引言
一．凝胶层析(Gel chromatography)
凝胶层析也称： 排阻层析(ellusion chromatography)、 凝胶过滤(gel filtration)、 分子筛层析(moleculer chromatography)。
凝胶层析中常用凝胶的类型 （4种主要类型）
二．凝胶的类型
第四节：凝胶层析的实验技术
凝胶层析简介
凝胶层析凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。
是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。
一、基本原理当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。
而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。
样品中各组分的流出顺序，可用分配系统Ka来量度：Ka=(Ve-V o)/V i式中Ve：为洗脱体积(elution volume)，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；V o：外体积(outer volume)，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积；Vi：内体积(inner volume)，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。
当某组分的Ka=0时(即Ve=V o)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出；若某组分的Ka=1(即Ve=V o+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出；Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。
当洗脱液的体积等于V o+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。
然而在某种情况下Ka值会大于1。
这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。
对于同一类型的化合物而言，组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)的关系可用下式表示：Ve=K1- K2lgMr式中K1，K2为常数。
若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。
凝胶层析
• 6．洗脱与收集 • 为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及 重复性下降，整个洗脱过程中始终保持一定 的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜 过快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变， 以防凝胶颗粒的胀缩引起柱床体积变化或流 速改变。在许多情况下可用水作洗脱剂，但 为了防止非特异性吸附，避免一些蛋白质在 纯水中难以溶解以及蛋白质稳定性等问题的 发生，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。洗脱用 盐等介质应该比较容易除去，通常氨水、乙 酸、甲酸铵等容易挥发的物质用得较多。对 一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂 的混合物进行洗脱。
（2）分辫率
介质粒径较小的凝胶通常可以提供比
较高的分辨率，因为分子弥散作用较弱，因而层析
的谱带宽作用也小。然而，小颗粒会带来高阻抗， 因此在使用刚性较差的介质时必须使用较低的流速， 这与大规模制备层析所要求的高效性相悖。所以工 业应用的凝胶过滤层析必须使用刚性较好、粒径较
大的介质。
（3）稳定性 由于原料种类千变万化、其pH、温 度以及有无有机溶剂等因素是否影响介质的分离特
三、操作方法
1.凝胶的选择 选择合适的凝胶过滤介质应从分离目的和需要 分离物质的分子大小两个方面进行考虑。 （1）分离范围 如果需要将一个复杂原料中所 有相对分子质量较大（如大于5000)的物质与5 000 以下的物质分开，可以装填排阻极限小的介质，如 Sephadex G-25或Sephadex G-50等凝胶。该工艺也 称为脱盐或成组分离。如果需要分离相对分子质量 相差不大的分子，可根据各种凝胶的排阻范围加以 选择。
• 3、层析柱的选择
• 层析柱的长度与直径的比一般称为柱 比。层析柱的有效体积（凝胶柱床的 体积）与柱比的选择必须根据样品的 数量、性质以及分离目的加以确定。 • 对于相对分子质量差别大的混合物的 分离，柱床体积为样品溶液体积的5倍 或略多一些就够了，柱比为5：1到10： 1即可。这样流速快，节省时间样品稀 释程度也小。
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凝胶层析简介凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。
1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。
随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
层析过程如图11 所示。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
凝胶层析的基本概念1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积如图3－6 所示，外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。
内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。
基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。
而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。
我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：Vt＝Vo＋Vi设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。
有时可能会出现Ve > Vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。
凝胶层析中的几种洗脱峰如图3－7 所示：柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。
外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。
因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。
2. 分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。
在凝胶层析中，分配系数通常表示为：Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)前面介绍了Vt和Vo都是可以测定的，所以测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。
对于一定的层析条件，Vt和Vo都是恒定的，大分子先被洗脱出来，Ve值小，Kav 值也小。
而小分子后被洗脱出来，Ve值大，Kav值也大。
对于完全排阻的大分子，Ve＝Vo，故Kav＝0。
而对于完全渗透的大分子，Ve＝Vt，故Kav＝1。
一般Kav值在0－1之间，如Kav值大于1，则表示这种物质与凝胶有吸附作用。
对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系：Kav＝－blg MW＋c其中b、c为常数，MW表示物质的分子量。
另外由于Ve和Kav也成线性关系，所以同样有：Ve＝－b'lg MW＋c'其中b'、c'为常数。
这样我们通过将一些已知分子量的标准物质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。
这就是凝胶层析测定分子量的基本原理，这种方法在后面的应用中还将详细介绍。
3. 排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。
所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。
4. 分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。
5. 吸水率和床体积吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。
所以它不能表示凝胶装柱后的体积。
而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。
6. 凝胶颗粒大小层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（mm）来表示。
柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。
颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。
一般比较常用的是100－200目。
凝胶的种类和性质凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶（dextran）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（agarose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。
另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。
下面将分别介绍。
1. 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是指由天然高分子－葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。
葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。
常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。
Sephadex 的主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）乘以10。
如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。
Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。
数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。
Sephadex中排阻极限最大的G-200为6′105。
Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。
Sephadex稳定工作的pH一般为为2－10。
强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。
Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 °C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。
Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。
但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。
所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。
Sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。
要根据分离要求来选择颗粒大小。
Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。
另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N, N'-methylenebisacrylamide）交联而成。
是一种比较新型的葡聚糖凝胶。
Sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。
所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。
Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl稳定工作的pH一般为3~11。
另外Sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。
2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。
改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。
聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad Laboratories生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 ~ Bio-Gel P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。
各种型号的主要参数如附表所示。
聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。
排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4′105。
聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。