蛋白表达纯化毕生精华

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

蛋白的纯化

第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。

表达蛋白的分离与纯化

表达蛋白的分离与纯化 大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。 一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白） （一）试剂准备 采用T7· Tag Affinity Purification Kit 1．T7·Tag抗体琼脂。 2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3.

0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。 4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。 5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。 1.PEG 20000。 （二）操作步骤 1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。 2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。 3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。 4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。 5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。 6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。 7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。 8.用PEG 20000浓缩蛋白。 （三）注意事项 蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。 二、包涵体的纯化

微机模拟蛋白质纯化实验

微机模拟蛋白质纯化实验 学号：1025004555 姓名：王圣强专业：生物工程 一、实验目的： 1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。 2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。 二、实验原理： “Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。 在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。 三、实验步骤： 实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品： 1. pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶） 2. 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶） 3. 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 36号酶） 1.pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶） 1号酶在50度下稳定，稳定范围2-11(稳定范围较大)

基础生化实验-蛋白质纯化

蛋白质纯化

一、目的: 利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。 二、原理: 由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱 (Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。 三、试剂与器材: 1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl Ph7) ?细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性 2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 上课补充: ?蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。

四、仪器与设备: FPLC(速液相色谱仪) 五、步骤: 1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。 2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。 3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。 4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以 FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之 曲 线图。 上课补充: ?胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。 ?线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲 洗掉，剩下胶体溶液。 ?其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来 洗涤蛋白质。(可详见问题一及补充资料2) 六、问题:

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。

微机模拟蛋白质纯化实验

微机模拟蛋白质纯化实验 学号： 1035130150 ：睿 班级：生命科学学院 10级生物工程 ： 1059508633qq. 一、实验目的： 1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein 软件提纯蛋白质的方法。 2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法 的原理和应用。 二、实验原理： 1：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度围和pH稳定围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。 2：“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性； ②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析； ⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。 3：在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变

性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。 4：“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 三、实验要求： 完成实验软件中三种酶的分离纯化。 四、实验步骤： 实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品： 1. pH稳定围较大的1号蛋白 2. 碱性条件下稳定的36号蛋白 3. 酸性条件下稳定的3号蛋白 1：酸性条件下稳定的3号蛋白 3号酶在62℃以下稳定，稳定pH围3.8～5.8（酸性条件）。

蛋白质分离纯化技术实验讲义教材

实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法） 一、实验目的 1、制作蛋白质浓度标准曲线； 2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线讣算出蛋白质的浓度。 二、实验原理 Bradford法（考马斯亮蓝法）测左蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250 （CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm:当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的泄量测左。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下lh内保持稳泄。 Bradford法的突出优点是：灵敏度髙：测左快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测左，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100. SDS 和 0.1N 的 NaOH9 三、试剂与器材 1、试剂： lmg/ml牛血淸蛋白（BSA）母液:考马斯亮蓝G-250；无水乙醇：85%磷酸；MiliQ水。 2、器材： 滤纸；烧杯；漏斗：可见分光光度计：试管。 四、实验方法 1、考马斯亮蓝G-25O染料的配宜 称100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于47.5 ml无水乙醇后,再加入100 ml 85%的磷酸，加 MiliQ水泄容至1L,过滤备用。 2、标准蛋白溶液的稀释 取10支试管，按表中顺序排列，分別加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。 每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的编号为8、9、10号管。 3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测泄各样品在595nm处的吸光值 OD595o 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 4、标准曲线制作 以标准蛋白的量（mg）为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作图，即得一条标准曲线。由此标准曲线，求得趋势线以及公式（y=ax+b,其中y为吸光度值OD595, x为蛋白质的量，a和b为常量）并给出疋值，R?值越接近1证明曲线越接近实际结果，根据此公式及未知样品的吸光度值，计算每管中加入的未知蛋白的量，进而推算其浓度。 5、本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶分离纯化实验所得的粗酶液样品。

蛋白表达纯化流程

第一章蛋白表达纯化 一、诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB 平板上培养过夜; 2) 分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜; 3) 按1%接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养2-3小时; 4) 加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。 二、蛋白纯化 2.1重组蛋白的提取 2.1.1 提取缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH8.0) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6融合蛋白时可以加入5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非特异性吸附。 2.1.2 方法 1)发酵液离心收集菌体(at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2)弃去上清液，加入适当的20 mM Tris-HCl (pH8.0)，重悬； 3)离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。 4)每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。 5)冰浴中超声裂解菌体(超声2秒，停止6秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳分 析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。 6)离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 7)小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。

蛋白体外表达与纯化

蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一：原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三：哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。 在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。 本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。 实验方法与步骤： 一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期

蛋白质的表达、分离、纯化实验.doc

蛋白质的表达、分离、纯化实验 蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 实验方法原理 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 实验材料：大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer Elution Buffer IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠 仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒 实验步骤 一、试剂准备 1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。 3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。 4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。 5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。 6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 二、获得目的基因 1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

蛋白表达、分离和纯化

蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材

一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.

蛋白质分离与纯化教学设计

蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的内容。本节课的主要内容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点

【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。

微机模拟蛋白质纯化实验报告

微机模拟蛋白质纯化实验 一、实验目的： 1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。 2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。 二、实验原理： “Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。 “Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。 在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排层层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。 “Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。 1 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶） 3号酶在62℃以下稳定，稳定pH范围3.8～5.8（酸性条件）。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、 Bl21 codon（DE3）等。 7、蛋白的诱导表达。 1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。 4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达，则扩大摇菌。 1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约 2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。 4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

表达蛋白质纯化实验参考手册

蛋 蛋白 白质 质纯 纯化 化实 实验 验室 实 实验 验手 手册 册 2007年 10月

第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达 一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上 （一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件 1. PCR 引物设计的基本原则 （1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 15-20。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量 宜在 45-55%左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。 （5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。 2. PCR 反应组分和条件 PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有： 10×Reaction buffer，5 μl 2 个引物，各 12.5-25 pmol (终浓度各 0.25-0.50 μmol/L) 4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L 模板 DNA，100 ng左右 Taq DNA 聚合酶，2.5-3 U PCR 反应条件一般为： （1）94℃，5分钟 （2）94℃变性 30-60 秒 （3）50-55℃退火 30-60秒 （4）70-72℃延伸 30-60秒 ℃ -10分钟 （5）725 共进行 25-35次循环。循环是步骤（2）和（4） (二) 质粒 DNA的小量制备

1、传统方法 （1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。 （2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集 菌体。 （3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖 紧管口，快速颠倒离心管 6-7次，然后，冰浴 5 分钟。 （4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 5-6次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。 （5）12,000 rpm 离心 10分钟后，小心吸取上清至另一 EP管中。 （6）加 2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5分钟。 （7）12,000 rpm离心 5分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA沉淀。DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。 2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA纯化方法-离心方案（适用于产品 A1330， A1340，A1460及 A1470） （1）12,000 rpm离心 1分钟，以沉淀 1-10 ml过夜培养物。 （2）用 250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。 （3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 5-6 次混合。 （4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 5-6次混合，室温放置 5分钟。 （5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 5-6 次混合。 （6）室温，最高转速离心 10分钟，回收上清。 （7）将离心柱插入收集管中。 （8）将上清倒入离心柱中。 （9）室温，最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。 （10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将 离心柱重新插入收集管中。 （11）重复步骤（10）（用 250μl Wash Solution）。 （12）室温，最高转速离心 2分钟。 （13）将离心柱插入一个无菌的 1.5 ml微量离心管中。 （14）在离心柱中加 50-100μl Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心 1分钟。

EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)

三、凝胶滞留试验（EMSA） 凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。 （一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化 以GST标签为例。 裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM Na EDTA、1mM DTT和 2 1×Complete Protease InhibitorCocktail。 洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。 EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na 2 Protease InhibitorCocktail。 1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。 2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。 3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。 4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心1 5 min，收集菌体并称重。 5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。 6 超声波破碎30 s（破碎10 s停10 s）。 7 4℃、12000×g离心30 min，上清液用0.45μm滤膜过滤，向滤液中加入5 M NaCl，使NaCl的浓度为200 mM。 8 去掉Glutathione Sepharose 4 Fast Flow中的储存液，用5倍树脂体积