蛋白表达纯化毕生精华

同两块胶才会比较一致。
2） 跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、 W7、W8、W9、E1、E2、MES
3） 300V 快速压胶 5min 左右，160V 分离样品 50min 左右。（也可以 300V,30min，只是 图没有 160V 好看。）
4） 考马斯亮蓝染色。一般染色 2h 即可。 5） 脱色。先用脱色剂 1 脱 15min，再用脱色剂 2 脱过夜。 14、 纯化上清---收集目的蛋白 1) 将重生的镍柱再次平衡（即加 Equilibration Buffer 3ml）。 2) 重复步骤 12 中的操作，只是 wash 时只用步骤 12 中摸好的咪唑浓度洗。 15、 跑胶验证。同步骤 13 这次胶图要跑的漂亮一点（用 160V），保存好。 16、 透析。 1） 配制 2L 透析液（配方见附件 1），并放于-20 度冰箱预冷但不要结冰。 2） 透析袋（剪 10cm 即可）用透析袋处理液煮沸 10min，用 MILIQ H2O 充分洗净。 3） 用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其
试剂名称
NaH2PO4-2H2O
Na2HPO4-12H2O
用量（g）1L
0．5928
5.802192
NaCl 17.532
2) Equilibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.4
3) Wash Buffer（清洗缓冲液）: PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 pH 7.4
3） 分别加 20mM、40mM、60mM、80 mM 的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别 的上样量为 4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面 1ml 和后面 1ml 分别 收集入 EP 管中，以备跑胶。 注意：理论上是要将收集的溶液测量 280nm 处的吸光度，直到吸光度为零时再进行 下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗
的活性而异，也可过夜摇菌。 2） 将上一步中的 8ml 加入 300ml 培养基中 37 度，250rpm 摇至 OD= 1.0 左右（约
2.5h~3h），然后加 IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当 的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底 晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。 3） 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速 140rpm 左右。 4） 将菌液 6000rpm，4min，4 度 离心收集菌体。加入 20mM PBS，洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每 250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用 4 支 50ml 的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、 超声波裂解。 1） 用 6mm 变幅杆，35%功率，3.5s 工作，7s 休息，50min 即可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部， 尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后 面 3000 转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作 30 分 min 要休 息 5min（即关闭总电源开关）。 注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂 （PMSF），PMSF 工作浓度为 1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解
透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估
计的蛋白量留 1-2ml 体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶 液分装后-20 度保存。 18、 超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去 16、17 两步。 1） 将 4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。 2） 配平。 3） 7400g，30min，4°离心，结束时 4ml 变为 1ml 左右。浓缩 4 倍。可根据需要选择 不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的 Elution 液一起浓缩。 4） 加入需要的蛋白储存液至 4ml，离心。重复操作可以使 Elution 液逐渐换为所需的蛋 白储存液。蛋白储存液一般用 20mM PBS+*mM NaCl 或适当浓度和 pH 的 tris-HCl 溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。 5） 收集。将溶液从超滤管中收集到 EP 管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白 浓度（测量后），制备日期。
中，置入提前预冷的 500ml 透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力 搅拌 20min 后置入 4°冰箱 1.5h 后换液。透析 3 次即可。 注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的 2L 大烧杯中。冰浴以防活性降低。
17、 浓缩。 1） 将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇 2000 固体包埋。 2） 30min 后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。 3） 每隔 10min 观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。 4） 透析袋用完后，洗净，保存于 20%乙醇中 4°存放。 注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，
4) Elution Buffer（洗脱缓冲液）: PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.4
5) MES （ 再 生 缓 冲 液 ） : 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodium
chloride; pH 5.0。即 0.3904g MES+0.5844g NaCl.
Bl21 codon（DE3）等。 7、 蛋白的诱导表达。
1） 将表达菌株在 3ml LB 培养基中摇至 OD=0.6 左右，加入 IPTG，浓度梯度从 25μM 到 1m M。37 度诱导过夜(一般 3h 以上即有大量表达)。
2） SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的 50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。
注意：所有溶液使用前都要确定其 pH 是否正确，pH 对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所 用溶液 MES 的 ph=5.0，其余 Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。 13、 跑胶验证。 1） 跑 2 块 0.75mm 的 PAGE 胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相
2. 诱导完成后，用 2ml EP 管 6000rpm，2min，4 度，收集 10ml 菌液。1.5mlPBS (50m M PBS,300m M NaCl )重悬细菌。
3. 裂解细胞。 用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般 15 到 30min。裂解 3s，停止 6s， 裂解时冰上放置。
4. 分离上清。5000rpm，4min，4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm， 10min，4 度。取上清于新的 1.5mlEP 管中。取其中的 20 微升于 200 微的 EP 管中，加 5 微 5*SDS loading buffer 混匀，煮沸 10min。
试剂溶解，取两个 50ml 和一个 150ml 分别加到两个 100ml 瓶子和一个 500ml 瓶子中，作为 Wash Buffer、Elution Buffer 和 Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的 8M 咪唑。 最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer 各配了 100ml，Equilibration Buffer 配了 300ml。 PBS 配了 500ml。
6) 透析袋处理液： 2%（w/v）碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA
7) 透析液：20mM PBS+50 mM NaCl（2.92g）
试剂名称
NaH2PO4-2H2O
Na2HPO4-12H2O
NaCl
用量（g）1L
0．5928
5.802192
2.92g
TIPS:1—4 的溶液可以一起配制。先配 10ml 8M 的咪唑。再配 1L 的 PBS，用 500ml 水将
注：超滤管的使用方法见附件 4 19、 蛋白浓度测定。见附件 3 20、 蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。 21、 抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。 22、 注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。 23、 收集免疫血清。提取抗体。 24、 抗体效价评定。 附件 1 所需溶液配方：
1) 20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4
3） 将有表达的菌株 10%甘油保种，保存 1ml 左右就足够了，并记录 IPTG 浓度范围。 甘油是用 0.22μm 过滤除菌的，储存浓度一般是 30%-60%，使用时自己计算用量。
4） 用上述 IPTG 浓度范围的最低值诱导 10ml 表达菌，18 度，低转速（140-180rpm）， 诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加 IPTG 之前的培养基中加入 1%的葡 萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成 50μl 一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、 包涵体检测。方案见 附件 2 9、 如有上清表达，则扩大摇菌。 1） 取保种的表达菌株先摇 10ml，37 度，300rpm 摇至 OD>=1.5，约 5h 左右，视菌种来自附件 2包涵体检测