生物大分子分离纯化技术
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生物体液中许多成分保存在室温或4℃下时，由于 沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发 生变化。对于血清样品，若对其中的钠或血清白蛋白 进行分析，当样品保存在-20℃时，20天内不会发生 明显的变化。有些成分在保存期间确实可以发生明显 的变化，如儿茶酚胺，因此必须保存于－20或－70℃ 下，必要时可以加一些抗氧化剂或酶抑制剂。让血浆 或血清与红血球接触时，由于酶活性的改变成被分析 对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。 所以、一般要快速分离成单一的相。
3
2.1.1 样品的类型、采集及保存
样品的类型 生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于
动物或人体的每一个部位。它们可以是内源性的 化合物或外源性的化合物。样品的基质可以是简 单的血样、尿样，也可以是比较复杂的粪便以至 整个组织。这些基质非常复杂，常常由多相组成， 如血浆和血细胞及多种分子量大小不同的化合物。 被分析对象的稳定性也变化极大，有只能稳定存 在几分钟、对蛋白酶极为敏感的肽类，也有几乎 是完全稳定的药物的代谢物。
生理样品中酶的绝对浓度的测定从原理上讲是很简 单的，分析时的主要问题是纯的酶标样的获得。
13
酶在天然界中总是存在于很复杂的混合物中， 通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解 和分析一个复杂生理样品，如亚细胞器、细胞或整 个组织中的酶，就必须将酶放在一个尽可能简单的 体系中进行研究。通过对单一酶的研究可以获得酶 对哪些底物具有特异性、反应的动力学参数及酶作 用方式。所有这些数据对于研究酶在复杂体系中的 功能是非常重要的。在许多医学及工业应用方 面．是否具有纯的酶制剂非常关键。
4
Hale Waihona Puke Baidu
样品的采集 对于给定的样品。采集处理速度与样品的代谢
活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。
尿液中各种样品的浓度一般认为可稳定几小时。 组织样品一般需要快速冷冻以防止发生变化，采 样者应该有相应的样品采集及保存的设备。
5
1. 血样 成人平均含6L的血液、其中约55％的血浆和
45％的细胞。血样的采集一般采取清晨空腹采 血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的 影响。动物一般采取禁食12～16h后采血，一 般生化检验所需的血液标本采取静脉抽血。
生化及临床分析样品的预处理。 生物样品的常规分离纯化方法，如透析、微 过滤、冷冻干燥及离心技术； 生物大分子的电泳分离纯化技术； 生物大分子的色谱分离纯化技术；
2
2.1 生化分析样品的准备与预处理
生化样品极其复杂，首先应对所关心的待测物 处于生物体的哪一个部位所获得原始的样品，并 对实际分析之前应进行怎样的处理必须有所了解。
载体蛋白选择条件： 1. 与酶之间无相互作用； 2. 分子量与酶的分子量差至少1~2倍，以便必要时
可以很方便地用排阻色谱将二者分离。
18
一些特殊的反应会使催化活性部位的活性丧 失一些。在纯化过程中一些辅助因子的失去会使 酶的活性丧失，为此可以在纯化缓冲液中加入辅 助因子。
催化活性部位氨基酸残基的共价化学修饰很 常见，最易被修饰的氨基酸为半胱氨酸。
14
酶活性的保持 要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必须对
酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活 性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗 各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护 环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏 感，细胞膜酶对溶解尤其敏感。
15
可溶性蛋白质不论是存在于细胞质的还是细胞 器内的，其蛋白质浓度从100 mg/ml 到高达400 mg/ml (线粒体基质内)。体系中存在各种天然的还 原剂(如谷胱甘肽)使蛋白质保持高的还原电位。其 它稳定剂也存在，如不同的底物及产物。在蛋白 质纯化过程中组织被破坏，蛋白质从它们的保护 环境中释放出来．被限制在不同部位的蛋白水解 酶也同时被释放出来。所以要对所关心的酶进行 保护，以防止其被氧化、水解或不可逆变性。
6
血样有全血、血浆和血清之分。
7
2．组织样品 组织样品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或肠。这
类组织是代谢活性的，因此采样后几秒之内要在液 氮中或其它冷却剂中冷冻。
液氮
8
样品的保存 一般来说，任何生物样品采集后都应立即进行分
析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样品也 许需要运送到实验室，也许完成一个研究需要所有 的样品同时测定。任何在法律上有效的分析必须注 明保存日期及保存条件等。
生化物质分离的特殊性：
要求：分离方法简便，选择性好，效率高，保持 生化物质的分子结构和构型，分离方法尽量不影 响生化物质的生物活性。
由于生化物质一般都很脆弱，易受化学、物理因 素影响而变性，因而分离过程常要求在低温、洁 净、温和的条件下进行。
本章所提到的生物大分子主要是指蛋白质、酶 及核酸。
1
本章主要的内容包括：
16
通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的 使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应 控制在6-8之间，并保持合适的离子强度使其可以 防止酶变性。将纯化过程的温度降低至15-25℃可 以使许多降解过程减慢3-5倍。
17
酶在稀溶液中由于对器皿壁或色谱填料的吸 附会引起变性。吸附使酶的四级结构解离而失 去活性，这种变性可以通过加入载体蛋白来阻 止。比较常用的载体蛋白有牛血清白蛋白，或 商品化的结构简单、分子量已知的合成蛋白。
R-SH+R-SH→R-S-S-R
19
对巯基氧化的防止： 1. EDTA络合金属离子(非金属酶) 2. 加入含巯基试剂，如巯基乙醇、2,3-二巯基丙醇、
巯基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等
20
对蛋白质酶解的防止：
蛋白水解酶来自活细胞的内部，哺乳动物将其 包装在溶酶体中，而在微生物中．它们则存在于 质膜和细胞壁之间。在用细胞匀浆法制备酶提取 物时会发生蛋白水解酶的释放，所以对其活性要 进行抑制。根据蛋白水解酶的类型可以选用不同 的抑制剂。
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样品的初步处理
尽管许多化合物在全血浆中更为稳定，但另一 些，如氨基酸则应保存在不含蛋白质的溶液中。 许多样品分析之前都要求除去蛋白质，用于去除 蛋白质的各种沉淀方法的比较见表：
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常用蛋白质沉淀方法的比较
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2.1.2 酶样品的准备
酶是一种具有催化活性的蛋白质，它的催化活性 是其特征参数。任何分离纯化步骤都应考虑酶的生物 活性的保持问题。
生物体液中许多成分保存在室温或4℃下时，由于 沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发 生变化。对于血清样品，若对其中的钠或血清白蛋白 进行分析，当样品保存在-20℃时，20天内不会发生 明显的变化。有些成分在保存期间确实可以发生明显 的变化，如儿茶酚胺，因此必须保存于－20或－70℃ 下，必要时可以加一些抗氧化剂或酶抑制剂。让血浆 或血清与红血球接触时，由于酶活性的改变成被分析 对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。 所以、一般要快速分离成单一的相。
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2.1.1 样品的类型、采集及保存
样品的类型 生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于
动物或人体的每一个部位。它们可以是内源性的 化合物或外源性的化合物。样品的基质可以是简 单的血样、尿样，也可以是比较复杂的粪便以至 整个组织。这些基质非常复杂，常常由多相组成， 如血浆和血细胞及多种分子量大小不同的化合物。 被分析对象的稳定性也变化极大，有只能稳定存 在几分钟、对蛋白酶极为敏感的肽类，也有几乎 是完全稳定的药物的代谢物。
生理样品中酶的绝对浓度的测定从原理上讲是很简 单的，分析时的主要问题是纯的酶标样的获得。
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酶在天然界中总是存在于很复杂的混合物中， 通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解 和分析一个复杂生理样品，如亚细胞器、细胞或整 个组织中的酶，就必须将酶放在一个尽可能简单的 体系中进行研究。通过对单一酶的研究可以获得酶 对哪些底物具有特异性、反应的动力学参数及酶作 用方式。所有这些数据对于研究酶在复杂体系中的 功能是非常重要的。在许多医学及工业应用方 面．是否具有纯的酶制剂非常关键。
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Hale Waihona Puke Baidu
样品的采集 对于给定的样品。采集处理速度与样品的代谢
活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。
尿液中各种样品的浓度一般认为可稳定几小时。 组织样品一般需要快速冷冻以防止发生变化，采 样者应该有相应的样品采集及保存的设备。
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1. 血样 成人平均含6L的血液、其中约55％的血浆和
45％的细胞。血样的采集一般采取清晨空腹采 血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的 影响。动物一般采取禁食12～16h后采血，一 般生化检验所需的血液标本采取静脉抽血。
生化及临床分析样品的预处理。 生物样品的常规分离纯化方法，如透析、微 过滤、冷冻干燥及离心技术； 生物大分子的电泳分离纯化技术； 生物大分子的色谱分离纯化技术；
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2.1 生化分析样品的准备与预处理
生化样品极其复杂，首先应对所关心的待测物 处于生物体的哪一个部位所获得原始的样品，并 对实际分析之前应进行怎样的处理必须有所了解。
载体蛋白选择条件： 1. 与酶之间无相互作用； 2. 分子量与酶的分子量差至少1~2倍，以便必要时
可以很方便地用排阻色谱将二者分离。
18
一些特殊的反应会使催化活性部位的活性丧 失一些。在纯化过程中一些辅助因子的失去会使 酶的活性丧失，为此可以在纯化缓冲液中加入辅 助因子。
催化活性部位氨基酸残基的共价化学修饰很 常见，最易被修饰的氨基酸为半胱氨酸。
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酶活性的保持 要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必须对
酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活 性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗 各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护 环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏 感，细胞膜酶对溶解尤其敏感。
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可溶性蛋白质不论是存在于细胞质的还是细胞 器内的，其蛋白质浓度从100 mg/ml 到高达400 mg/ml (线粒体基质内)。体系中存在各种天然的还 原剂(如谷胱甘肽)使蛋白质保持高的还原电位。其 它稳定剂也存在，如不同的底物及产物。在蛋白 质纯化过程中组织被破坏，蛋白质从它们的保护 环境中释放出来．被限制在不同部位的蛋白水解 酶也同时被释放出来。所以要对所关心的酶进行 保护，以防止其被氧化、水解或不可逆变性。
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血样有全血、血浆和血清之分。
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2．组织样品 组织样品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或肠。这
类组织是代谢活性的，因此采样后几秒之内要在液 氮中或其它冷却剂中冷冻。
液氮
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样品的保存 一般来说，任何生物样品采集后都应立即进行分
析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样品也 许需要运送到实验室，也许完成一个研究需要所有 的样品同时测定。任何在法律上有效的分析必须注 明保存日期及保存条件等。
生化物质分离的特殊性：
要求：分离方法简便，选择性好，效率高，保持 生化物质的分子结构和构型，分离方法尽量不影 响生化物质的生物活性。
由于生化物质一般都很脆弱，易受化学、物理因 素影响而变性，因而分离过程常要求在低温、洁 净、温和的条件下进行。
本章所提到的生物大分子主要是指蛋白质、酶 及核酸。
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本章主要的内容包括：
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通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的 使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应 控制在6-8之间，并保持合适的离子强度使其可以 防止酶变性。将纯化过程的温度降低至15-25℃可 以使许多降解过程减慢3-5倍。
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酶在稀溶液中由于对器皿壁或色谱填料的吸 附会引起变性。吸附使酶的四级结构解离而失 去活性，这种变性可以通过加入载体蛋白来阻 止。比较常用的载体蛋白有牛血清白蛋白，或 商品化的结构简单、分子量已知的合成蛋白。
R-SH+R-SH→R-S-S-R
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对巯基氧化的防止： 1. EDTA络合金属离子(非金属酶) 2. 加入含巯基试剂，如巯基乙醇、2,3-二巯基丙醇、
巯基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等
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对蛋白质酶解的防止：
蛋白水解酶来自活细胞的内部，哺乳动物将其 包装在溶酶体中，而在微生物中．它们则存在于 质膜和细胞壁之间。在用细胞匀浆法制备酶提取 物时会发生蛋白水解酶的释放，所以对其活性要 进行抑制。根据蛋白水解酶的类型可以选用不同 的抑制剂。
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样品的初步处理
尽管许多化合物在全血浆中更为稳定，但另一 些，如氨基酸则应保存在不含蛋白质的溶液中。 许多样品分析之前都要求除去蛋白质，用于去除 蛋白质的各种沉淀方法的比较见表：
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常用蛋白质沉淀方法的比较
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2.1.2 酶样品的准备
酶是一种具有催化活性的蛋白质，它的催化活性 是其特征参数。任何分离纯化步骤都应考虑酶的生物 活性的保持问题。