中国药典2015版微生物检测所用菌种和培养基
2015版中国药典微生物检验
• 注:方法选择原则:根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂:金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤:金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法:计数方法同平皿计数法,每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数;若滤膜上无菌落生长,以﹤1报告 菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ),或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法:记录每一稀释级微生物生长的管 数,从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式:按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件:胰酪大豆胨琼脂平板在30~ 35℃培养3-5天,沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ~25℃培养5~7天;MPN法和供试品接种, 所有试验管在30~35℃培养3~5天。
2015版中国药典微生物限度解析
(MPN法) 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验:菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查:检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则:
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时,应按规定进行检 验,包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外,本法不适用于活菌制剂的检查。
30~35 ℃ 不超过3天
20~25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿;接种量50~100cfu ; 同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定:
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %,且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版:方法验证】, 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时, 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法(MPN 法)
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照1.无菌检查法1.1变更内容1.1.1无菌检查方面,使用胰酪胨大豆肉汤(胰酪胨大豆液体培养基/大豆酪蛋白肉汤培养基)取代改良马丁培养基与硫乙醇酸盐流体培养基配合进行细菌和真菌的全面微生物检测。
1.1.2菌液制备环节,使用胰酪胨大豆肉汤、胰酪胨大豆琼脂取代营养肉汤、营养琼脂进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的菌液制备。
1.1.3菌液制备环节,使用沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基取代改良马丁培养基、改良马丁琼脂进行白色念珠菌和黑曲霉菌液的制备,同时对沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂的配方进行了变更。
1.1.4适用性试验中,胰酪胨大豆肉汤使用枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉进行灵敏度检查;硫乙醇酸盐流体培养基使用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌进行灵敏度检查。
1.2培养基信息2010版2015版无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——改良马丁培养基菌液制备——改良马丁琼脂培养基菌液制备——营养肉汤菌液制备——营养琼脂无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——胰酪胨大豆肉汤菌液制备——胰酪胨大豆琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖肉汤无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基供试品制备——pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液1.3参考文件(国家药典委员会—中国药典2015版附录征求意见稿—1101无菌检查法)http://w w /cms/new scenter/new s/000603.html2.非无菌产品微生物限度检查2.1变更内容2.1.1供试品制备环节,除了pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH7.6磷酸盐缓冲液外,添加了pH7.2磷酸盐缓冲液和胰酪胨大豆肉汤。
2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨
2015年版《中国药典》微生物限度检查法洁净环境及计数培养基修订分析探讨2015年版《中国药典》将于2015年7月起开始实施:该版药典对微生物限度检查法检查时的洁净环境、培养基及检查方法进行了修订。
其中洁净环境要求由10000级背景下的100级单向流(2010年版)修订为受控背景下的不低于B 级环境(2015年版);计数培养基由营养琼脂/玫瑰红钠琼脂培养基(2010年版)修订为胰酪大豆琼脂培养基/沙氏葡萄糖琼脂培养基(2015年版)。
该文旨在分析2015年版中国药典与2010年版中国药典在非无菌产品微生物限度检查时洁净环境与计数培养基的异同点,为更规范执行2015年版中国药典提供参考。
标签:中国药典;2015年版;2010年版;洁净环境;培养基[Abstract] The Chinese Pharmacopoeia (2015 edition)will be implemented in July,2015 which have revised in some part,including clean environment and medium in microbial limit test. The clean environment was rectified from 10000 background plus 100 degree to control background plus A or B environment. The counting medium was changed from nutrient medium and rose bengal agar to trypticase soy agar (TSA)medium and sabouraud dextrose agar medium. In this part,we analyzed the differences of the clean environment and counting medium between 2010 and 2015 edition Chinese Pharmacopoeia for normative enforcement.[Key words] Chinese Pharmacopoeia;2010 edition;2015 edition;Clean environment;Medium微生物限度检查是用于检查非无菌制剂及其原料、辅料等是否符合规定的方法[1-2]。
抑菌效力检查法-2015中国药典
抑菌效力检查法-2015中国药典录入时间:2014-9-16 9:44:02 来源:国家药典委员会抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质,有时也称防腐剂。
抑菌效力检查法系用于测定灭菌及非灭菌制剂的抑菌活性,以评价最终产品的抑菌效力,同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌效力,那么应根据制剂特性(如水溶性制剂)添加适宜的抑菌剂,以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物变质而对使用者造成危害,尤其是多剂量包装的制剂。
在药品生产过程中,抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP 管理,不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径,也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
所有抑菌剂都具有一定的毒性,制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。
同时,为保证用药安全,成品制剂中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。
抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而变化,因此,应验证成品制剂中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低.本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂培养基培养基的制备胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基?? 照无菌检查法(通则1101)制备。
培养基的适用性检查抑菌效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查,包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5 代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
培养基适用性检查的菌种及新鲜菌体培养见表1。
菌液制备取表1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。
取表2 黑曲霉的新鲜培养物加入3~5ml 含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品, 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液,或 pH7.2 磷酸盐缓冲液,或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品,可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80,使供 试品分散均匀。若需要,调节供试液 pH 值至 6~8。必要时,用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法(MPN 法)
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml
或cm²)。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数(包括真菌菌落数);
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数(包括细菌菌落数)。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求,可 使用含抗生素(如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基(如玫瑰红 钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外,取规定量供试品,按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定,每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30~35℃培养3~5天,沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20~25℃培养5 ~7天, 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数,必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15, 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
《中国药典》2015年版微生物基本知识
供试品检查部分-计数标准
2010版
无规定
2015版
增加: 各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下: 101cfu为可接受的最大限度为20; 102cfu为可接受的最大限度为200; 103cfu为可接受的最大限度为2000;以此类推。 若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符 合该品种项下的规定,判供试品符合规定;若其中任何一项不 符合该品种项下的规定,判供试品不符合规定。
不含中和剂及灭活剂的相应稀释液 替代供试液,按试验组操作。 中和剂、灭活剂及表面活性剂的稀 释液中加入规定量菌液
接种和稀释
消除供试品的抑菌活性的方法
(1)增加稀释剂和培养基的用量; (2)加入中和剂或灭活剂; (3)采用薄膜过滤法和冲洗; (4)综合上述措施。
●根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响
2015版
若因沙氏葡萄糖琼脂培养基 上生长的细菌使霉菌及酵母 菌的计数结果不符合微生物 限度要求,可使用含抗生素 (如氯霉素、庆大霉素)的 沙氏葡萄糖琼脂培养基或选 择性培养基(如玫瑰红钠琼 脂培养基)进行霉菌和酵母 菌总数测定。使用选择性培 养基时,应进行培养基适用 性检查。如采用MPN法,测 定结果为需氧菌总数。
微生物检查体系的调整
2010版
分类依据 质控分类 检验体系 项目1 按微生物类别分 细菌、真菌 选择培养、或者人为区分 细菌数 营养琼脂
2015版
按营养条件分 需气、厌气菌 直接与培养条件对应 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂 (TSA)
项目2
霉菌及酵母菌总数 玫瑰红钠琼脂
容易造成漏检
霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA)
供试品检查部分-结果判断
2010版
2015年版微生物限度检验操作规程.
青岛**有限公司文件目的建立微生物限度检查操作规程,规范操作,保证结果的准确性。
范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。
责任品管部微生物限度检验人员内容概述:本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法》进行检查。
微生物计数法一、计数方法1.微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋),并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。
4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液;取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2-8℃,可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃,在验证过的贮存期内使用。
表1 试验菌液的制备和使用4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求,应进行对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
4.4培养基适用性检查按照表1规定,接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置规定的条件下培养。
《中国药典》2015年版微生物测定修订情况
常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平 板,每一试验菌株平行制备2个平皿,30~35℃培养 不超过3天。同时,用相应的对照培养基代替被检培 养基进行上述试验。 分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至 胰酪大豆胨琼脂培养基平板,每一试验菌株平行制备 2个平皿,30~35℃培养不超过5天。同时,用相应 的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法 计数培养基适用性检查
菌种:金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉,不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制 备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%(v/v)聚山 梨酯80。 菌液在室温下2小时内使用,2~8℃时可在24h内使用, 黑曲霉孢子悬液可2~8℃保存,在验证过的贮存期内 使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法:包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基 至少制备2个平皿,以算术平均值计算。使用涂布 法应采用适宜的方法使培养基表面干燥,且每个 平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法:一般取相当于1g(ml、10cm2)的供试 品,(若供试品中所含的菌数较多时,供试液可 酌情减量)加至适量稀释液中,混匀,过滤。用 适量冲洗液冲洗。 每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品,加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解,或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃(特殊情况下,最多不超过 45℃),小心混合,若需要可在水浴中进 行,然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液,保温,混合,并在最短时间内形成 乳状液。必要时,用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法,每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数;若滤膜上无菌落生长,以﹤1 报 告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品),或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外,取规定量供试品,按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定,每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30~35℃培养3~5天,沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20~25℃培养5 ~7天, 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数,必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15, 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
中国药典2015版微生物检测所用菌种和培养基
7
抗生素检定 III
藤黄八叠球菌菌悬液制备
8
抗生素检定 IV
两性霉素效价测定
9
抗生素检定 V
培养啤酒酵母菌菌种
10
抗生素检定 VI
多粘菌素效价测定
11
抗生素检定 VII
头孢噻肟钠效价测定
12
抗生素检定 VIII
万古霉素效价测定
13
抗生素检定 IX
白色念珠菌悬液抗生素效价测定
14
多黏菌素 B 用培养基
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
肠道菌计数和肠杆菌科鉴别
10
麦康凯液体培养基
肠道致病菌的增菌培养
11
麦康凯琼脂培养基
肠道致病菌的选择性分离、培养
12
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离培养
13
三糖铁琼脂培养基(TSI)
肠杆菌糖发酵及硫化氢反
14
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(十六烷基三甲基溴化铵培养基)
绿脓杆菌的选择性分离培养
15
甘露醇氯化钠琼脂培养基 (甘露醇盐琼脂培养基)
金黄色葡萄球菌选择性分离培养
16
哥伦比亚琼脂培养基
梭菌的选择性分离培养
17
梭菌增菌培养基
梭菌增菌培养
18
沙门菌增菌液体培养基
药品或生物制品中沙门氏菌选择性增菌
19
念珠菌显色培养基
念珠菌分离和鉴定
1.3抗生素检定培养基
编号
名称
用途
药品细菌培养,滴眼剂金黄色葡萄球菌培养
4
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
药品抑菌剂效力检测中细菌检测
5
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。
二、引用标准:《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1。
微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。
消毒液、稀释剂、试液及培养基4。
检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法)5。
微生物计数法检查6.控制菌检查法7.实验技术8、附件1.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2).目测霉变者以不合格论。
(3)。
“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、1、设施:2、1、1.微生物限度检查室及相关设施:微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2、1、2.其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(30~35℃);霉菌培养箱(25~28℃);电炉(或其她适宜得加热装置);恒温水浴;电热干燥箱(250~300℃);电冰箱。
生化试剂储存箱。
2、2仪器及器皿2、2、1。
菌落计数器;显微镜(1500X);电子天平或药物天平(感量0、1g);pH 系列比色计。
2、2、2.玻璃器皿:锥形瓶(250~300ml,内装玻璃珠若干)、研钵(玻璃或陶瓷制,∮10~12cm)、培养皿(∮9 cm)、量筒(100ml)、试管(18×180mm)及塞、吸管(1ml分度0、01,10ml分度0、1)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。
2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗,浸泡于1%~2%盐酸(工业用)液中约2~6小时,除去游离碱质,再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后,再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2~3次,晾干备用。
2、3用过得玻璃器皿:2、3、1未被病原微生物污染得器皿:可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡),除容量仪器外,可用毛刷与肥皂粉,内外刷洗,再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗,再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2~3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经121℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物,再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法 7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊,产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105:微生物计数法,以及1106:控制菌检查法的规定,本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分,文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性,对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶,可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试,首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查;如常规倾注平皿法不适用,则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件,按制定的方法进行试验,根据验证结果判断是否符合验证标准。
2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性,对其有效性进行评价,保证检验结果的可靠性。
本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊,进行微生物限度检查方法的验证。
3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草,由质量部审核,最终由质量负责人批准。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则:
• 环境: – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版:在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染 ,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级,作为 菌数报告(取两位有效数字)的依据。取最 高的平均菌落数,计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长,或仅最低 稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小 于1 时,以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品,用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液,或pH7.2 磷酸盐缓冲液,或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要,调节供试液 pH 值至 6 ~8。必要时,用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC(B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版:营养肉汤或营养琼脂培养基】 30~35℃,18~24小时
2015版《中国药典》微生物检查法控制菌检查法修订解析
的胰酪大豆胨肉汤中,混匀,30~35℃培
养18-24h。( Chp为营养肉汤培养基)
• (2)选择和分离培养
• 取上述预培养物接种至10mlRV増菌肉 汤中,30~35℃培养18-24h。取少量RV沙 门菌増菌肉汤培养物划线接种于木糖赖氨酸 脱氧胆酸琼脂平板上,30~35℃培养18-
五、供试品检查
三、培养基适用性
4、适用性检查
(1)测试能力:促生长能力(+);抑制能力(-);
指示能力(“指示”)
1)琼脂: 方法:涂布,至少2皿。
①比较菌落特征 ②是否生长
2)液体:
方法:直接接种
①培养基是否浑浊
三、培养基适用性
4、适用性检查
(2)要求: 1)菌株:根据表格要求接种 2)接种量:根据测试指标而定 ①“+”和“指示”:不大于100cfu ②“-”:不少于100cfu,也不能过多。 ③涂布:不少于接种,也不能过多。 3)培养时间 ①“+”和“指示”:不长于规定的最短培养时间。 ②“-”:不短于规定的最长培养时间。
可通过培养基适用性检查提供一定依据。在保证配 制和灭菌过程无误的条件下,对照培养基可以不经 适用性实验检查直接用于样品检查。 (3)不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适 用性试验简单确定。不能使用经过对照培养基进行 适用性试验检查合格的其他培养基作为实验室自用 的“对照培养基”。 (4)如果没有特殊规定,培养基配置采用蒸馏水或纯 化水均可,但应进行检测控制,如蒸馏水pH应为5~7。
三培养基适用性4适用性检查控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌増菌肉汤促生长能力ecolipaeruginosa抑制能力saureus紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力指示特性ecolipaeruginosa大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力ecoli抑制能力saureus麦康凯琼脂促生长能力指示特性ecoli沙门菌rvs増菌肉汤促生长能力抑制能力saureus木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力指示特性ecoli铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力paeruginosa抑制能力ecoli金黄色葡萄球菌甘露醇高盐琼脂促生长能力指示特性saureus抑制能力ecoli梭菌増菌培养基促生长能力clsporogenes哥伦比亚琼脂促生长能力clsporogenes白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力calbicans沙氏葡萄糖琼脂促生长能力指示特性calbicans三培养基适用性4适用性检查1测试能力
2015年药典通则1106非无菌产品微生物限度检查
通则1106 非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下,检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时,应按下列规定进行检验,包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性,应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂,应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B)26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B)44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonellaparatyphi B)〔CMCC(B)50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F)98 001〕生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上,30~35℃培养18~24 小时;将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中,20~25℃培养2~3 天;将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30~35℃培养24~48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30~35℃培养18~24 小时。
中国药典2015版无菌检查方法适用性试验(直接接种法)
中国药典2015版⽆菌检查⽅法适⽤性试验(直接接种法)*********公司*********产品⽆菌检查⽅法适⽤性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息:4、菌液制备:2.1接种⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨培养基中或胰酪⼤⾖胨脂培养基上,30~35℃培养18~24⼩时,培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.2接种⽣孢梭菌的新鲜培养物⾄硫⼄醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24⼩时,培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.3接种⽩⾊念珠菌的新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基或沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上,20~25℃培养24~48⼩时,培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.4接种⿊曲霉菌的新鲜培养物接种⾄沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上,20~25℃培养5~7天,加⼊3~5ml含0.05%(ml/ml)聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液,将孢⼦洗脱。
然后,采⽤适宜的⽅法吸出孢⼦悬液⾄⽆菌试管内,⽤含0.05%(ml/ml)聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌孢⼦悬液。
6、⽆菌检查直接接种法⽅法适⽤性试验6.1供试品制备:描述供试品制备过程(主要为每个样品的取样部位及⽤量)。
6.2试验组:取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基,接种规定的供试品量(同6.1),并接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌;⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌、枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉按照上述步骤操作,其中⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌加⼊硫⼄醇酸盐流体培养基,枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉加⼊胰酪⼤⾖胨液体培养基。
6.3对照组:取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基3管,分别接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌;取相同装量的胰酪⼤⾖胨培养基3管,分别接种⼩于100cfu枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉。
中国药典2015版微生物检测所用菌种和培养基
肠道菌计数和肠杆菌科鉴别
10
麦康凯液体培养基
肠道致病菌的增菌培养
11
麦康凯琼脂培养基
肠道致病菌的选择性分离、培养
12
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离培养
13
三糖铁琼脂培养基(TSI)
肠杆菌糖发酵及硫化氢反
14
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(十六烷基三甲基溴化铵培养基)
绿脓杆菌的选择性分离培养
15
甘露醇氯化钠琼脂培养基 (甘露醇盐琼脂培养基)
金黄色葡萄球菌选择性分离培养
16
哥伦比亚琼脂培养基
梭菌的选择性分离培养
17
梭菌增菌培养基
梭菌增菌培养
18
沙门菌增菌液体培养基
药品或生物制品中沙门氏菌选择性增菌
19
念珠菌显色培养基
念珠菌分离和鉴定
1.3抗生素检定培养基
编号
名称
用途
多粘菌素 B 效价测定
15
制霉素检定培养基
制霉素效价测定
16
麦迪/麦白霉素检定培养基
麦迪(白)霉素效价测定
17
阿奇霉素检定培养基
阿奇霉素效价测定
18
生芽孢琼脂斜面培养基
快速生芽孢
1.4支原体检查
编号
名称
用途
1
支原体半流体培养基
生物制品无菌试验,检查支原体
2
精氨酸支原体肉汤基础培养基
培养支原体
3
肺炎支原体肉汤基础培养基
制备药品制品的稀释液或冲洗液
9
PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液
制备药品制品的稀释液或冲洗液2.2ຫໍສະໝຸດ 生物限度检查编号名称
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编号
名称
用途
1
金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003
2
铜绿假单胞菌 CMCC(B) 10104
3
生孢梭菌 CMCC(B) 64941
4
生孢梭菌 CMCC(B) 64941
5
白色念珠菌 CMCC(F) 98001
6
大肠埃希菌 CMCC(B)44102
7
乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B)50094
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
肠道菌计数和肠杆菌科鉴别
10
麦康凯液体培养基
肠道致病菌的增菌培养
11
麦康凯琼脂培养基
肠道致病菌的选择性分离、培养
12
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离培养
13
三糖铁琼脂培养基(TSI)
肠杆菌糖发酵及硫化氢反
14
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(十六烷基三甲基溴化铵培养基)
1
MH 肉汤培养基
抗生素敏感试验
2
MH 琼脂培养基
抗生素敏感试验
3
抗生素检定 I (PH6.5 - 6.6)
苯唑青霉素等抗生素检定
4
抗生素检定 I (PH7.8 - 8.0)
链霉素等抗生素检定
5
抗生素检定 II (PH6.5 - 6.6)
四环素等抗生素效价测定
6
抗生素检定 II (PH7.8 - 8.0)
药品细菌培养,滴眼剂金黄色葡萄球菌培养
4
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
药品抑菌剂效力检测中细菌检测
5
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)
药品抑菌剂效力检测中细菌检测
6
沙氏葡萄糖液萄糖琼脂培养基(SDA)
药品抑菌剂效力检测中真菌检测
8
0.1%蛋白胨水溶液
林可霉素等抗生素效价
7
抗生素检定 III
藤黄八叠球菌菌悬液制备
8
抗生素检定 IV
两性霉素效价测定
9
抗生素检定 V
培养啤酒酵母菌菌种
10
抗生素检定 VI
多粘菌素效价测定
11
抗生素检定 VII
头孢噻肟钠效价测定
12
抗生素检定 VIII
万古霉素效价测定
13
抗生素检定 IX
白色念珠菌悬液抗生素效价测定
14
多黏菌素 B 用培养基
多粘菌素 B 效价测定
15
制霉素检定培养基
制霉素效价测定
16
麦迪/麦白霉素检定培养基
麦迪(白)霉素效价测定
17
阿奇霉素检定培养基
阿奇霉素效价测定
18
生芽孢琼脂斜面培养基
快速生芽孢
1.4支原体检查
编号
名称
用途
1
支原体半流体培养基
生物制品无菌试验,检查支原体
2
精氨酸支原体肉汤基础培养基
培养支原体
3
肺炎支原体肉汤基础培养基
分离肺炎支原体
4
支原体琼脂基础培养基
支原体分离培养
5
解脲支原体肉汤基础培养基
分离培养解脲支原体
制备药品制品的稀释液或冲洗液
9
PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液
制备药品制品的稀释液或冲洗液
2.2微生物限度检查
编号
名称
用途
1
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
药品或生物制品中总需氧菌计数
2
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)
药品或生物制品中总需氧菌计数
3
沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)
药品或生物制品中真菌的培养
4
沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)
药品抑菌剂效力检测中真菌检测
5
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)
霉菌、酵母菌计数
6
玫瑰红钠琼脂培养基
霉菌、酵母菌计数
7
硫乙醇酸盐流体培养基
药品、生物制品无菌试验,和需氧菌、厌氧菌的培养
8
肠道菌增菌液体培养基
耐胆盐革兰氏阴性菌的增菌培养多
用于检验食物和动物饲料中的肠杆菌
9
绿脓杆菌的选择性分离培养
15
甘露醇氯化钠琼脂培养基 (甘露醇盐琼脂培养基)
金黄色葡萄球菌选择性分离培养
16
哥伦比亚琼脂培养基
梭菌的选择性分离培养
17
梭菌增菌培养基
梭菌增菌培养
18
沙门菌增菌液体培养基
药品或生物制品中沙门氏菌选择性增菌
19
念珠菌显色培养基
念珠菌分离和鉴定
1.3抗生素检定培养基
编号
名称
用途
8
黑曲霉 CMCC(F) 98003
9
单核细胞增生李斯特氏菌
10
鼠伤寒沙门氏菌
11
阪崎肠杆菌
12
蜡样芽胞杆菌
二、微生物干粉培养基
1.1无菌检查法
编号
名称
用途
1
硫乙醇酸盐流体培养基
药品、生物制品无菌试验,和需氧菌、厌氧菌的培养
2
硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)
混浊制品需氧无菌试验
3
0.5%葡萄糖肉汤培养基