毒理学实验资料

实验一毒理学实验的基本操作

一、实验目的

1、了解动物实验是毒理学研究的重要手段之一

2、掌握小鼠动物实验的基本操作技术

二、实验器材与试剂

电子称、小鼠固定器、注射器（3号针头）、灌胃针（12号针头）、棉签、镊子、眼科镊、毛细管、小号毛笔、品红、苦味酸、生理盐水、巴比妥钠、报纸、5ml离心管

三、实验内容

1. 实验动物的抓取和固定。

2. 实验动物的选择、性别鉴定、随机分组及标记。

3. 实验动物的给药途径（麻醉）：灌胃及腹腔、尾静脉、皮下注射。

4. 实验动物的采血：摘取眼球法。

5. 实验动物的处死：颈椎脱臼法。

实验动物的种类——小鼠（Mouse )

（一）小鼠的捉拿、固定

（二）辨别小鼠的性别，小鼠的编号及染色方法，完全随机分组

1. 颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）：

红色：0.5%中性红或品红溶液

黄色：3-5%苦味酸溶液（水）

80-90%苦味酸酒精饱和溶液

2. 实验动物的分组——完全随机分组法

将符合实验要求的40只小白鼠随机分配到A，B两组。

（1）动物编号1-40；

（2）根据随机数字表，任意指定第10行第15列，从左到右依次读取40个两位的随机数字；

（3）对随机数字按大小顺序排序，如数字相同，按先后顺序，先出现的为小；

（4）随机数字序号为1~20号对应的小鼠分为A组，21~40号对应的小鼠分为B组。（三）常用给药方法

1、经消化道给药法

A自动摄取法

B灌胃给药法：小鼠专用灌胃针由注射器和喂管组成，喂管长约1nm，喂管尖端焊有一金属小圆球，金属球中空，用途是防止喂管插入时造成损伤。金属球弯成20度角，以适应口腔与食道之间弯曲。将喂管针头尖端防放进小鼠口咽部，顺咽后壁轻轻往下推，喂管会顺着食管滑入小鼠的胃，插入深度约3cm。用中指与拇指捏住针筒，食指按着针竿的头慢慢往下压，即可将注射器忠的药液灌入小鼠的胃中。在插入过程中如遇到阻力或可看见1/3的针管，说明灌胃并没有插入胃中，需要取出重新操作。

2、注射给药法

A皮下注射

B腹腔注射(巴比妥钠)：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两恻进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3nm左右，接着使注射针头与皮肤呈45°角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失。固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液。注射量为0.1-0.2ml/10g体重。

C尾静脉注射

3、涂布给药法

药物经皮肤吸收、局部作用或致敏

作用时间根据药物性质和要求定

（四）摘除眼球采血

左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。

采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.6-0.1mL

（五）实验动物的处死方法

大白鼠、小白鼠：脊椎脱臼法

断头法

急性放血法

空气栓塞法

实验二小鼠骨髓细胞微核实验

(一)目的

通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE)微核测定方法。

(二)原理

微核试验是用于染色体损伤和十扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在干细胞中主核之外的一种颗粒.大小相当于细胞直径的1/20~1/5,呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。

微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。

(三)器材与试剂

1.器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸,2m1注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。

2.试剂甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1。先将染料置于研钵内，加人少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60℃水浴2h，取出待冷却后加人甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该储备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用pH6.B的磷酸盐缓冲液配制为10%的应用液)、pH6.8的磷酸盐缓冲液。

(1) 1/15mo1/L磷酸二氢钾溶液:称取分析纯KH2PO4 9.06g，用蒸馏水溶解并定容至100Oml。

(2) 1/15moI/L磷酸氢二钠溶液:称取分析纯Na2HPO4 9.45g用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

（3) pH6.8的磷酸盐缓冲液:取1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40 m1和1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60m1，两者混合均匀即成。

3.阳性对照物环磷酞胺或丝裂霉素C。

(四）操作步骤

1.试验动物及处理

（1）动物选择:一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18~~20g，7~12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。

(}〕染毒途径:根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。

(3)染毒次数及取样时间:研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变