Primer5设计PCR引物的步骤
使用oligo 6和primer premier 5.0等软件设计pcr引物
使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物张新宇（中国医科院肿瘤研究所，北京100021）电子邮件: ********************在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。
而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。
在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。
要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。
也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。
现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。
生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。
这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。
本文就这一问题进行探讨。
引物设计的原则引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值(melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
实验五 PCR引物设计及评价
实验五 PCR引物设计及评价【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。
2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。
【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。
PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计原则如下：1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。
引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。
这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性；2、引物的长度一般为15-30 bp。
常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；3、引物不应形成二级结构。
引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；4、引物序列的GC含量一般为40-60%。
过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大；5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)；6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
7、引物3’端不可修饰。
引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
primer premier5引物设计步骤
primer premier5引物设计步骤
引物是在PCR反应中用于扩增目标DNA片段的短链寡核苷酸序列。
Primer Premier 5是一款常用的引物设计软件，以下是引物设计的一般步骤：
1. 目标序列准备：将目标DNA序列输入到Primer Premier 5软件中。
确保序列准确无误，并确定要扩增的目标区域。
2. 引物设计参数设置：根据实验需求和PCR反应条件，设置引物设计的相关参数。
包括引物长度、引物的GC含量、引物间的碱基对数目等。
3. 引物设计策略选择：根据需求选择合适的引物设计策略，如末端限制酶切位点、避免引物间的二聚体形成等。
4. 引物设计和评估：软件将自动生成多个候选引物序列，并根据一定的评估标准对其进行评估，包括引物的互补性、引物之间的二聚体形成、GC含量等。
5. 引物的选择和优化：根据评估结果选择一个或多个最合适的引物序列。
根据需要，可以对引物进行进一步优化，如修改引物长度、GC含量、碱基组成等。
6. 引物合成和实验验证：根据设计的引物序列进行引物合成，并进行PCR 实验验证引物的扩增效果和特异性。
引物设计是PCR实验中至关重要的步骤，引物的质量和合适性直接影响PCR 反应的效果。
Primer Premier 5软件提供了便捷的引物设计工具和功能，可以帮助研究人员高效地设计和评估引物序列。
Primer 5 设计PCR引物的步骤
打开软件
复制基因序列
粘贴
选项AS is- OK
点击primer 按钮，弹出菜单后点击search按钮
选择 PCR primer，Pairs 参数，并选择所需PCR产物长度，OK
会弹出搜索结果菜单，点击OK
在搜索出的结果列表里选择TM合适、GC含量高、无各种BUG的引物，点击edit primer，将所得引物复制
设计引物打开软件复制基因序列粘贴选项asok点击primer按钮弹出菜单后点击search按钮选择pcrprimerpairs参数并选择所需pcr产物长度ok会弹出搜索结果菜单点击ok在搜索出的结果列表里选择tm合适gc含量高无各种bug的引物点击editprimer将所得引物复制而后点击sa按钮并继续点击editprimer复制反向引物引物设计达成
而后点击S/A按钮，并继续点击edit primer，复制反向引物，引物设计达成。
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全的好评与关注）
设计引物的实验报告
一、实验目的1. 掌握引物设计的原理和方法。
2. 学习利用生物信息学工具进行引物设计。
3. 了解引物在PCR实验中的应用。
二、实验原理引物是一段单链DNA或RNA，作为PCR反应的起始模板，与模板DNA链互补结合，从而在PCR反应中引导DNA的复制。
引物设计是PCR实验成功的关键因素之一。
三、实验材料1. 生物信息学工具：Primer Premier 5.0、Primer BLAST、OligoCalc等。
2. 实验样品：待扩增的DNA模板。
3. 其他：PCR试剂、DNA序列、引物合成等。
四、实验步骤1. 选择目标基因序列根据实验目的，选择合适的基因序列。
在本实验中，以某基因的cDNA序列为模板。
2. 利用生物信息学工具进行引物设计（1）打开Primer Premier 5.0软件，输入基因序列。
（2）设置引物设计参数，如：引物长度、Tm值、GC含量、引物间距离等。
（3）进行引物设计，得到多个引物序列。
（4）利用Primer BLAST和OligoCalc等工具对设计出的引物进行筛选，排除同源序列和二级结构。
3. 引物合成将筛选出的引物序列提交给引物合成公司，合成引物。
4. PCR实验（1）配制PCR反应体系，包括：引物、模板DNA、dNTPs、DNA聚合酶等。
（2）设置PCR反应程序，如：预变性、变性、退火、延伸等。
（3）进行PCR反应，观察扩增结果。
五、实验结果与分析1. 引物设计结果根据实验目的，设计出以下引物：上游引物：5'-ATCGTACGCTAGGCTG-3'下游引物：5'-CGTCTGACGACGTCAGT-3'2. PCR扩增结果通过PCR实验，成功扩增出目标基因片段。
六、实验结论1. 通过生物信息学工具进行引物设计，可提高引物设计的准确性和效率。
2. 合适的引物是PCR实验成功的关键，设计引物时需考虑多种因素。
3. 本实验成功设计并合成引物，为后续的PCR实验奠定了基础。
如何使用Primer_Premier_5.0
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利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究
利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究引言：PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一种广泛应用于分子生物学和基因工程领域的技术，通过引物（primers）的选择和设计，能够扩增特定的DNA片段。
PCR引物设计的质量和合理性对PCR扩增的成功与否起着至关重要的作用。
PrimerPremier5.0 是一款被广泛使用的引物设计软件，具有许多功能，可以辅助研究人员选择高质量的引物。
本文旨在研究和探讨利用PrimerPremier5.0软件进行PCR引物设计的方法和优势。
方法：1. 引物设计目标：在PCR实验中，为了获得准确和高效的扩增结果，引物设计时需要考虑以下几个因素：- 引物长度：通常情况下，引物的长度应在18到30个碱基对之间。
- GC含量：GC含量应尽量控制在40%到60%之间，过高或过低都会影响引物的特异性和扩增效率。
- 引物间的互补性：引物之间应避免互补性或三联体结构的形成，以避免非特异性扩增。
- 引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm值应接近，以确保特异性扩增。
2. PrimerPremier5.0软件的使用：- 安装并启动PrimerPremier5.0软件。
- 导入所需扩增区域的目标序列。
- 在软件中设置引物的参数，如长度、GC含量和Tm值等。
- 执行引物设计程序，软件会根据设置的参数，自动在目标序列中搜索合适的引物。
结果与讨论：通过PrimerPremier5.0软件的使用，可以高效地选择到符合设计要求的引物。
软件会根据设定的参数，自动搜索并筛选出多个候选引物。
1. 引物长度：为了确保引物能够与模板DNA进行特异性结合，通常将引物长度设定在18到30个碱基对之间。
经过软件筛选后，可得到一组长度适当的引物。
2. GC含量：合适的GC含量可以提高引物的稳定性和特异性。
软件会自动根据设定的GC含量范围，筛选出具有适当GC含量的引物。
引物设计软件primer_5[1].0_使用说明书
![引物设计软件primer_5[1].0_使用说明书](https://img.taocdn.com/s3/m/e3b21a49814d2b160b4e767f5acfa1c7aa0082e0.png)
primer5说明书22008年04月20日星期日上午04:491 从All Enzymes 框中选择您想添加的酶添加到当前群组中对于windows 或PowerMac系统而言在点击同时按住CTRL键即可选择多个酶按住SHIFT键同时点击可以选择两次点击之间范围内的所有酶使用Add 按钮将选中的酶加入到当前群组在SelectedEnzymes 框中选择酶并点击Delete 按钮可以从当前群组中剔除特定酶同样在AllEnzymes 框中双击某个酶即为添加在Selected Enzymes 框中双击某个酶即为剔除2 使用特征筛选窗口根据某些特征来选择当前群组具体请看下面的Filter window 特征筛选窗口的章节Restriction Sites 酶切位点窗口在Restriction Enzyme Analysis窗口点击OK 按钮可以打开Restriction Sites窗口可选显示方法有Table 列表以表格形式列出酶识别序列和切割位点以及在待分析序列上的切割位置Sequence 序列显示所有酶在分析序列上的实际切割位点Map 图谱以长条形式显示序列在其中使用竖线表示所有的酶切位点Non-cutters 无切点酶列出所有在序列上没有切点或不符合预设参数的酶您通过指定切点数量限制来有选择的显示酶切分析结果例如您点选4 数字框切点多于或等于5个的酶将不会被显示使用菜单的File >;Print 您可以打印以Table Sequence 或Non-cutters 形式的分析结果Edit Enzyme 限制内切酶编辑窗口想要在All Enzymes群组中修改某一种酶选择该酶并点击Edit 按钮可以激活EditEnzyme 限制性内切酶编辑窗口在这里酶的名称识别位点和热稳定性都可以修改注意如果某个酶的切点多于50个将只显示前50个其余的则被忽略点击Add 按钮可以激活新内切酶窗口其名称和识别位点采用默认设置点击Delete按钮则可删除选定的酶点击OK 按钮则保存所有修改并返回Restriction Enzyme AnalysisWindow 限制性内切酶分析窗口注意您无需每次修改都点击OK 按钮软件能记住您这一次的所有修改点击OK 按钮可以保存所有修改而点击Cancel 按钮则放弃所有修改Filter 特征筛选窗口您可以使用特征筛选窗口根据酶的特征来选择当前群组进行分析13有报道说PCR程序能显著改变多义引物扩增的成功率该种优化程序开始的2 5个循环采用不严格的退火温度然后的25到40个循环使用更为严格退火温度宽松的退火条件可以允许部分配对的引物与模板结合在两个循环后扩增产物的5 末端就与引物一致并能很好的作为以后扩增的模板了此时提高退火温度能得到更高的特异性Graphs 图表通过Graph菜单可以获得整个序列Tm 融链温度GC% GC含量和Internal stability内部稳定性的图表Tm是所有可能的引物的融链温度引物长度是由Preferences 默认参数设定的GC%则是所有可能引物的GC含量Internal stability 内部稳定性则是在每一序列位点起始的五聚体的稳定性自由能当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针将会显示一条贴近最近的序列的分界线而数据输出窗口也会即时更新而相应五聚体会高亮显示15可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序最稳定的一种排在最前使用卷动条可以看到未显示的部分除了上述功能这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮Search Criteria 搜索参数窗口Search Results 搜索结果如果已经实施过搜索窗口以及Edit Primer 引物编辑窗口点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示16Edit Primer 引物编辑窗口Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列在windows系统或Power Mac的Command-X Command-C 及Command-V 系统中您可以使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑发生变化Analyze 按钮就可以使用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基如果您修改氨基酸残基相应位置可能出现多义密码子除了上述的引物性状和二级结构资料具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节该窗口也提供了限制性酶分析功能您可以通过点击Enzyme 按钮通过手动或软件提供的筛选方案来选择一组限制性酶您可以使用Prime 按钮来将引物移动到更合适的结合位点通常这项功能可以让您确认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在其他信息如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表请关闭本窗口从主菜单上选择Function >GeneTank激活GeneTank窗口再选择Translate > Change Parameters打开Select Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口可选操作Function > Edit PrimerSearch Criteria 搜索标准窗口以下是基本搜索标准的详细信息根据PCR引物测序引物或杂交探针的不同要求选择不同的搜索标准是很有必要的PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准某些用以优化引物扩增能力的标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计这两者需要的是较高的退火温度因此当您选择不同的搜索标准PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求搜索公式中使用的具体参数请参看后面的Automatic Search Parameter 自动搜索参数章节Search Type 搜索类型框将指定您要搜索的是单个引物两条单独引物引物对或为当前引物找寻合适的反向引物默认设置下Search Range 搜索范围是当前序列的全长默认PCR产物长度为100 bp到500 bp 如果您是搜索单个引物该数值将不会起作用您也可以为搜索设定Primer Length引物长度您将会在下一章节了解该项设定的具体作用最后您可以设定Search Mode 搜索模式为自动或手动除非您有很特殊的要求或想完全控制特定的搜索参数建议您使用自动搜索利用PRIMER PREMIER找到多条引物再从中通过详细分析来挑选合适的使用可选操作Function > SearchSearch Parameter Windows 搜索参数窗口搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配您可以在激活False Priming选项后利用Files 按钮选择这些序列文件Automatic Search 自动搜索尽管PRIMER PREMIER已经自动设置了一些数值您还是可以选择在自动搜索中需要使用哪些参数点击去掉相应参数左边框中的则该参数在搜索中不会被考虑自动搜索开始的标准很严格但如果没有找到合适的引物则标准会自动降低直到找到合适的引物下列图表中显示了在PCR引物设计中自动搜索初始的严格参数其中Tm值范围是根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的18Manual Search 手动搜索及引物设计原理在过去十年中为获得高效扩增PCR方法得到的很大发展我们对引物稳定性二级结构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下大大提高了引物的扩增效率而PRIMER PREMIER 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡引物长度引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度对越多数实验适宜引物长度为18到24个碱基等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物也允许您通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡PRIMER PREMIER 已经包含了合适的引物长度范围如果您改变了它们软件将会自动记录并在下次使用直到您再次改变它们因此您最好根据不同实验的特殊要求输入合适的长度范围PRIMER PREMIER 以最短的指定长度开始搜索引物如果找到的引物的Tm值小于设定范围或GC含量不符合要求它将给引物增加一个碱基长度并重新计算Tm值和GC含量看其是否符合要求如果引物长度达到最大值还不能符合要求则该引物将会被剔除这种搜索机制保证找到的引物是符合Tm值和GC含量要求的最短引物为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次如下Tm 融链温度PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链19温度请参看附录A中关于公式的说明选择的Tm范围应该为退火提供足够的热度在自动搜索中PRIMER PREMIER使用的范围选择机制如下首先计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm值得出平均值后按照不同的严格度要求确定的波动值根据这一平均值来计算出Tm范围根据已发表的实验数据文献8 PCR反应的合适Tm范围为56到63°C 以上机制是被设计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物GC% GC含量对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50% 请参看上文Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具体参数Degeneracy 多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸详情请参看本说明的Degeneracy 多义性章节3’ End Stability 3 末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端如果引物3 稳定性强有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩增条带secondary bands 而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸GC Clamp GC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳它保证引物与模板的稳定结合选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度使用菜单Report > Internal Stability选项可以看到象下图所显示的一个引物的内部稳定性曲线表20请注意上图就显示一个好的引物 3 末端稳定性较弱而 5 末端有一个较强的GC钳Repeats and Runs 重复和循环PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物例如引物包含ATATAT这样AT被重复三次那么这个引物将被剔除您可以设定可以接收的碱基重复的数量Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用Hairpin 发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构并由于发卡结构的形成是分子内的反应仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳定性可以用自由能衡量自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应按下按钮All 可以使用PRIMER PREMIER软件中的Hairpin Report功能帮助您回避类似二级结构Dimer 二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成False Priming 错配如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布smear PRIMER PREMIER 会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成局部的错配3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始PRIMER PREMIER会计算每一对引物的匹配度100分为满分并按照分数按降序排列计算引物对匹配度以及单个引物评分的公式请参看本说明的附录Search Results 搜索结果当您点击搜索程序窗口的OK 按钮接受搜索结果后Search Results 搜索结果窗口将会打开它显示了搜索中找到的所有引物或引物对如果您选择了一条引物或一对引物对在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果与当前的序列配对的引物的位置和序列也会在Direct Select框上显示可选操作Function > Search Results其他信息Search Results窗口的位置和大小是可以调节的这样在其他窗口里您感兴趣的显示内容如引物分析结果就不会被遮住了Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR反应引物窗口巢式PCR反应通常能大幅提高灵敏度同时又减少非特异性扩增产物通常在模板DNA浓度太低或不纯时采用您可以使用自动搜索或按您实验的需要搜索然后从中选择一系列合乎要求的引物PRIMER PREMIER可以确认它们是否会形成二聚体来帮助您选择巢式PCR反应引物当您接受搜索结果选择菜单Function >Multiplex/Nested Primers选项即可打开该窗口所有引物与全序列以图形显示在窗口顶部序列上的框架代表窗口中间放大显示的部分序列所在的位置通过拖动横行滚动条可以改变放大显示的区域所有提供的引物以竖线形式在顶部的图框显示以蓝色三角形或红色三角形在下面的放大框中显示蓝色代表正向引物红色代表反向引物点击三角形即选定一条对应的引物应用于您的巢式PCR反应同时三角形由空心变为实心表明已被选中选中的引物会在下面的图框中以图表形式显示您会看到在您选择引物的同时已选引物间可能存在的交叉二聚体也同时显示出来PRIMER PREMIER能即时分析所有的已选引物并显示它们之间间可能存在的交叉二聚体结构您可以继续选择引物直到您找到一组没有或很少有稳定的交叉二聚体的引物要剔除一条已选引物非常简单再次点击对应的实心三角形就可以了您也可以手动添加一条引物这样便于您使用已有的引物或通用引物您也可以手动添加所有的引物并分析它们之间的能否形成交叉二聚体您可以指定输入的寡聚核酸作为正向引物还是反向引物它们的起始位置和序列如果不指定起始位置则默认为5末端第一个碱基如果想删除一条引物只需选定并点击Delete 按钮您可以打印模板序列及所有的引物已选引物显示为实心三角形未选引物显示为空心三角形列表包含的引物以及所有可能的交叉二聚体结构也同样被打印出来Database 引物数据库窗口引物数据库可以用来保存引物序列您可以为每一条引物命名并保存在一个原有的或新建的数据库中在数据库窗口中您可以使用Order Primers按钮来定购引物有两种主要方法可以将已选的引物输入到数据库中您可以在Search Results窗口中标记想选择的引物然后在引物数据库窗口中使用Get Marked Primers按钮将标记的引物全部输入到数据库另一种方法是您直接选择一条或一对引物再利用Current Primer Pair 当前引物对图框将其输入数据库引物数据库可以保存引物的起始位置序列对应链和引物名称选择一条引物使用菜单的编辑选项或点击本窗口的快捷按钮可以编辑引物的起始位置序列对应链即方向和引物名称从下拉菜单里选择一个引物数据库您可以使用Import 按钮输入以往保存的引物并在当前序列上进行分析在引物被选择后您可以使用PRIMER PREMIER窗口对其进行编辑和分析您可以使用Edit Primer 窗口上的prime 按钮在当前上序列寻找最佳的结合位点您可以添加一个新的数据库并命名区分这样便于您依照不同的项目或模板序列将保存引物信息您也可以同样便利的删除一个数据库使用Add Primer 按钮可以添加一条新引物同时激活一个窗口用来填写引物名称起始位点对应链和引物序列如果不指定起始位置则默认为5 末端第一个碱基Reports 分析报告使用Reports菜单可以提供多种分析报告除了在PRIMER PREMIER窗口下也可以直接打开的二级结构报告也可以提供当前引物的内部稳定性图表和比吸光度报告选择Reports菜单下的Optical Activity选项能打开一个报告窗口显示当前引物对的分子量和比吸光度activity 单位nmoles/OD和ug/OD当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针将会显示一条贴近最近的序列的分界线而数据输出窗口也会即时更新而相应五聚体会高亮显示该图表窗口可以调整大小以便看清细节当您选择Reports菜单下的Hybridization Time 杂交时间选项您可以输入引物的长度和浓度点击Analyze 按钮可以得到杂交时间Synthesis Order Form 合成订单在搜索及分析完引物后如果您决定定购合成该引物您可以使用软件生成订单为方便您使用软件已经有一个现成的模板您可以创建一个新订单并输入您的地址和其他信息并命名保存您可以使用这个订单作为今后的订单模板Database window 数据库窗口可以用来选择您想合成的引物只需选择您想合成引物点击Order Primer 的快捷按钮PRIMERPREMIER 将在合适的位置自动添加您选择的引物并附上地址及其他信息生成一张订单您可以加上您的注释并将其打印送出您可以保存该订单便于以后查看Optical Activity 比吸光度引物对于260nm波长紫外光的吸光度即A260与其浓度成正比1mg/mL的DNA吸光度为0.02 软件也能计算引物的分子量以便计算如何稀释新合成的引物Molecular Weight 分子量正反引物分子量均以grams/mol 克/摩尔为单位这是根据分子量列表计算得出的nmol/A260 在260nm波长紫外光下每单位吸光度代表的引物的纳摩尔数量这是根据吸光系数和分子量列表计算得来的ug/A260 在260nm波长紫外光下每单位吸光度代表的引物的微克数量这是根据吸光系数列表计算得来的23Degeneracy 多义性某些PCR实验需要引物结合到不确定的序列例如下列情况知道表达蛋白的序列但是不知道DNA序列模板DNA测序结果不准确或不完全利用其他生物体已确认的序列来扩增某一编码区利用模板的同源序列设计引物在设计多义引物时除了在上述搜索参数章节提及的一般参数外也要考虑引物的多义性多义性尽可能低的引物有更高的特异性因而更为理想尽量避免3 末端的多义性也很关键因为3 末端即使一个错配也会抑制延伸PRIMER PREMIER 能自动搜索模板序列设计出在3 末端多义碱基比例和数量都较少的引物参见文献24Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶的分析功能包含约900种酶同时也提供工具让你您方便的添加其他酶通过从默认群组中选择或剔除限制性内切酶您可以创建一个新的群组使用此外您可以根据限制性内切酶特性使用特征筛选来创建新的群组并作为当前群组来进行限制性内切酶分析限制性内切酶分析可以采用以下几种格式显示列表图谱或序列这一功能板块有下列几个部分Restriction Enzyme Analysis Window 限制性内切酶分析窗口Filter Window 特征筛选窗口Edit Window 编辑窗口Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析窗口PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶分析功能包含约900种酶您可以启用群组编辑从All Enzymes 全部酶中添加或删除一些酶作为当前使用的群组SelectedEnzymes 框显示了当前使用的群组包含的酶它是全部酶的子集被用来做限制性内切酶的分析有两种方法可以用来选择当前群组25当您点击OK 按钮后Selected Enzymes框内包含的内切酶列表将成为酶切分析使用的当前群组并将使用该群组进行限制性内切酶分析26Motif Analysis 基序分析软件为您提供了包括约165种常用基序的分析功能同时也提供工具让你您方便的添加其他基序通过从默认群组中选择或剔除基序您可以创建一个新的群组使用并作为当前群组来进行基序分析基序分析可以采用以下几种格式显示列表图谱或序列这一功能板块有下列两个部分Motif Analysis Window 基序分析窗口Edit Window 编辑窗口Motif Analysis 基序分析窗口PRIMER PREMIER 为您提供的基序分析功能包含约165种基序您可以启用群组编辑从All Motif 全部基序中添加或删除一些基序作为当前使用的群组Selected Motif 框显示了当前使用的群组包含的基序它是全部基序的子集被用来做基序分析可以用下述方法来选择当前群组从All Motif 框中选择您想添加的基序添加到当前群组中对于windows或Power Mac系统而言在点击同时按住CTRL键即可选择多个基序按住SHIFT键同时点击可以选择两次点击之间范围内的所有基序使用Add 按钮将选中的基序加入到当前群组在SelectedMotif 框中选择基序并点击Delete 按钮可以从当前群组中剔除特定基序同样在All Motif框中双击某个基序即为添加在Selected Motif 框中双击某个基序即为剔除Motif Sites 基序位点窗口在Motif Analysis窗口点击OK 按钮可以打开Motif Sites窗口可选显示方法有Table 列表以表格形式列出基序基序序列和数量以及在分析序列上的位置Sequence 序列显示所有基序在分析序列上的位置Map 图谱以长条形式显示序列在其中使用竖线表示所有的基序的位点Motifs Absent 不存在的基序列出所有在序列上没有或不符合预设参数的基序您通过指定基序数量限制来有选择的显示基序分析结果例如您点选4 数字框出现多于或等于5次的基序将不会被显示使用菜单的File >;Print 您可以打印以Table Sequence 或Motif Absent 形式的分析结果Edit Motif 基序编辑窗口想要在All Motif群组中修改某一种基序选择该基序并点击Edit 按钮可以激活Edit Motif基序编辑窗口在这里基序的名称识别位点和基序说明都可以修改点击Add 按钮可以激活新基序窗口其名称和识别位点采用默认设置点击Delete 按钮则可删除选定的基序点击OK 按钮则保存所有修改并返回Motif Analysis Window 基序分析窗口注意如果某个基序出现多于50次将只显示前50个其余的则被忽略注意您无需每次修改都点击OK 按钮软件能记住您这一次的所有修改点击OK 按钮可以保存所有修改而点击Cancel 按钮则放弃所有修改27Menu Commands 菜单命令以下功能板块都有自己的主菜单GeneTank 主菜单Primer Premier 主菜单Enzyme Results 主菜单Motif Results 主菜单GeneTank 主菜单FileNew Sequence 重新打开一个序列空白的GeneTank 窗口Open Sequence 提示您使用一个文件来打开已有序列Save 将当前序列保存为一个文件无需经过Import Sequence 窗口确认序列起始位置您就可以打开一个这样保存的文件。
PCR引物设计及Primer_Premier_5.0使用介绍
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物类型 搜索模式
引物搜索选项设定
引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
搜索结果
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
第四步：阅读框
NR1序列： atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct…..
5、引物序列与模板序列组成的相似性
可能的错误引发位点决定于引物序列组 成与模板序列组成的相似性，相似性高 则错误引发率高 。
引物设计的原则
6、最好在模板cDNA的保守区内设计
DNA序列的保守区是通过物种间相似序 列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物 种的同一基因，通过序列分析软件（比 如DNAman）比对（Alignment），各 基因相同的序列就是该基因的保守区。
Primer1: 5’
Primer1: 5’
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
Primer premier 5.0设计pcr引物
1.安装软件Primer premier5.0。
程序下载：Primer Premier 5.0 /Soft/2005/114.htm 2.程序中双击打开3.点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图所示。
4.输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。
5.选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏6.选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶7.选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。
8.软件默认引物为25个碱基9.可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可10．在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。
11.选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。
如图，选中EDIT PRIMERS图标，开始设计反义链。
12.从3端删除7－9个碱基同正义链。
13.将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。
完成后点analyze，认为可以后点OK。
14.最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。
GC含量不应超过60％15.该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印16.如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。
同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。
点OK。
定量pcr引物设计的详细步骤
定量pcr引物设计的详细步骤宝子，来给你唠唠定量PCR引物设计的步骤哈。
一、确定目的基因序列。
你得先知道你要研究的目的基因是啥呀。
这就好比你要找一个小伙伴，你得先知道他长啥样。
你可以去一些基因数据库，像NCBI这种超厉害的地方，找到你要的那个基因的序列。
这个序列就像是这个小伙伴的身份证号码，是独一无二的哦。
二、引物设计软件选择。
有好多好用的引物设计软件呢。
比如说Primer Premier，这个就像一个贴心的小助手。
你把目的基因序列输进去，它就能开始帮你设计引物啦。
还有Beacon Designer也很不错哦。
这些软件就像是魔法棒，能在基因的海洋里给你捞出合适的引物来。
三、引物设计参数设置。
这一步很关键哦。
一般来说呢，引物的长度大概在18 - 25个碱基左右就好啦。
太短了就像小短腿，不太稳；太长了又像大长脚，容易出问题。
还有引物的GC含量，最好在40% - 60%之间。
这就像是一个黄金比例，能让引物和模板结合得更牢。
另外，引物自身不能有太多互补的地方，不然它自己就抱成一团，不跟模板好好玩啦。
四、特异性检查。
设计好引物之后，可不能就这么不管了。
得检查一下它的特异性呢。
这就像是给引物做个忠诚度测试。
你可以用BLAST这个工具，把你设计的引物序列放进去，看看它是不是只和你的目的基因结合，要是和其他乱七八糟的基因也有结合，那可不行，就像找错小伙伴啦。
五、引物合成。
如果前面的步骤都没问题啦，那就要把引物合成出来。
这时候就可以找专门的公司啦，就像把设计图交给工匠，让他们做出真正的成品。
合成好的引物拿回来，就可以开始你的定量PCR之旅啦。
宝子，按照这些步骤来，设计定量PCR引物就不是啥难事啦。
加油哦！ 。
引物设计流程
2010级动科2班杨教童2220103282101511.引物设计的原理和步骤PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
1.引物设计的原则（1）碱基组成：GC含量应在40%-60%（45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。
没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等；（2）引物长度：引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。
（3）重复或自身互补序列：形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。
（4）上下引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。
当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和其他任何引物互补。
（5）解链温度（Tm 值）：计算出来的两个引物的Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的Tm 值与引物的Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的Tm 值一般为50-70℃。
这些特性保证了扩增产物在每一个PCR 循环可有效变性。
（6）3’末端3’末端的性质非常关键。
如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；（7）5’端序列添加限制性酶切位点：2.用Primer Premier 5.0 软件设计两对引物（1）在网页上找到要制作引物的一段序列，最好在1000左右，比如：ORIGIN1 atgaatccaa atcaaaagat aataacaatt ggttctgttt ctctcatcat tgccacaata61 tgtttcctta tgcaaattgc tatcctagta actactgtaa cattacattt caagcagcat121 gactacaact cccccgcaaa caaccaagca atgctgtgta aaccaacaat aatagaaaga181 aacacaacag agattgtgta tttgaccaac accaccatag agaaagaaat atgccccaaa241 ctagtagaat atagaaactg gtcaaagccg caatgtaaca ttacagggtt tgcacctttt 301 tccaaggaca attcaattcg gctttctgct ggtggggaca tctgggtgac aagagaacct361 tatgtgtcat gcgatcctga caagtgttat caatttgccc ttgggcaggg aacaacatta421 aacaacggac attcaaataa cactgtacat gataggaccc cttatcgaac cctattgatg481 aatgaattgg gtgttccatt tcatttagga accaggcaag tgtgcatggc atggtccagc 541 tcaagttgtc acgatggaaa agcatggctg catgtttgta taactgggga tgatagcaat 601 gcaacagcta gcttcattta caatgggagg cttgtagata gtattggttc atggtccaaa 661 aatatactca gaacccagga gtcggaatgc gtctgtatca atggaacctg tacagtagta721 atgactgatg ggagcgcttc aggaaaagct gatactaaaa tactattcgt tgaggagggg781 aagatcgttc atgttagcac attgtcagga agtgctcagc atgttgagga gtgctcctgt 841 tatccacgat ttcctggtgt cagatgtgtc tgcagagaca actggaaagg ctccaatagg901 cccatcgtag atataaatgt aaagaattat agcattgttt ccagttatgt atgctcagga961 cttgttggag acacacccag aaaaggcgac agcgtcagca gtagttattg cctagatcct1021 aacaatgaga aaggtggtca tggggtgaaa ggctgggcct ttgatgatgg aaatgacgtg1081 tggatgggaa ggacaatcaa cgagacgtta cgcttaggtt atgaaacctt caaagtcatt1141 gaaggctggt ccaaagctaa ctccaaatta cagacaaata gacaagtcat agttgaaaag1201 ggcgacaggt ccggttattc tggtattttc tccgttgaag gcaaaagctg catcaatcgg 1261 tgcttttatg tggagttgat aaggggaagg aaagaggaaa ctaaagtctg gtggacctca1321 aacagtattg ttgtgttttg tggcacctca ggtacatatg gaacaggctc atggcctgat 1381 ggagcggata tcaatctcat gcctatataa（2）将序列粘贴到制作区域（3）点击Primer后点击Search开始搜索引物，如：上述设计得如下一对引物5’CCTAAGCGTAACGTCTCGT3’TGGGAG GCTTGTAGATAGT优点：转化率为80%，产物长度比较长，为495bp.能够很到限度的利用所选序列的，在5’端没有A或者多聚A结构，引物的Tm值的差距小于5，GC含量在45%到55%之间。
PCR引物设计软件primerPremier5.0应用简介
4. 引物所对应模板序列的Tm值
• 最好在72℃左右
5. ΔG值(自由能) ，
反映了引物与模板结合的 强弱程度。一般情况下，引物 的ΔG值最好呈正弦曲线形状， 即5’端和中间ΔG值较高，而3’ 端ΔG值相对较低
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不能大于38，因为过长会 导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度
2. 引物3’端的序列
引物3’端的碱基一般不用A， 因为A在错误引发位点的引发效 率相对比较高
引物间3’端的互补、二聚体 或发夹结构也可能导致PCR反应 失败
3. 引物的GC含量
一. 引物设计的基本原则
• 引物长度（primer length） • 产物长度（product length） • 序列Tm值 (melting temperature) • ΔG值(internal stabilformation and hairpin） • 错误引发位点（false priming site） • 引物及产物GC含量（composition）
Premier 的主要功能分四大块，其中有三 种功能较常用，即引物设计( )，限 制酶切点分析( )，基元查找( )。 另个功能是同源性分析（ ），并非 Premier 的特长，在此略过。该软件还有 别的一些功能，如序列”朗读”，DNA 与蛋白序列的互换（ ）
6. 引物二聚体及发夹结构的能量
一般不要超过4.5，否则 容易产生引物二聚体带而且 会降低引物浓度从而导致 PCR正常反应不能进行
二. Primer Premier 5.0 引物设计软件简介
Primer Premier 5.0用途：
primer操作流程
一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy 目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～5 00bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：T m应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T m值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
Primer_5基本使用
Primer_5基本使⽤Primer 5.0使⽤⽅法Primer Premier 5.0软件⽤途Primer Premier是⼀种⽤来帮助研究⼈员设计最适合引物的应⽤软件，利⽤它的⾼级引物搜索引物数据库，巢式引物设计，引物编辑和分析等功能，可以设计出有⾼效扩增能⼒的理想引物，也可以设计出⽤于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。
其主要功能分四⼤块，其中有三种功能⽐较常⽤，即引物设计、限制性内切酶位点分析，DNA基元(motif)查找和同源性分析功能。
Primer 5.0软件基础指南⼀. Primer 引物设计Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎软件，包含了强⼤的⾃动搜索法则只需要简单的操作就可以得到合适的引物。
Primer Premier也提供了⼈⼯控制搜索引擎的⽅法便于根据您的特殊要求制定标准输出的引物，通过全⾯的即时分析⼯具计算出引物的多种参数和⼆级结构关键参数，如Tm值GC含量和⾃由能G，还能以图形显⽰。
为设计⽤于定点突变的引物，该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的引物编辑⼯具，您可以通过输⼊碱基或氨基酸残基来⼿动修改引物。
您可以分析所有想⽤到的引物，可以选择事先搜索的引物，或⼿动添加引物软件。
⼆. Manual Search ⼿动搜索及引物设计原理如下：在过去⼗年中，为获得⾼效扩增PCR⽅法得到的很⼤发展，我们对引物稳定性⼆级结构和适宜长度的了解，使得我们在保证引物特异性的前体下，⼤⼤提⾼了引物的扩增效率⽽Primer Premier 软件的搜索法则很好的维持了⾼效性和特异性之间的平衡。
1.引物长度引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退⽕温度，对多数实验适宜引物长度为18到24个碱基，等于或少于15碱基的短引物有时⽤于简单的基因作图或特殊的⽂库构建。
library protocol 28到35碱基的长引物对于从⼀系列⾼度相关的分⼦中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作⽤，长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物，也允许您通过降退⽕温度来能提⾼反应的灵敏度，不过长引物通常更易于形成包括发卡结构，⼆聚体⾃⾝互补等⼆级结构。
Primer5设计引物------图文并茂一步步教你
1、打开后的界面如图。
2、点FILE---NEW—DNA SEQUENCE如图3、输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。
输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。
4、此主题相关图片如下：选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏此主题相关图片如下：选中OK键，5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶此主题相关图片如下：6、选中primer图标，点S图标，edit primer,开始设计正义链。
此主题相关图片如下：7、软件默认引物为二五个碱基此主题相关图片如下8、可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可此主题相关图片如下：9、在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HIND III 酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。
此主题相关图片如下：10、选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。
11、从3端删除7－9个碱基同正义链。
此主题相关图片如下：12、将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入BamH I酶切位点及CGC3个保护碱基。
完成后点analyze，认为可以后点OK。
此主题相关图片如下：13、最后分析结果如图，反义链的FALSE PRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。
GC含量不应超过60％此主题相关图片如下：14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印此主题相关图片如下：15、如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示，同上输入目的基因片段，选SEARCH图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，search parametere 中的参数可以不选，为默认设置。
《2024年利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》范文
《利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的研究》篇一一、引言PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学和遗传学中常用的一种实验技术，它对于特定基因序列的克隆、分析、鉴定和扩增具有重要意义。
在PCR技术中，引物设计是一个关键的步骤，其成功与否直接影响着PCR反应的效果和准确度。
随着生物信息学的发展，引物设计软件为研究人员提供了更加方便快捷的途径。
本篇文章旨在研究并阐述如何利用软件PrimerPremier5.0进行PCR引物设计。
二、PrimerPremier5.0简介PrimerPremier5.0是一款专门用于设计PCR引物的软件，具有友好的界面和强大的功能。
它可以针对特定基因序列进行引物设计，同时还可以根据用户的需求进行参数调整，如引物的长度、GC含量、退火温度等。
此外，该软件还具有自动筛选和优化引物的功能，大大提高了引物设计的效率和准确性。
三、利用PrimerPremier5.0进行PCR引物设计的步骤1. 打开PrimerPremier5.0软件，输入需要设计的基因序列。
2. 根据实验需求设置引物设计的参数，如引物长度、GC含量、退火温度等。
3. 软件将自动分析基因序列，并在可能的位置设计引物。
用户可以根据需要调整引物的位置和参数。
4. 软件将给出所有可能的引物组合，用户可以根据引物的质量、特异性等指标进行筛选。
5. 对筛选出的引物进行优化，如调整引物的长度、GC含量等，以提高PCR反应的效率和准确性。
6. 保存并导出设计的引物序列，用于后续的PCR实验。
四、注意事项1. 在进行引物设计时，应尽量选择特异性较高的区域进行设计，以避免非特异性扩增。
2. 引物的长度和GC含量应适中，以保证PCR反应的效率和准确性。
3. 退火温度是PCR反应中一个重要的参数，应根据引物的具体情况进行调整。
4. 在使用PrimerPremier5.0进行引物设计时，应遵循软件的操作指南，以保证设计的准确性和效率。