基因克隆及转基因方法
转基因技术常用技术
转基因技术常用技术
转基因技术是指通过人为手段将外源基因（即来自于不同物种的基因）导入到目标生物体内，并使其被目标生物体所识别和表达，从而改变目标生物的基因组成或表达状态的技术。
常用的转基因技术包括以下几种：
1. 基因克隆技术：通过PCR扩增技术和限制性内切酶切割技术，将需要进行转基因的基因分离和扩增出来；
2. 质粒载体构建技术：将目标基因插入到质粒载体中，将质粒载体导入到目标生物中，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因；
3. 基因枪法：将目标基因直接射入到目标生物体内，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因；
4. 细胞微注射技术：将目标基因和载体注入到目标生物体细胞中，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因；
5. 向量病毒法：利用能够侵入生物细胞并将外源基因导入细胞核的病毒作为载体，将目标基因插入到病毒中，通过病毒感染将目标基因导入到目标生物体细胞中，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因。
生物技术改良基因的关键技术方法
生物技术改良基因的关键技术方法基因改良是一种能够通过调整和修改生物体的基因组来改善其性状和特性的技术。
随着生物技术的发展，一系列关键技术方法被广泛应用于基因改良。
本文将介绍其中的几种重要技术方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是基因改良的关键方法之一。
通过基因克隆技术，可以获取特定目的基因的DNA片段，并进行进一步的研究和应用。
基因克隆的过程主要包括将目标基因从DNA源中提取，将其插入载体中，再将载体转化到宿主细胞中等。
最终通过筛选和鉴定，得到所需的基因克隆产物。
二、基因编辑技术基因编辑技术是近年来崭露头角的一种基因改良方法。
它通过对生物体中特定位点的基因进行精确的编辑和修饰，实现对遗传特性的准确改变。
基因编辑技术常用的工具包括CRISPR-Cas9系统和TALENs 等。
通过这些工具，可以实现基因的突变、插入或删除，从而改变生物的性状和特性。
三、转基因技术转基因技术是一种常用的基因改良方法，它将外源基因导入到目标生物的基因组中，使其表达并产生所需的性状或功能。
转基因技术的关键步骤包括筛选和获得目标基因、导入目标基因到宿主生物、确保目标基因在宿主生物中的稳定及高效表达。
转基因技术已经成功地应用于改良作物的抗病性、抗虫性以及增加产量等方面。
四、RNA干扰技术RNA干扰技术是一种基因沉默的方法，通过引导RNA分子识别和降解特定的RNA分子，从而抑制或阻断目标基因的表达。
RNA干扰技术可以通过转基因方式应用于生物体，也可以通过外源给予RNA分子进行基因沉默。
该技术在功能基因的研究以及病毒基因的治疗方面具有广泛的应用前景。
五、基因合成技术基因合成技术是一种通过化学方法合成指定序列的DNA片段的方法。
该技术可以用于合成目标基因的序列，进而进行基因改良的研究和应用。
基因合成技术可以人工合成大片段的基因，也可以合成人工序列的基因，从而为研究和改良基因提供了更大的灵活性和可操作性。
综上所述，基因改良的关键技术包括基因克隆技术、基因编辑技术、转基因技术、RNA干扰技术和基因合成技术等。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
1.制备基因载体：首先要确定所需转入植物的基因，然后将该基因克隆到适当的基因载体中，如农杆菌介导的转化系统中常用的质粒载体。
2. 构建转化质粒：将基因载体与其他必需的元件如启动子、终止子、选择标记等组装成转化质粒。
3. 制备植物材料：选择合适的植物作为转基因植物的母本，如经济作物或模式植物。
4. 农杆菌介导的转化：将构建好的转化质粒通过农杆菌注入到植物的叶片、茎或愈伤组织等处，利用农杆菌的生物学特性，在植物细胞中导入转化质粒。
5. 筛选转基因植物：通过在培养基中加入相应的选择标记，筛选出已经被转化的植物细胞，进而培育出转基因植物。
6. 鉴定转基因植物：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转基因植物是否成功，同时进行表型分析，确定转基因植物的性状和稳定性。
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dna重组的基本类型及特点
dna重组的基本类型及特点
DNA重组是指通过改变DNA分子的序列和组合方式，创造新的DNA 分子的过程。
它是生物学中一种重要的基因工程技术，经过多年的发展和完善，已经成为人类改造生命的重要手段之一。
DNA重组的基本类型包括：基因克隆、DNA片段重组、基因修饰
和转基因技术。
其中，基因克隆是指将一个完整的基因拷贝到另一个载体上，形成一个新的DNA分子；DNA片段重组是指将多个DNA片段重新组合，形成一个新的DNA序列；基因修饰是指对已有的基因进行改造，使其表达方式或功能得到优化；转基因技术是一种通过将外源基因嵌入到宿主细胞中，使其表达而获得新的性状或功能的技术。
DNA重组的特点包括：高效、精准和可控性强。
通过DNA重组技术，科学家们可以针对特定的基因或DNA序列进行精确的改造和修饰，使其表达方式或功能得到优化。
此外，DNA重组技术具有高度的可控性，可以控制新的DNA分子在宿主细胞中的表达和功能，为人类创造出更多的生物医药、农业和工业应用奠定了基础。
总之，DNA重组技术是一种非常重要的基因工程技术，具有基因克隆、DNA片段重组、基因修饰和转基因技术等多种形式。
它具有高效、精准和可控性强等特点，已经成为人类改造生命的重要手段之一。
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植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
1、植物转基因技术的原理
植物转基因技术是指将外源DNA片段插入到植物细胞的过程，从而改变植物的表型特征。
在植物转基因技术中，将外源DNA插入到植物细胞的过程包括以下几个步骤：
(1) DNA片段的生产和收集：DNA片段的生产和收集是通过一系列的生物技术手段来实现的，比如PCR扩增技术、染色体复制，等等。
(2)特異性克隆：特異性克隆是一种利用抗原受体系统的分子生物学技术，主要是通过聚合酶链反应的方法，将无菌的DNA片段植入到宿主细胞中，从而使改变细胞表型性状的抗原受体获得潜在的克隆特异来源。
(3) 载体特异性转染：载体特异性转染是将DNA片段植入到宿主细胞中的过程，它通常是利用哺乳动物质粒等载体将外源DNA片段植入到宿主细胞中。
(4) 转化：转化是植物细胞在受到DNA片段植入后，能够形成含有外源基因的植物的过程。
2、植物转基因技术的方法
(1) 诱导细胞抗性：植物转基因技术可以利用一些诱导剂，如多聚糖、双链RNA等，通过诱导植物细胞的自然抗性，让其增加免疫反应及抗外源性抗原的能力，从而提高转基因植物的转化效率。
(2) 共价结合技术：共价结合技术是一种利用化学方法将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用某种活性稀释剂将DNA片段与
植物细胞表面形成稳定的共价结合，从而使外源DNA片段能够植入宿主细胞。
(3) 转化抗性：转化抗性是一种利用抗生素来抑制植物细胞的自然抗性，从而促进植物细胞内部外源DNA的转化。
一般常用的抗生素有青霉素和环丙沙星。
(4) 小麦内含体技术：小麦内含体技术是一种利用小麦内含体将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用小麦内含体外质壁偶联（ECC）促进外源DNA的转化。
克隆和转基因关系的关系
克隆和转基因关系的关系
克隆和转基因是具有重要关系的分子生物学技术。
这两者均在生命科学领域有
重要应用。
从基因学层面来说，克隆技术涉及基因的复制，而转基因技术则是将基因转移到另一个非同源的表达体中。
因此可以说，克隆技术与转基因技术的根本区别在于基因的存储位置。
克隆技术是指通过改变或复制基因来影响生物体发育或功能的一系列技术。
在
该技术中，可以将一个细胞里的基因组复制给一个新的细胞（可能是大型有机体中的细胞或小型细胞，如细菌），从而获得相同基因组的繁殖体。
这种技术能够被用来创建新的种群（原为人工选择），或者用于获取具有某种基因表达的个体。
相比之下，转基因技术是一种基因工程的手段，用于改变一个生物的性状或行为。
它的操作原理是，先从一个物种中提取某个特定基因，再将其注入另一个物种，使其获得原物种所没有的某一特定能力。
转基因技术可以用来改变植物或动物的抗病虫性、抗药性和抗逆性，以及提高收获率和抵抗环境条件等性状。
例如，转基因技术可以用来生产保育型转基因植物，以增加农作物抗病虫性和耐旱性，减少农药的用量和污染。
从上述可以见，克隆技术主要对改变生物体的功能，而转基因技术则针对改变
某种特定性状，从而改变目标生物体的性状。
克隆是将一个细胞的基因复制到另一个细胞中，而转基因是将基因转移到非同源的表达体中，进而改变特定性状。
因此，克隆技术与转基因技术之间具有紧密的联系，但在研究和应用上又存在很大的差异。
它们在生物科学领域的应用十分广泛，在生物学和其他相关领域中都发挥了重要作用。
基因工程的基本过程
基因工程的基本过程介绍基因工程是一项重要的生物技术领域，它利用DNA重组技术，对生物体的基因信息进行修改和重新组合，实现改变生物体性状的目的。
基因工程的基本过程包括基因定位、基因克隆、基因表达和基因转导等步骤。
本文将详细介绍基因工程的基本过程。
一、基因定位基因定位是基因工程的第一步，通过确定目标基因在染色体上的位置，为后续的基因克隆提供准确的目标。
基因定位可以通过物理方法、遗传方法和分子生物学方法等多种手段来实现。
1. 物理方法物理方法主要包括荧光原位杂交（FISH）和比较基因组杂交（CGH）等。
其中，荧光原位杂交可以通过标记特定探针并与目标基因序列进行杂交，从而在染色体上检测到目标基因的位置。
比较基因组杂交可以通过将目标基因与参考基因组进行杂交，通过比较两者的杂交强度，确定目标基因在染色体上的位置。
2. 遗传方法遗传方法主要包括连锁分析和关联分析等。
连锁分析是利用基因在染色体上的连锁关系，通过研究特定遗传标记和目标基因之间的连锁程度，来确定目标基因在染色体上的位置。
关联分析则是通过研究染色体多态性和目标基因之间的关联程度，来确定目标基因与某个特定区域的关系。
3. 分子生物学方法分子生物学方法主要包括PCR、Southern blotting和DNA测序等。
PCR可以通过目标基因的序列信息，设计特定引物并进行扩增，从而实现对目标基因的定位。
Southern blotting可以通过转移DNA片段到膜上，并进行测序等。
二、基因克隆基因克隆是基因工程的关键步骤，它通过将目标基因从来源生物体中分离出来，并进行扩增，得到足够多的DNA材料用于后续的实验。
1. DNA提取DNA提取是基因克隆的第一步，它可以通过细胞裂解、溶解和沉淀等步骤将DNA从生物体中提取出来。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和商业DNA提取试剂盒等。
2. PCR扩增PCR扩增是基因克隆的关键技术，它可以通过DNA聚合酶的作用，将目标基因序列进行扩增。
转基因的原理
转基因的原理转基因技术是一种通过改变生物体的遗传物质，使其获得特定的性状或功能的技术。
它是现代生物技术中的重要组成部分，被广泛应用于农业、医学和工业领域。
转基因的原理主要包括基因克隆、基因导入和基因表达等过程。
首先，基因克隆是转基因技术的第一步。
科学家们通过分子生物学技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制出来，这个过程涉及到DNA的定位、切割、连接和复制等操作。
通过基因克隆，科学家们可以获取到目标基因的大量复制品，为后续的基因导入和表达奠定了基础。
其次，基因导入是转基因技术的核心环节。
一旦获得了目标基因的复制品，科学家们就需要将其导入到目标生物体的染色体中。
这一过程通常通过基因枪、细菌介导转化、病毒介导转化等方法实现。
一旦目标基因成功导入到目标生物体中，它就会与其它基因一起参与到生物体的遗传调控网络中，从而表现出特定的性状或功能。
最后，基因表达是转基因技术的最终目的。
一旦目标基因成功导入到目标生物体中，它就会在特定的条件下被激活并表达出来。
这一过程涉及到DNA的转录、翻译和后续的蛋白质合成等生物学过程。
通过基因表达，目标基因所携带的性状或功能得以在目标生物体中得以表现，从而实现了转基因技术的应用目的。
总的来说，转基因的原理主要包括基因克隆、基因导入和基因表达三个过程。
通过这些过程，科学家们可以实现对生物体基因的精准操作，从而获得具有特定性状或功能的转基因生物体。
转基因技术的应用不仅在农业领域可以提高作物的产量和抗逆性，还可以为医学和工业领域提供更多的可能性。
随着生物技术的不断发展，相信转基因技术将会发挥越来越重要的作用。
转基因方法
转基因方法一、基因枪法：1、综述：基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。
1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。
在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。
其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。
2、基本原理：其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。
微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。
根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。
塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。
当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。
其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。
第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。
其工作原理是把载有DNA 的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。
在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。
当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。
第三类是以高压放电为驱动力。
其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。
3、步骤：（1）微粒体的洗涤。
取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。
微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。
离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。
（2）DNA微粒载体的制备。
基因工程的基本技术路线
基因工程的基本技术路线在这个瞬息万变的科学时代，基因工程就像是开启了一扇通往未来的大门。
相信很多小伙伴对基因工程这个词不陌生吧？简单来说，基因工程就是通过各种技术手段对生物的基因进行改造，来达到我们想要的结果。
就好比是给你的手机换个壳，里面的系统不变，但外观却焕然一新。
今天就让我们轻松聊聊基因工程的基本技术路线，看看它究竟是怎么一回事！1. 基因克隆1.1 什么是基因克隆？基因克隆，听起来就像是“复制粘贴”的感觉，其实就是把一个特定的基因复制出来，搞个“一模一样”的版本。
为什么要这么做呢？因为我们需要研究基因的功能，或者用这些基因来生产某些有用的蛋白质。
比如说，科学家们可以通过克隆某种植物的抗病基因，来培育出更强壮的农作物，这样一来，农民的收成可就不愁了。
1.2 基因克隆的步骤那么，基因克隆的过程到底是怎样的呢？这可是个不小的工程，首先得找出我们想要克隆的基因。
这个过程就像是在找一颗针掉在了大海里，得小心翼翼才能找到。
找到之后，我们就会用酶把这个基因从DNA中剪切出来。
接下来，将它插入到一个载体上，这个载体就像是一辆小车，能把基因送到合适的地方。
最后，把载体放入细胞里，让它在细胞中复制，等时间一到，我们就能收获一大堆“克隆版”基因了。
2. 基因编辑2.1 CRISPR技术说到基因工程，基因编辑就不能不提！现在最流行的编辑工具就是CRISPR了，听起来酷吧？CRISPR就像是一个超级精准的剪刀，可以在特定的地方“剪”掉或“插入”基因。
这种技术的出现，真是让科学家们欢呼雀跃。
想象一下，我们可以直接对植物的基因进行修改，让它们更耐旱、抗虫害，种地的成本一下子就降下来了。
2.2 基因编辑的应用基因编辑的应用简直是无穷无尽！不光是农作物，动物也能受益。
比如说，科学家们可以编辑小猪的基因，让它们长得更快、更健康，简直是“猪界超模”。
再比如说，人类基因组的研究，甚至可以帮助我们治疗某些遗传病，真是“扭转乾坤”的好技术。
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因一、基因克隆及转基因过程1、设计引物软件是，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。
一般原则：1、长度：18-25；2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%；3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大于5；4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A；5、正反向引物连续配对数小于4；6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何；（如果克隆的话不能满足条件也没办法。
）不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。
步骤：一、打开PrimerSelect和EditSeq。
二、在EditSeq中输入你的序列。
引物有一对F和R1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。
2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。
3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。
、4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。
可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R 在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。
5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。
6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。
7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。
转基因产品中常见外源基因的克隆与转化-食品科学网
97※基础研究食品科学转基因产品中常见外源基因的克隆与转化邵碧英，陈文炳，杨 婕，江树勋，李寿崧(福建出入境检验检疫局，福建 福州 350001)摘 要：设计带不同酶切位点的引物，分别用PCR 扩增植物内源rbcL 基因和2种转基因产品中常见的外源基因－CP4-EPSPS 基因和BAR 基因，并分别与pGEM-T Easy Vector 连接，克隆到大肠杆菌DH5α中。
提取克隆菌落的质粒，并进行酶切鉴定和序列测定。
对3个基因的克隆质粒进行相应的双酶切，回收酶切产物，先后转化到受体载体p C A M B W 中。
最后获得的重组质粒的酶切和P C R 鉴定结果表明3个基因已被成功转化到受体载体中。
关键词：转基因产品；外源基因；克隆；转化Cloning and Transforming of the Universal Exogenous Genes in Genitically Modified ProductsSHAO Bi-ying ，CHEN Wen-bing ，Yang Jie ，JIANG Shu-xun ，LI Shou-song(Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)Abstract ：The primers with different enzyme sites were designed, and the plant endogenous rbcL gene and two kinds of universal exogenous CP4-EPSPS gene and BAR gene in genetically modified products were expanded by PCR respectively. The PCR products were ligated with pGEM-T Easy Vector, then cloned into E.coli strain DH5α. The clone plasmids of the 3 genes were extracted, then analysed with restriction enzyme and sequenced respectively. The enzymed products of the 3 clone plasmids cut by two corresponding restriction enzyme were recovered, and transformed into the received carrier pCAMBW one after the other. The restriction enzyme analysising and PCR detection results of the recombinant plasmid obtained finally showed that the 3 genes were transformed successfully into the received carrier.Key words ：genetically modified product ；exogenous gene ；clone ；transform中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)11-0097-04收稿日期：2006-08-09基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技项目(2005IK006)作者简介：邵碧英(1973-)，女，高级工程师，博士，主要从事转基因产品和动物产品的分子检测与科研。
分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
转基因技术发展史
转基因技术发展史转基因技术是现代生物学技术的代表，其发展历程涵盖了许多关键的技术突破和里程碑。
以下是对转基因技术发展史的全面概述，主要从基因克隆技术、基因转移方法、基因表达调控、转基因生物安全性、转基因技术的应用领域、转基因技术的未来发展以及转基因技术的社会影响等方面进行阐述。
一、基因克隆技术基因克隆技术是转基因技术的基础，它使得科学家能够识别、分离和复制特定的基因。
该技术的出现，使得科学家可以精确地操作DNA，从而实现对生物体的遗传改良。
二、基因转移方法基因转移是实现转基因技术的关键步骤。
目前，已经发展出了多种有效的基因转移方法，如质粒转化、微注射、基因枪、农杆菌转化等。
这些方法的不断改进和优化，使得科学家能够更高效地将外源基因导入到生物体中。
三、基因表达调控基因表达调控是转基因技术的另一个重要组成部分。
通过调控外源基因的表达，科学家可以实现对生物体的遗传特性的精确控制。
这包括启动子的选择和改造、增强子和抑制子的应用等。
四、转基因生物安全性转基因生物的安全性是公众关注的焦点之一。
科学家在发展转基因技术的同时，也致力于评估转基因生物的安全性。
至今，大量的研究已经证明，经严格评估的转基因食品在安全性上与传统的育种技术没有显著差异。
五、转基因技术的应用领域转基因技术的应用领域非常广泛，涵盖了农业、医药、工业和基础研究等多个领域。
在农业方面，转基因技术被用于改善作物的抗性、产量和营养成分。
在医药方面，该技术被用于生产重组蛋白药物、基因治疗和疫苗等。
在工业方面，转基因技术被用于生产生物燃料、工业酶和化学品等。
此外，该技术在基础研究中也被广泛应用，如用于研究基因功能和生物进化等。
六、转基因技术的未来发展随着科技的不断进步，转基因技术也在不断发展。
未来，该技术有望在以下几个方面取得更大的突破：1）提高外源基因的表达水平；2）开发更加高效的基因转移方法；3）探索新的基因编辑技术；4）利用人工智能和大数据技术优化转基因作物的设计和改良等。
转基因知识点总结
转基因知识点总结一、转基因技术的原理转基因技术是通过将外源基因导入目标生物体的染色体中，使其表现新的特性或功能。
这个过程包括以下几个步骤：基因的识别、克隆、导入、筛选和鉴定。
1. 基因的识别首先，科学家们需要从外部环境中寻找到与目标特性相关的基因。
这个基因可能来源于其他生物体，也可以是由人工合成的。
一旦找到了合适的基因，就需要对其进行分离和纯化，以便进一步的操作。
2. 基因的克隆接下来，科学家们需要复制这个基因，以便在后续的实验中进行操作。
这个过程通常通过PCR（聚合酶链式反应）或者其他克隆技术来实现。
一旦得到了足够多的基因拷贝，就可以进行下一步的操作。
3. 基因的导入在得到了目标基因的大量拷贝之后，科学家们需要找到一种途径将其导入到目标生物体的染色体中。
这个过程通常通过质粒导入、病毒感染、基因枪法等技术来实现。
一旦成功地将基因导入到目标生物体中，就需要进行后续的筛选和鉴定。
4. 基因的筛选和鉴定一旦将外源基因导入到目标生物体的染色体中，就需要进行筛选和鉴定，以确认目标基因已经被成功导入并发挥了预期的功能。
这个过程通常通过PCR、Southernblotting、Northernblotting等技术来实现。
一旦确认了目标基因已经被成功导入并表现了预期的功能，就可以进行后续的实验。
二、转基因技术的应用转基因技术在农业、医学、工业等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，转基因作物可以抗病虫害、耐逆境、提高产量、改良品质等方面有着显著的优势；在医学领域，转基因技术可以用于治疗疾病、生产药物、疫苗等方面；在工业领域，转基因微生物可以生产生物燃料、化工产品等。
总的来说，转基因技术为人类的生产生活带来了诸多益处，同时也带来了一些新的问题和挑战。
1. 农业转基因作物可以抗病虫害、耐逆境、提高产量、改良品质等方面有着显著的优势。
比如，转基因水稻可以抗虫、耐盐碱、提高产量；转基因玉米可以抗虫、耐除草剂、提高产量；转基因大豆可以抗除草剂、提高产量等。
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程主要包括以下步骤：
1. 选取目标基因并克隆
根据需要改良的性状选取对应的基因，并利用分子生物学技术从已知的基因库中克隆出该基因的DNA序列。
2. 构建基因载体
基因载体是将外源基因导入目标细胞中的工具。
将已克隆好的目标基因插入基因载体的适当位点，并加入一些必要的辅助元件（如启动子、终止子和激活子等）来调控基因的表达。
3. 转化植物细胞
把构建好的基因载体经过化学方法或物理方法导入目标植物细胞中，使其成为转基因细胞。
4. 筛选转基因植物
利用特定筛选工具（如抗生素抗性或苯丙烯酰胺酶等）来区分转基因细胞和非转基因细胞，从而筛选出转基因植物。
5. 鉴定转基因植物
采用多种方法（如PCR、Southern blot、Northern blot等）来验证转基因植物中是否成功导入了目标基因，并确定其正确性
和表达级别。
参考资料：
1. 罗欣. 十五种转基因植物的制备方法和应用. 生物工程学报, 2007, 23(9): 2247-2254.
2. 陆典昭, 龙光. 植物转基因技术的研究现状及展望. 科技信息, 2018, 33(34): 160-162.
3. 王若荃, 王磊. 植物转基因的技术流程及其应用研究进展. 河南农业科学, 2012, 41(11): 2-6.。
蜜蜂遗传育种新技术（一）——蜜蜂转基因与克隆
３４APICULTURE OF CHINA蜜蜂遗传育种新技术（一）——蜜蜂转基因与克隆薛运波│文 李志勇│图育微课堂种1.蜜蜂转基因技术蜜蜂转基因育种（transgenic breeding）是通过基因工程技术将外源目的基因导入受体细胞，整合到受体细胞基因组中，并使外源基因得到表达和遗传，以此获得新品种。
该技术的根本意义在于它克服固有的生殖隔离，实现物种间遗传物质的交换，在改良蜜蜂抗病和经济性状以及生物反应器利用等方面展示了良好的应用前景。
自从1982年成功研究出首例转基因果蝇以来，转基因昆虫的研究便引起科学家们极大的兴趣。
目前，已经获得成功的转基因昆虫有黑腹果蝇、海地果蝇、地中海实蝇、家蚕、蚊子等。
鉴于蜜蜂特殊的社会行为和级型分化现象，有学者认为以下两种方法是蜜蜂转基因较好的途径：一是以蜜蜂人工授精技术为基础的精子介导转基因法，二是蜜蜂卵或幼虫的转基因操作与蜜蜂人工孵育技术相结合的方法。
（1）精子介导转基因法1971年，Brackett 等发现精子细胞具有自发地吸收外源DNA，并可在受精的过程中将外源DNA 携带进卵内。
用精子作为转移外源DNA 的载体，将DNA 溶液和动物精子共浴，精子能主动吸附外源DNA，利用这一点可以很容易地将外源DNA 导入精子细胞或结合于精子细胞表面。
再通过人工授精，将外源DNA 带入受精卵进而发育成个体（图1），从而生产转基因动物。
利用精子介导的转基因蜜蜂的研究也有成功报道。
1991年，Atkinson 等首次将蜜蜂精子与外源DNA 进行共培养，证实蜜蜂精子也能够吸收其他动物的DNA。
2000年，Robinson 等研究精子介导转染法用于蜜蜂转基因的可行性。
结果表明，蜜蜂精子能将外源线性质粒DNA 携带进入卵子，外源DNA 能在受体蜜蜂个体中存在数月之久，能在幼虫期进行表达，至少能稳定遗传三代。
尽管没有找到外源DNA 整合到蜜蜂基因组上的证据，但该研究证明蜜蜂精子同样具有携带外源DNA 进入卵子的能力。
转基因包括人工转基因和自然转基因原理
转基因包括人工转基因和自然转基因原理
人工转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，使之稳定遗传与表达。
自然转基因：自然界自发的基因在不同动物或植物间的转移现象。
动物克隆即是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术，即通过核移植生产遗传结构与细胞核供体动物相同的动物个体的过程。
转基因技术要点
1、目的基因的获得
2、目的基因重组质粒的构建
3、受体材料的选择
4、转基因方法
克隆技术要点：概括起来说主要有两类：
第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。
核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆是一种用于从转录组数据中克隆基因的方法。
以下是一般的步骤：
1. 获得转录组数据：通常通过 RNA 测序（RNA-seq）技术获得转录组数据。
这些数据提供了有关细胞或组织中表达的所有 RNA 分子的信息。
2. 筛选目标基因：根据研究的目的，从转录组数据中筛选出感兴趣的目标基因。
这可以基于特定的表达模式、功能注释或其他相关的生物信息学分析。
3. 设计引物：针对目标基因的序列，设计特异性的引物用于 PCR 扩增。
4. PCR 扩增：使用设计的引物，从转录组数据对应的 cDNA 文库中进行 PCR 扩增。
这将产生目标基因的特定片段。
5. 克隆和测序：将 PCR 扩增的产物克隆到适当的载体中，并进行测序以确认所克隆的序列的准确性。
6. 功能分析：对克隆的基因进行进一步的功能分析，例如表达分析、蛋白质表达和功能研究等。
需要注意的是，转录组序列基因克隆的成功与否取决于许多因素，包括转录组数据的质量、引物的设计、PCR 条件等。
在进行该方法之前，建议对相关技术和实验步骤有一定的了解，并根据具体情况进行优化和调整。
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基因克隆及转基因
一、基因克隆及转基因过程
1、设计引物
软件是sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。
一般原则：1、长度：18-25；
2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%；
3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大
于5；
4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A；
5、正反向引物连续配对数小于4；
6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何；
（如果克隆的话不能满足条件也没办法。
）
不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。
步骤：
一、打开PrimerSelect和EditSeq。
二、在EditSeq中输入你的序列。
引物有一对F和R
1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。
2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。
3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。
、
4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。
可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。
5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。
6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。
7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。
在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。
一般在引物上游还要加上两个保护碱基。
2、提取醋栗DNA
3、PCR扩增与目的基因回收
PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。
回收完可以再跑电泳检测一遍。
PCR：
20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul；
2.5mMdNTP2.0ul；
10乘Taq buffer2.0ul；
引物F、R各0.5ul；
模板1ul；若为质粒0.5ul就够；
最后加入Taq酶0.2ul，Taq酶现用现拿。
过程：我们用的是预变性94℃3min；
然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性94℃30s，退火退火温度下30s，延伸72℃时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s 可以延伸1kb；
循环完成后，此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72℃延伸；
最后4℃保存待用。
4、双酶切
回收没问题就将回收的目的基因和表达载体质粒进行双酶切。
目的基因回收完可以直接用试剂盒提纯，因为就切下来很少的几个碱基，试剂盒柱上挂不住。
表达载体质粒酶切完要琼脂糖凝胶回收，回收大的片段。
回收完检测一遍。
4、连接
5、大肠杆菌转化
大肠杆菌感受态用的是DH5α。
步骤：
（1）打开42℃水浴锅。
（2）把感受态放在冰上化，不能放太久，，将质粒（连接产物）加感受态细胞50ul，指尖混匀。
（3）在冰上放30~40min。
（4）90s严格计时，放入水浴锅热激（42℃），之后立即放冰上1~2min，之后加入500ul 纯净LB液体培养基（37℃最好），混匀。
（5）放入37℃摇菌箱，45min~1h（180~200rpm）（这一步的目的是菌恢复活性）。
（6）离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素的固体培养基）。
（7）放入37℃培养箱，倒置。
涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。
7、挑菌及摇菌
长出单菌落后，超净工作台里挑菌，将菌挑在20ul的灭菌水中作为模板进行菌落PCR。
将检测没问题的菌进行摇菌。
摇菌步骤：把菌液分别倒入摇菌管中（10ml的摇菌管），再加入4mlLB液体培养基，加入4ul卡那（始浓度50mg/ml，终浓度50mg/L），放入摇床中（37℃）过夜摇菌。
8、保菌及提质粒
将摇的菌在超净工作台里分为三部分：
（1）保菌：500ul菌+500ul 50％甘油，混匀，放入-80℃超低温冰箱保存，备用；
（2）测序：1ml菌用于测序；
（3）提质粒：剩下的菌用试剂盒提质粒。
有时也送一部分提的质粒去测序。
9、农杆菌转化
没问题的质粒转入农杆菌感受态细胞（EHA105），步骤：
（1）打开37℃水浴锅；
（2）取2ul质粒+50ul或100ul感受态细胞，冰上放置30min；
（3）液氮中冷冻1min；
（4）37℃水浴溶化细胞；
（5）加500ul~1ml纯净LB液体培养基，混匀；28℃摇床培养2h（180~200rpm）；
（6）离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素+Rif抗生素的固体培养基）。
（7）放入28℃培养箱，倒置，培养2~3天。
涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。
10、挑菌及摇菌
挑菌及菌落PCR同7。
摇菌时加4ml LB液体培养基，4ul Kan，8ul Rif。
摇菌大约40多小时。
（此步为小摇）11、保菌
将摇的菌取500ul+500ul 50％的甘油保菌。
再用大三角瓶进行大摇，摇菌取1ml菌液+100ml LB液体培养基+100ul Kan+200ul Rif，过夜摇菌。
12、配侵染液
侵染步骤参考论文优化而来。
（1）配侵染液200ml：5％蔗糖，0.02%L-77（有剧毒），有点难溶；
（2）大摇后的菌液测OD，要在0.8~1.0之间，高于这个值时死菌过多，侵染成功率低；
（3）将菌液倒入大点的离心管离心；
（4）倒掉上清，用枪把残余的上清吸净，加入少许（4、5ml）侵染液，用枪把菌打散打匀，倒入瓶中。
13、侵染
铁托盖上报纸，润湿，需用到黑塑料袋，戴上手套。
选择花骨朵多的拟南芥，不是花开的多的，要没开的多的拟南芥，用于侵染的拟南芥一般是四株长在一个小花盆中。
将所有花全泡到侵染液中，所有花均需沾湿，漏在外面的花用戴手套的手弄湿，泡2min 即可（注意不要沾到土，否则植物会死）。
然后将植株迅速平躺放到铁托中，用黑报纸盖住。
最后暗处理24h，第二天拿出来后正常培养。
注意：用于侵染的液体有菌和毒，避免碰到身上。
用于摇菌的瓶子，侵染的瓶子都要高温灭菌；用于装侵染液的瓶子最好用84消毒，要不用洗洁剂也行。
到这时就完成整个转基因过程了。
14、收种子
侵染后的植株看做T0代，侵染后1个月收种子，侵染后40天收第二批种子，但第一批最主要。
是将种子收到1.5ml离心管中，晒干7~10d才能种。
15、筛选T1代
将种子铺到加入抗生素卡那和头孢的MS固体培养基中。
步骤：
（1）将种子放入中等EP管（10ml）中。
加满消毒液（0.5%SDS，0.8%NaClO3），手摇振荡15min。
（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，振荡洗涤，将种子完全打散。
（3）大离心机离心（3000g for 2min at 20℃），要用大摇菌离心管做载体，不然离心管
盖会打开。
在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，这样共洗5次。
（4）加入琼脂糖悬浮种子，倒在或用枪打在板上，一个板3ml，涂匀，停几分钟，等水被板吸干后再封膜。
（5）暗处理春化3d。
每个板长的苗不一定多，有的可能就一两株活的，然后可以把活的苗在移到一个新的MS板上，长到可以时移到土中培养。