动物细胞大规模培养技术研究进展

仲恺农业技术学院学报,18(3):64~70,2005

Jou r na l o f Zhongkai University o f Agriculture an d Technology

文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07

动物细胞大规模培养技术研究进展

吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张涌3

(1.西北农林科技大学植物保护学院; 2.西北农林科技大学生命科学学院;

3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100)

摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景.

关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体

中图分类号:Q251文献标识码:A

Research advance in large-scale culture of animal cells

W U Fang-li1,JIN We-i bo2,W ANG Bao-li2.3,ZHANG Yong3

(1.College of Plant Protection; 2.College of Life Sciences; 3.Institute of Bio-Eng i neering,

Northwest A&F University,Yangling712100,China)

Abstract:Many biological products were manufactured by means of large-scale culture of animal cells.To increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density.Biore-ac tors with simple manipulation,good qualification and aeration were adopted.More suitable conditions for cell gro wth could be given through on-line supervising the environment for cell gro wth and restraint factors in cell culturing.Furthermore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.Porous microcarriers was emphasized in large-scale culture of animal cells.

Key words:animal cell;culture environment;bioreac tor;microcarrier

组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上.

在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化.

收稿日期:2005-04-18

基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目.

作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.

1 细胞最适生长培养基的选择

培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素.一般情况下,动物细胞的生长均有赖于血清的存在.但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端[1],给生物制品的生产造成了不便,这就引发了人们对无血清培养基的研究.结果发现,只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等,多种细胞即可在无血清供应的情况下生长[2],尤其是中华仓鼠卵巢(Chinese ha mster ovary,C HO)细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等,其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽.C HO 细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代[3].在人类细胞培养中,某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍.另外,应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长.应用无血清培养基培养动物细胞的成功,还将为某些痘苗的生产降低成本[4].目前,大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基,从而避免了血清培养基污染的可能性,并减少了纯化的难度.但无血清培养基缺乏广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血清培养基配方.如用于基因重组促人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin,r HuEPO)生产且不含牛血清白蛋白的无血清培养基-p (Serum free medium -p,SFM -p)培养液,就是在达尔贝可改良的伊格尔(Dulbecco p s modified Eagle p s medium,DME M)B F12(1B 1)培养基中添加了Se 、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子等成分构成的专用培养基[5].

无血清培养基虽然在各个方面都显示出其强大的优势和发展前景,但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中亟待解决的问题.在培养基中加入某些化合物,如金精三羧酸(Aurint ricarboxylic acid,ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡[6]

.但是,由于培养基中所添加的蛋白成分主要还是来源于动物或人,仍然存在病毒污染的危险,只有完全采用非动物来源的材料,才是相对安全的,而植物提取物将是理想的选择.可以这样预测,未来开发的新一代无血清培养基,将是一种既无血清、无蛋白,又可以高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基[7].2 生物反应器的选择

在生物制品生产中,动物细胞培养已越来越重要,而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器(也称动物细胞发生器)[8~10].由于动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)在促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)、干扰素(Interferon,IFN)、尿激酶原(Pro -Urokinase,Pro -UK)、疫苗以及其他一些价值昂贵的生物制品的生产上具有独特的优势,因此近年来有关动物细胞生物反应器的研制进展迅速[11~

13].目前国内外

生物反应器的种类较多,应用于生产实际的也不少,概括下来主要有以下几种:

211 机械搅拌式(Spinner)生物反应器

机械搅拌式生物反应器是开发较早、应用较广的一类生物反应器,主要由培养罐、管、阀、泵、马达及仪表组成.培养物的混匀由马达带动的不锈钢搅拌系统实现,在罐体顶端还有一些传感器,可以连接监测培养物的温度、pH 值溶氧度(Dissolved oxygen,DO)、葡萄糖消耗、NH 3、NH 4+等参数.这种反应器培养规模可达2000L,若再配合微载体、多孔微球、灌注技术,可使细胞密度达到107/mL 以上,而且消毒方便.另外,其最大的优点是能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合工厂化生产,但不足之处是机械搅拌所产生的剪切力对细胞有一定的损伤[14,15].

212 气升式(Air lift)生物反应器

气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管,使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环.它在结构上和搅拌式大同小异,其显著特点是用气流代替不锈钢叶片进行搅拌,因而产生的剪切力相对温和,对细胞损伤较小[16].英国Celltech 公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,该公司在1985年应用100L 气升式生物反应器对杂交瘤65第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展