动物细胞大规模培养技术研究进展
动物细胞培养技术研究的现状与思考
37第12卷 第11期 2010 年 11 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 12 No. 11 Nov .，2010组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907年美国生物学家Harrison [1]在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从体内组织取出细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。
这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。
特别是随着近年来现代生物科学领域的迅速拓展，各种分子生物学实验诸如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。
然而，在种类繁多的动物世界里，细胞培养实验技术的发展并不均衡，构建动物细胞培养体系的研究效率和效果上也存在较大的局限性。
因此，文章对国内外动物细胞培养技术相关的研究动态进行了系统地分析和思考，为相关研究者提供参考依据，同时也是本课题组对将要开展的参环毛蚓细胞培养体系研究进行必要的前期准备。
1 无脊椎动物细胞培养现状及应用无脊椎动物包括多孔动物门、腔肠动物门、环节动物门、节肢动物门、软体动物门和棘皮动物门。
无脊椎动物的细胞培养研究起步晚于哺乳动物，由于无脊椎动物细胞在形态、结构和功能以及营养需求等方面的特殊性，其细胞培养多停留在原代培养和有限细胞系水平上[2-3]。
迄今为止没有建立起永生性的细胞系，但随着对某些低等无脊椎动物如海绵的天然活性产物的开发，以及人工养殖虾贝类病害防治等研究的需要，无脊椎动物细胞培养将会受到关注。
1.1 多孔动物门 多孔动物又称海绵动物（Spongia），主要代表有毛壶和浴海绵，是多细胞动物中最低等最原始的一类，只有细胞分化，没有真正的组织。
1993年Klautau [4]多次尝试了对海绵细胞的体外培养，因后来被鉴定是污染的原生动物细胞。
细胞培养生物论文2000字_细胞培养生物毕业论文范文模板
细胞培养生物论文2000字_细胞培养生物毕业论文范文模板细胞培养生物论文2000字(一)：探析大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的运用进展论文摘要：探析大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的方法进行分析，主要包含空心纤维法、微囊法及微载体法，且结合大规模动物细胞培养技术的应用特点，提出大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品中应用的工艺选择方式，以期能够真正发挥大规模动物细胞培养技术的应用优势，为现代兽用生物制品的运用与发展奠定良好基础。
关键词：大规模动物细胞培养技术；兽用生物制品随着现代医学的快速发展，大规模动物细胞培养技术逐渐在医学研究、生物学研究中得到推广应用，在各类大规模生产中得到推广应用。
当前大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品制作方面应用的价值较高，但是由于受到传统工艺技术的影响，总体的应用效果还会受到较大影响。
动物细胞培养技术在兽用生物制品运用中的应用，能够提升培养的技术水平，优化细胞培养的环境，且有助于转变细胞培养的特性，对现代兽用生物制品产业技术的发展能够产生重要影响。
文章将结合当前兽用生物制品的研究现状进行分析，希望能够对相关研究活动带来一定借鉴价值。
1大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品中应用的方法动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养与悬浮培养的基础上，将早期流式细胞培养技术融入其中，充分发挥生物技术应用的价值。
纵观当前大规模动物细胞培养技术的应用现状，其技术具体包含空心纤维法、微囊法以及微载体法。
1.1空心纤维法空心纤维法最初所应用的纤维为醋酸纤维素与硝酸纤维素组合而成，作为具有透过性特点的滤膜，其外径约在1/3～3/4mm之间，表面存在诸多海绵孔结构，水分、气体以及营养物质等能够从此经过，且贴附其上进行生长。
培养期间培养系统主要是由3～6层空心纤维构成[1]。
大规模动物细胞培养期间，可以将其种在空心纤维外腔。
在培养一段时间之后，细胞能够达到一定的密度，细胞不会继续增长，但是能够持续进行分泌，保证其蛋白质与各类生物物质的需求。
哺乳动物细胞大规模培养技术方面的研究及进展
哺乳动物细胞大规模培养技术方面的研究及进展摘要：哺乳动物细胞的培养与生物科技的发展有着密切的联系，已经被广泛地用于生物学、医学的研究和应用领域中。
本文将会对各种影响细胞培养的因素以及微载体和生物反应器在哺乳动物细胞大规模培养上的应用做一个回顾。
关键词：哺乳动物细胞, 培养, 微载体 , 生物反应器Research Progress on the Large-scale Culture Technologyof Mammalian CellCuijiali(the college of life science，grade 6，bioengineering，20072502529、510630) Abstract:The culture of mammalian cells is closely related to the development of biotechnology, which has been used extensively in the research and application fields of biology and medical science． In this article, various factors affecting cell cultivation and the application of microcarrier and bioreactor on large—scale culture of mammalian cells were reviewed．介绍自从1907年Harrison在试管中培养蝌蚪的神经组织成功以后(1), 细胞培养技术就被广泛地应用到生物医学领域的研究及应用中。
现在，细胞培养技术已经在细胞工程、酶工程、发酵工程、尤其遗传工程的发展中扮演着重要角色（2-3)。
本文将陈述关于哺乳动物细胞大规模培养的相关技术的研究进展。
动物细胞培养技术的研究现状和前景
动物细胞培养技术的研究现状和前景动物细胞培养技术是一项重要的生物技术，通过无菌操作将动物细胞培养在适当的培养基中，可以获得大量纯化的细胞、细胞器和生物制品，被广泛应用于生命科学、疾病研究和药品生产等领域。
本文将介绍动物细胞培养技术的研究现状和前景。
一、动物细胞培养技术的发展历程动物细胞培养技术起源于上世纪50年代，随着无菌技术和培养基的不断改进，动物细胞培养技术得以飞速发展。
1961年，美国学者Eagle首次提出了MEM培养基，可以支持多种细胞的生长和分裂，成为现代动物细胞培养的基础。
20世纪70年代，出现了断头草胚胎细胞、合成肝素生产细胞、丝裂素等细胞系，使用纯化技术获得大量细胞产物。
随着基因工程、克隆技术的发展，人们对细胞培养技术的需求也更加迫切，培养技术也得到了进一步的发展。
二、动物细胞培养技术的应用领域1. 细胞学研究动物细胞培养技术为细胞生长、分裂和传代提供了良好的条件，可以用于生物学、医学、药学等多个领域的细胞学研究，例如细胞遗传学、细胞生理学、细胞生物学等方面的研究。
2. 疾病研究动物细胞培养技术在疾病研究中具有重要的作用。
通过培养某一疾病的细胞，可以研究该疾病的病理机制和治疗方法。
例如，培养癌细胞可以研究癌症的发生和治疗。
3. 生物制品研发动物细胞培养技术可以大量生产具有生物活性的蛋白质、酶、抗体和疫苗等生物制品。
例如，利用CHO细胞或HEK293细胞表达可溶性蛋白，或利用CHO细胞表达单抗和Fc融合蛋白，都在药品生产中得到广泛应用。
三、动物细胞培养技术的研究进展1. 三维培养技术传统的动物细胞培养技术通常采用二维培养方式，细胞长期生长在平坦的表面上，存在许多限制。
三维培养技术可以让细胞在三维环境中生长，更接近自然情况。
三维培养技术可以在细胞核、蛋白质和代谢等方面呈现更真实的情况，更适合生物学和医学方面的研究。
2. 纳米技术和微流控技术纳米技术和微流控技术可以为细胞培养提供更优化的环境。
动物细胞规模化培养及生物反应器研究进展.
动物细胞规模化培养及生物反应器研究进展.动物细胞规模化培养及生物反应器研究进展郑朝朝(瑞普(保定生物药业有限公司河北保定 071000哺乳动物细胞培养已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化生产。
许多生物活性物质、疫苗、载体、药用蛋白,等都可以通过动物细胞大规模培养获得。
生物反应器是细胞大规模培养的关键, 其能够有效的增加细胞单位体积的培养密度, 从而为病毒性疫苗大规模生产奠定坚实的基础。
通过细胞培养生产生物制品既能提高生物制品的质量, 又能促进细胞培养技术、蛋白质表达纯化技术、病毒培养技术等的发展。
细胞生理功能的研究、培养基的优化、生物反应器的改进、微载体的改良等技术都是提高细胞源性产品质量和数量的关键因素。
1、规模化培养哺乳动物细胞的影响因素哺乳动物细胞没有细胞壁,因而较之微生物与植物细胞更脆弱更容易死亡,机体外培养时不但生长缓慢, 而且对培养条件的要求很高, 而高密度细胞培养时生物制品和疫苗工业化生产降低成本和提高产品质量的最关键技术之一。
大规模细胞培养过程中存在许多影响细胞生长和增殖的因素, 如PH 、温度、营养成分、溶解氧量、细胞代谢产物、生长因子、细胞外基质、细胞外剪切力和细胞凋亡等等。
在细胞培养过程中,随着培养及营养物质的消耗、代谢产物的集聚,细胞生长速度会受到抑制, 因此就需要精确调节细胞各种培养参数维持细胞快速增长, 防止细胞凋亡。
氧气难溶于培养基但又是动物细胞生长所必须的, 而且细胞代谢所产生的二氧化碳超过一定浓度就会抑制细胞生长[5]。
所以在规模化细胞培养过程中增加氧传递和降低二氧化碳集聚就显得尤为重要,生物反应器可以通过通风和灌注等方式使氧传递和二氧化碳清除达到一定的平衡,同时补充培养基中营养物质,清除其他代谢产物,优化细胞培养环境,有效提高产品质量。
2、多种生物反应器动物细胞的大规模培养需要特殊的生物反应器。
与微生物和植物细胞不同, 动物细胞的外层是质膜,脆性大,在反应器中务必减少剪切力。
动物细胞大规模培养技术
大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。
第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。
随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。
自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。
动物细胞培养技术研究进展
动物细胞培养技术研究进展（张云生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100）[摘要]:动物细胞培养是生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，可分为原代和传代培养，有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。
细胞生长具有特殊的生物学性质，需要无菌、恒温和充分的营养环境。
动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。
[关键词]:细胞培养；微载体；中空纤维；微囊；生物反应器1885年，W Roux尝试使组织离体培养,被认为是组织细胞培养技术的萌芽； 1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。
此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养(Animal cell culture)的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。
利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合(Cell fusion) 、细胞杂交(Cell hybridization)以及转基因(Transgene)技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分[1]。
1 基本概念[1,2 ]细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。
从体内取出细胞首次培养即为原代培养( Primary Culture)，这是细胞培养的最初和必经阶段。
当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养( Subculture)。
根据原代培物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系( Cell line)或细胞株(Cell Strain)。
动物细胞培养技术研究进展
动物细胞培养技术研究进展动物细胞培养技术是一门综合性强的学科，它不仅包括生物学、细胞生物学、分子生物学等诸多学科，还涉及到化学、物理等多学科交叉的内容。
在现代医学、化学、农业、生命科学等领域中，动物细胞培养技术已经成为一项非常重要的研究手段，因为它可以体外培养和控制动物细胞的生长繁殖，实现对细胞的操纵和操作，从而为后续的研究提供可靠的实验数据和重要的基础所需。
在这篇文章中，我们将介绍动物细胞培养技术的研究进展，使大家更深入了解这项技术的应用现状和未来发展方向。
1. 动物细胞培养技术的研究历程动物细胞培养技术的发展历程可以追溯到上世纪50年代初。
当时，由于缺乏有效的细胞培养方法，科学家们往往需要靠体内实验来探究有关细胞的生长、分化以及不良环境对其的影响等问题。
随着技术的发展，人们开始尝试体外培养细胞，但由于缺乏足够的培养和管理经验，取得的结果并不理想。
直到上世纪60年代，动物细胞培养技术才真正地开始发展。
1962年，GailR.Martin博士首次成功利用培养出的哺乳动物细胞来生成淋巴细胞，从而奠定了动物细胞培养的基础工作。
此后20年间，科学家们陆续发展出了多种先进的细胞培养技术，并利用这些技术来解决各种实际问题，如生物病毒的生产、细胞外表达系统的建立等。
2. 动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用领域非常广泛，其中最为重要的应用之一是生物药物的制造。
由于许多药物是由动物细胞产生的蛋白质或抗体制成的，因此动物细胞培养技术已经成为制造生物药物的主要手段之一。
此外，动物细胞培养技术还可以用于基础医学研究和生物学研究。
在这些领域中，研究人员可以通过体外培养细胞来模拟不同的环境，以便深入地研究细胞的各种生理和病理过程。
同时，还可以通过细胞培养技术来开发新型的治疗方法，并为人们提供更好的医疗条件。
3. 动物细胞培养技术发展的挑战虽然动物细胞培养技术已经有了很长的发展历史，并取得了很多成果，但同时也面临着许多挑战。
动物细胞培养技术的研究和发展
动物细胞培养技术的研究和发展动物细胞培养技术是现代生命科学领域中的重要研究方法之一。
它是指将动物细胞从活体中分离出来，通过控制培养条件，在培养皿中提供必要的培养基和生长因子，使其在体外长期存活、繁殖和分化，并用于细胞或组织工程、药物筛选、基因编辑等方面的研究和应用。
动物细胞培养技术的历史可以追溯到上世纪初期，当时主要用于探索组织器官的形成与发育。
在此基础之上，研究者逐渐发现，细胞培养不仅可以实现细胞的生存和增殖，还可以应用于人类健康疾病的治疗和预防。
因此，动物细胞培养技术得到了全球研究者的广泛重视和发展。
最初的动物细胞培养技术，是通过为培养细胞提供适宜营养物质的液态培养基，将分离的细胞酿造在培养皿中，此时细胞将进入一种与体内相似的环境中，能够进行正常的生长和繁殖。
到了上世纪50年代之后，培养基的配方和质量得到了长足发展，不断涌现出新的培养基。
此外，微分离和酶消化等新的细胞分离技术也相继应用，提高了动物细胞培养技术的效率和成功率。
近年来，随着生物技术的迅速发展，动物细胞培养技术得以广泛应用于生物医药、生物材料、组织工程等领域。
其中，细胞工程技术和组织工程技术是近年来特别受到关注的两个研究领域。
因为这些技术可以通过体外培育来获取人体组织和器官，对人类健康疾病的治疗和预防产生重要影响。
动物细胞培养技术在细胞工程领域的应用主要包括：基因工程、蛋白质工程、免疫细胞治疗、干细胞技术等。
其中，基因工程技术是目前最为重要的应用之一。
通过将人类基因或动物基因定向植入到细胞中，实现对目标基因的筛选和修改。
这种技术已经成功地应用于人类重大疾病的治疗，如癌症、遗传性疾病等。
组织工程技术是在动物细胞培养技术的基础上进一步发展出来的。
它是指将动物细胞通过培养、分离、再组合等技术，组成人工组织，并使其长期保存和生长。
这种技术已经成功地应用于生产人工皮肤、人工角膜、组织修复等方面，对缓解人类疾病和改善生存环境起到了重要作用。
虽然动物细胞培养技术的应用领域十分广泛，但其研究和应用仍然存在一些挑战和难题。
动物细胞大规模培养技术研究进展
仲恺农业技术学院学报,18(3):64～70,2005Journal o f Zhongkai Univer sity o f Agriculture and Technology文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07动物细胞大规模培养技术研究进展吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张 涌3(1.西北农林科技大学植物保护学院;2.西北农林科技大学生命科学学院;3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100)摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景.关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体中图分类号:Q251 文献标识码:AR esearch advance in large2scale culture of animal cellsW U Fang2li1,J I N Wei2bo2,W ANG Bao2li2.3,ZH ANG Y ong3(1.C ollege of Plant Protection;2.C ollege of Life Sciences;3.Institute of Bio2Engineering,N orthwest A&F University,Y angling712100,China)Abstract:Many biological products were manu factured by means of large-scale culture of animal cells.T o increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in fav or of cell growth and high cell density.Biore2 actors with sim ple manipulation,g ood qualification and aeration were adopted.M ore suitable conditions for cell growth could be given through on-line supervising the environment for cell growth and restraint factors in cell culturing.Furtherm ore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.P orous microcarriers was em phasized in large-scale culture of animal cells.K ey w ords:animal cell;culture environment;bioreactor;microcarrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上.在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化.收稿日期:2005-04-18基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目.作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.1 细胞最适生长培养基的选择培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素.一般情况下,动物细胞的生长均有赖于血清的存在.但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端[1],给生物制品的生产造成了不便,这就引发了人们对无血清培养基的研究.结果发现,只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等,多种细胞即可在无血清供应的情况下生长[2],尤其是中华仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary ,CH O )细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等,其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽.CH O 细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代[3].在人类细胞培养中,某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍.另外,应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长.应用无血清培养基培养动物细胞的成功,还将为某些痘苗的生产降低成本[4].目前,大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基,从而避免了血清培养基污染的可能性,并减少了纯化的难度.但无血清培养基缺乏广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血清培养基配方.如用于基因重组促人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin ,rHuEPO )生产且不含牛血清白蛋白的无血清培养基-p (Serum free medium -p ,SFM -p )培养液,就是在达尔贝可改良的伊格尔(Dulbecco πs m odified Eagle πs medium ,DME M )∶F12(1∶1)培养基中添加了Se 、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子等成分构成的专用培养基[5].无血清培养基虽然在各个方面都显示出其强大的优势和发展前景,但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中亟待解决的问题.在培养基中加入某些化合物,如金精三羧酸(Aurint ricarboxylic acid ,AT A )、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡[6].但是,由于培养基中所添加的蛋白成分主要还是来源于动物或人,仍然存在病毒污染的危险,只有完全采用非动物来源的材料,才是相对安全的,而植物提取物将是理想的选择.可以这样预测,未来开发的新一代无血清培养基,将是一种既无血清、无蛋白,又可以高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基[7].2 生物反应器的选择在生物制品生产中,动物细胞培养已越来越重要,而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器(也称动物细胞发生器)[8～10].由于动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)在促红细胞生成素(Erythropoietin ,EPO )、干扰素(Interferon ,IFN )、尿激酶原(Pro 2Urokinase ,Pro 2UK )、疫苗以及其他一些价值昂贵的生物制品的生产上具有独特的优势,因此近年来有关动物细胞生物反应器的研制进展迅速[11～13].目前国内外生物反应器的种类较多,应用于生产实际的也不少,概括下来主要有以下几种:211 机械搅拌式(S pinner )生物反应器机械搅拌式生物反应器是开发较早、应用较广的一类生物反应器,主要由培养罐、管、阀、泵、马达及仪表组成.培养物的混匀由马达带动的不锈钢搅拌系统实现,在罐体顶端还有一些传感器,可以连接监测培养物的温度、pH 值溶氧度(Diss olved oxygen ,DO )、葡萄糖消耗、NH 3、NH 4+等参数.这种反应器培养规模可达2000L ,若再配合微载体、多孔微球、灌注技术,可使细胞密度达到107/m L 以上,而且消毒方便.另外,其最大的优点是能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合工厂化生产,但不足之处是机械搅拌所产生的剪切力对细胞有一定的损伤[14,15].212 气升式(Air lift )生物反应器气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管,使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环.它在结构上和搅拌式大同小异,其显著特点是用气流代替不锈钢叶片进行搅拌,因而产生的剪切力相对温和,对细胞损伤较小[16].英国Celltech 公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,该公司在1985年应用100L 气升式生物反应器对杂交瘤56第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展66仲恺农业技术学院学报第18卷细胞进行了大规模培养,现在还开发出了10000L气升式生物反应器用于各类单克隆抗体的规模化生产[17].国内也有人设计制造了10L规模的气升式生物反应器用于培养哺乳动物细胞和昆虫细胞等[18].213 中空纤维管(H ollow fiber)生物反应器中空纤维管生物反应器是开发较早且正在不断改进的一类生物反应器.其原理为泵动培养液通过成束的合成空心纤维管(毛细管)而使细胞固着在毛细管内壁上生长.如果毛细管的直径为350μm,表面积∶体积比为30∶7,因此大量成束的毛细管内壁提供了大量的细胞生长表面积.中空纤维管生物反应器的用途较广,既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞,并且细胞密度最高可达109/m L[19],主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体.其特点是细胞培养环境温和,培养细胞密度较高,产品较容易分离纯化[20].但这种反应器的培养环境不够均一,在一定程度上影响了产品质量的稳定性.而且,中空纤维培养工艺不易放大,反应器本身的消毒和重复使用也相对较难[21].214 旋转式细胞培养系统20世纪90年代中期,美国宇航局(National aeronantics and space administration,NAS A)开发了一系列旋转式细胞培养系统(The rotary cell culture system,RCCS),又叫回转式生物反应器(R otating wall vessel biore2 actor,RW VB),这是目前世界上培养贴壁和悬浮细胞的最新装置.该系统原先是为保护在宇航中所进行的纤细的组织培养而设计的.然而,它的低剪切力、高物质传递效率和微重力的独特环境,使人们在普通实验室的组织培养箱内也能培养出三维细胞组织[22,23].RCCS是绕水平轴旋转、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统.因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器,故几乎没有破坏性的剪切力,使得大细胞团得以形成.与普通系统相比,RCCS的一个主要优势是进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养.使人们能得到和在人体内一样的培养产物[24～26].由于可模拟空间中的微重力环境,该生物反应器被誉为空间生物反应器.其模拟空间环境的机理是它可使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化,导致一定程度的重力降低,使细胞处于一种模拟自由落体状态,以此模拟微重力环境[27].RCCS由于没有搅拌剪切力的影响,细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长,同时随机化的重力向量可能直接影响细胞的基因表达,或者间接促进细胞的增殖分化和组织器官形成,因而这种生物反应器可用于当前十分热门的组织工程研究,也可用于探索微重力环境对细胞生长、分化的影响[28,29].215 其它生物反应器近年来在组织与细胞工程领域用到的还有流化床生物反应器(Fluidized bioreactor)、Petri碟生物反应器(Petri bioreactor)、脉动式生物反应器(Pulsatile bioreactor)、摇床式生物反应器(Shaking bioreactor)、填充床生物反应器(Packed bed bioreactor)等[9,10,12,30],由于这些生物反应器应用不普遍,故不作详述.3 培养用微载体的选择大多数被培养的动物细胞都是贴壁依赖性细胞,而传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或转瓶培养等方式获得,其操作繁复,且耗费空间及人力.1967年,Van Wesel[31]首先提出了“微载体”培养系统,为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了一个新的概念.经过几十年的研究,现在微载体培养已广泛应用于动物细胞的培养,并取得了许多成果.如微载体的大小和电荷量达到了最优化,以提高细胞的生长能力;微载体表面特性的改善,以利于细胞的快速贴壁等.细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和培养基的不同而变化,因此为特定细胞选择合适的微载体比选择微载体本身更重要.近年来开始使用的多孔微载体[32]可提供大的表面积∶体积和最大的细胞密度[33],然而以该载体培养的有些细胞系却贴在微载体内,其“移动性”相对较差.因此需要研制一种更好的培养方式,以提高微孔的开放性或者改善其表面特性,从而在提高细胞贴壁率的同时增加细胞的移动性.4 培养过程的在线监控在动物细胞的大规模培养中,生物离线取样特别是产物浓度测定需要较长的时间,不能及时反映细胞生存环境中的各种参数变化,因而在线过程监控在动物细胞的大规模培养中具有非常重要的地位,可以创造适合细胞生存的最佳环境,减少污染等.目前在培养过程中已经能对温度、pH 值、溶解氧浓度进行在线分析,并可进行有效控制.最近几年,有关细胞培养过程监控的研究迅速增多,在线测量氧吸收速率,可以确定从细胞生长期生产病毒到感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间;用在线葡萄糖分析仪的测定来调整灌流速度等[34].另外,估测目前和未来生物反应过程中葡萄糖的吸收率及乳搪的生成率的软件也已经研制成功[35],这使得对细胞培养过程的状态监控更加及时、准确.5 维持细胞生长所需的最佳条件影响细胞培养的主要因素有C O 2、DO 、温度、pH 值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛、培养基成分等.一般来说,最适C O 2水平为4%～10%,DO 维持在20%～50%,温度一般为37℃,pH 值在710～714之间.葡萄糖是细胞培养过程中的主要能量来源,必须维持在一定水平.氨、乳酸、甲基乙二醛等是动物细胞培养的主要限制因素.氨离子抑制谷氨酰胺(G lutamine ,G 1n )的代谢途径,应限制G ln 用量,并尽可能去除培养基中的氨;高浓度乳酸可抑制细胞生长,应降低培养基中的葡萄糖浓度以减少乳酸产生,在动物细胞大规模培养中常常需添加果糖,以减少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基,实际应用中降低甲基乙二醛的浓度主要也是通过降低葡萄糖用量来实现的[7].6 物理场效应对细胞生长的影响各种物理场如静电场、磁场等都会对细胞的代谢产生一定的作用[36,37].物理场对细胞的刺激作用存在阈值,不同的物理场对不同细胞存在不同的场效应.人们目前对各种物理场对细胞的刺激效应有了一定研究,并试图将之应用到动物细胞培养体系之中[38].Bowlin 等[39]证实,细胞经电场作用刺激后,其生理活性有很大的提高,胞外某些物质的含量也明显上升.这说明适当的电场刺激可以提高细胞培养的效率.同时,一定的静电场还有助于细胞产物的分离[40].611 增强细胞抗凋亡能力在动物细胞大规模培养的初期,细胞数量不断增加,表达重组蛋白的能力也在逐步提高.随着细胞数量达到顶峰之后,细胞数量和表达水平将下降.因此,在动物细胞大规模培养的后期,维持细胞的高活力是一个富有挑战性的课题.最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死,而人们逐渐认识到至少有一些细胞系在生物反应器中出现细胞死亡的主要原因是细胞凋亡[7].随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入,细胞凋亡的发生被认为是动物细胞大规模培养过程的重要制约环节,预防并控制细胞凋亡也因此成为研究的热点.用基因工程方法将Bcl 22这种细胞调亡抑制基因导入细胞,已成为众多学者的选择[41,42].Bcl 22基因的过量表达能抑制G ln 或氧缺乏引起的细胞凋亡,减少细胞特定营养成分的消耗,提高细胞密度和目的蛋白产量[42,43],这对于细胞大规模培养具有重大意义.但Bcl 22等抑制基因对细胞的这种保护作用依赖于它的高水平表达,因此,需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因.在动物细胞大规模培养条件下,细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生,因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分的消耗和有毒代谢产物的产生,提高CH O 细胞的目的蛋白产率[44],其方法就是向CH O 细胞中导入p21、p27基因,使细胞周期中G l 期延长(细胞静止).经过如此改造后,细胞活力正常,外源基因表达蛋白量提高,并使产品成本降低,产量提高,遗传稳定性增加[45].612 选择合适的细胞培养工艺流加培养(Fed -batch )和灌流培养(Pefusion )是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式.另外可供选择的方式还有批式-反复流加(Batch-refeeding ).虽然许多较老的病毒生产工艺采用批式操作(Batch ),新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式,如批式-反复流加或灌流培养工艺.流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器,营养物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡,维持一个高细胞密度和高产物浓度.相对于流加培养,灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并带走代谢产物;同时,细胞保留在反应器中,可以达到很高的细胞密度.与其他方法相比,灌注培76第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展86仲恺农业技术学院学报第18卷养的产率可以提高一个数量级,并可以大大降低劳动力成本[46].灌注培养主要分为悬浮灌注培养和床层灌注培养两大类.悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上,加上一个细胞分离器而成,其中以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见;床层灌注培养则把细胞直接保留于床层,不需要分离器,其中以堆积床和大孔载体培养的应用较广泛[46].流加悬浮培养与灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同,两种操作形式的选择完全取决于每个产品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性,以及产品的最高产量需求和质量要求.7 存在问题711 无血清培养基适用范围窄目前应用的无血清培养基表现为细胞的适用谱极窄,细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便.因此无血清、无蛋白、可高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基是未来研制无血清培养基的方向.712 固定化培养技术及微载体需进一步探索目前虽然对各种固定化载体某一方面的性能进行了一些改进,但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济适用、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求.因而研制新型的固定化载体以满足上述要求,是动物细胞固定化培养技术继续发展的一个主要方向.在细胞的固定化培养过程中,往往忽略了载体对细胞的生物学作用.即只注意了载体对细胞的机械保护而忽略了载体对细胞代谢过程的影响和调控.尝试研制具有一定生物学功能的细胞固定化载体,是载体研究中一个全新的领域.结合当今最新的纳米技术,可以在载体表面附着一些生物功能性分子,对培养过程进行一定的调节;同时通过不同的生物以及选择不同的加入时间,可望实现培养过程的阶段性调控.但是目前有关这方面的研究仍主要集中在对无机膜的修饰和对无机分子的研究,而有关生物大分子的应用仍处在尚未开发的阶段[47].713 生物反应器装置及生产工艺仍需改进目前动物细胞大规模培养中所应用的生物反应器皆有其独特的优点,但同时也存在一定的不理想因素.低或无剪切力,同时还能在线监控的生物反应器是以后研究的重点.另外,动物细胞培养系统在利用新技术、新工艺的同时,还不能协调细胞及其环境与新技术应用的关系.在目前的技术条件下,对这一关系的协调仍旧处于摸索阶段,尚缺乏足够的理论指导.8 展望经过几十年来的研究与实践,目前虽然动物细胞大规模培养技术还存在不少问题,但较之几十年前已是质的飞跃.随着这一技术的进一步发展,人们还将不断努力,研制更理想的生物反应器,以获得高密度、高活力的细胞;开发新的无血清培养基,使细胞的生长状态更好,生物制品更安全;建立细胞培养与产物分离的涡合系统,充分利用培养液,以降低生产成本等,从而使动物细胞培养技术在生物制品制备和基因工程等领域得到更广泛的应用.参考文献:[1] VOIGE A,ZI M L F.Hybridoma cell growth and anti2neuroblas ona m onoclonal antibody production in spinner fleeks using a protein2freemedium with microcarrier[J].J Biotechnol,1999,68(2-3):213-226.[2] SI NAC ANE M S,DRAPE AU D,ADAMS ON S K.Adaptation of mammalian cells to growth in serum free media[J].M ol Biotechnol,2000,15(3):249.[3] 徐 冰.大规模哺乳动物细胞培养[J].国外医学:预防、诊断、治疗用生物制品分册,1997,20(5):212.[4] 忻亚娟,朱家鸿.动物细胞培养技术的进展[J].浙江预防医学,2001,(14):48-50.[5] 邓继先,杨 琴,程 萱,等.用于生产rK uEPO的无血清培养基的研究[J].军事医学科学院院刊,1997,2l(4):244-250.[6] 陈昭烈.动物细胞培养过程中的凋亡[J ].生物工程进展,1998,18(6):17-20.[7] 邹寿长,李干祥,杨葆生,等.大规模动物细胞培养技术研究进展[J ].生命科学研究,2001,5(2):102-108.[8] ZH AO LIE C ,DIRKL ,K AI I J.High 2ensity culture of recombinant Chinese hamster overay cells producing prothrombin in protein 2freemedium[J ].Biotechnology Letters ,2001,23(10):767-770.[9] LI U C M ,H ONG L N.Development of a shaking bioreactor system for animal cell cultures [J ].Biochemical Engineering Journal ,2001,7(2):121-125.[10] G OUT AM S ,A LOKB ,S ATY ABROT O S.M odeling of the oxygen trans fer characteristics of a ‘see 2saw ’bioreactor[J ].Chemical En 2gineering &T echnology ,2001,24(1):97-101.[11] 谭昌耀.用哺乳动物生产人用治疗制剂的发展与改进[J ].国外医学:预防、诊断、治疗用生物制品分册,2001,24(1):11-14.[12] H AUT B ,AM OR H B ,C OU LON L ,et al .Hydrodynamics and mass trans fer in a C ouette -T aylor bioreactor for the culture of animalcells[J ].Chemical Engineering Science ,2003,58:777-784.[13] K AME N A A ,T OM R L ,C ARON A W ,et al .Culture of insect cells in a helical ribbon im peller bioreactor[J ].Biotechnology andBioengineering ,1991,38(6):619-723.[14] SHI Y,RG U D D Y,PERFORM ANCE S H.Per formance of mammalian cell culturebioreactor with a new im peller design [J ].Biotechnology and Bioengineering ,1992,40(2):260-264.[15] CHE N Zhaolie ,PIRKLutkemeyer ,K AI Iding.High -density culture of recombinant Chinese hamster ovary cells producing prothrom 2bin in protein -free medium[J ].Biotechnology Letters ,2001,23:767-770.[16] 李学梅,林建平,刘 娥,等.固定化米根酶发酵制L 2乳酸[J ].菌物系统,1998,17(4):318-326.[17] MEISS NER P ,SCHRODER B ,HERFURTH C ,et al .Development of a fixed bed bioreactor for the expansion of human hematopoieticprogenitor cell[J ].Cytotechnology ,1999,30:227-234.[18] 谭文松,陆 健,张元兴.气升式生物反应器在杂交瘤细胞培养中的应用[J ].生物工程学报,1996,12(4):477-481.[19] K ONG D ,C ARDAK S ,CHE N M ,et al .High cell density and productivity culture of Chinese hamster ovary cells in a fluidized bedbioreactor[J ].Cytotechnology ,1999,29:215-220.[20] M ARY A I C ,JU LI O A L ,RIC ARDO J G.S olving design equations for a hollow fiber bioreactor with arbitrary kinetics[J ].ChemicalEngineering Journal ,2001(84):445-461.[21] VI NCE NZ A C ,STEFANO C ,G ABRIE LE I.A theoretical analysis of transport phenomena in a hollow fiber membrane bioreactor withimm obilized biocatalyst[J ].Journal of membrane Science ,2002,206:217-241.[22] FREE D LE ,VUN JAK 2N ovakovic G.M icrogravity tissue engineering[J ].In vitro Cellular and Development Biology ,1997,33:381-387.[23] 胡 江,陶祖莱.组织工程研究进展[J ].生物医学工程学杂志,2000,17(1):75-80.[24] 万 超,杨庆铭,邓廉天,等.MSCs 2PG A 兔复合物在RCCS 中的成骨潜能[J ].上海第二医科大学学报,2002,22(5):403-407.[25] 何 川,邓廉天,周来生,等.RCCS 中犬成骨细胞nBG C 复合物联合培养的实验研究[J ].上海第二医科大学学报,2003,23(4):301-304.[26] VUN JAK N ovakovic G,M ARTI N I ,OBRADOVIC B ,et al .Bioreact or cultivationconditions m odulate the com position and mechanicalproperties of tissue 2engineering cartilage[J ].J Orthop Res ,1999,17(1):130-138.[27] SCHW ARZ R P ,G OODWI N T J ,W O LF D A.Cell culture for threedimensional m odeling in rotating wall vessels :an application insimulated microgravity[J ].J T issue Culture Methods ,1992,14:51-58.[28] QI NG 2Qing Q ,PAU L D ,PORT ONOVO S ,et al .Fabricatin ,characterization andevaluation of bioceramic hollow microspheres used asmicrocarriers for 32D bone tissue formation in rotating bioreactors[J ].Biomaterials ,1999,20:989-1001.[29] K ONST ANTI ONS J D ,LE ONARD J N ,TI M OTHYJ B ,et al .The simulated microgravity environment maintains key metabolic func 2tions and prom otes aggregation of primary porcine hepatocytes[J ].Biochimica et Biophysica Acta ,2001,1526:119-130.[30] GIRARD P ,JORDAN M ,TS AO M ,et al .Small 2scale bioreactor system for process development and optimization[J ].BiochemicalEngineering Journal ,2001,7:117-119.[31] VAN Wezel A L.G rowth of cell 2strains and Primery cells micro 2carriers in hom ogenecus culture[J ].Nature ,1967,216:64-65.[32] 王佃亮,肖成祖,陈昭烈,等.微载体高密度培养Vero 细胞研究[J ].生物工程学报,1996,12(2):164-170.[33] 张 立,严 春,范卫民,等.Vero 细胞的微载体培养[J ].华东理工大学学报,1998,24(6):659-663.[34] H U W S ,AUNI NS J rge 2scale mammalian cell culture[J ].Curr Opin Biotech ,1997,8:48-153.96第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展。
动物细胞培养技术的进展
动物细胞培养技术的进展动物细胞培养技术是生物学研究中不可或缺的一项技术，它可以使得研究者能够更加深入地研究细胞的结构和功能，同时也可以用于生物制药、生物医学等领域。
在过去的几十年里，动物细胞培养技术得到了很大的发展，其应用领域逐渐扩大，成为了生物学研究中非常重要的一部分。
本文将从细胞培养的历史、技术进展、应用领域三个方面来说明动物细胞培养技术的发展和应用。
一、历史最早关于细胞培养的实验可追溯至19世纪中期，当时的法国生物学家Lionel S. Beale使用兔子标本，成功地将细胞在玻璃注射管中维持生长了20天以上。
此后，人们开始尝试利用试管和培养基来培养细胞。
1907年，美国生物学家Ross Harrison用鸡胚的神经细胞成功地将神经元分开培养，这是世界上第一个动物细胞培养的成功实验。
20世纪40年代，建立了细胞培养的基础技术，包括培养基的选择和制作以及培养环境的控制等。
二、技术进展20世纪50年代和60年代，动物细胞培养技术得到了进一步的发展，培养时间、数量和品质都有了显著提高。
其中最重要的技术之一是无血清培养，也称为无血清减少培养（serum-free or reduced medium culture），这种培养方式不需要使用动物源性血清，使得培养环境更加卫生、纯净、可控。
同时，由于血清的来源有限，而且还可能存在病毒、影响研究可靠性，使得无血清培养技术在组织工程、生物技术、基因治疗等方面的应用越来越受到重视。
细胞培养还可以分为立体培养和平面培养两种。
立体培养最为常见的就是三维细胞培养技术，这种技术可以模拟真实的组织环境，在生物医学和组织工程等领域得到了广泛应用。
三、应用领域动物细胞培养技术在人类医疗保健、药品开发、疾病治疗等领域有广泛的应用。
例如，癌症治疗中，锁定细胞表面的化学信号分子可以用于诊断和治疗；对细胞机理的深入研究，有可能找到治疗癌症的有效药物。
动物细胞培养技术的应用领域还包括：1. 组织工程：三维细胞培养和其他技术一起被用来制造人工组织和器官，如骨骼、肌肉、心脏和肝脏等;2. 生物制药：动物细胞培养被用于制造人类蛋白质药物，如肿瘤坏死因子、白细胞介素2、角质细胞生长因子等;3. 疫苗研发：培育细胞，制造疫苗成分是最常见的方式之一。
动物细胞培养技术的应用和最新进展
动物细胞培养技术的应用和最新进展动物细胞培养技术是一种以哺乳动物细胞为材料通过体外培养方式生产蛋白质、疫苗、抗体等生物制品的技术。
自20世纪50年代发展至今，动物细胞培养技术已成为生物制药领域不可或缺的一环。
动物细胞培养技术的应用范围广泛。
在生物制药领域，动物细胞培养技术被广泛应用于生产重要的生物制品，如免疫球蛋白、疫苗、生长激素等。
在医学研究领域，动物细胞培养技术是模拟人体疾病发生、发展的重要工具。
同时，动物细胞培养技术还被广泛应用于毒理学、环境保护、食品科学、农业科学等领域。
动物细胞培养技术的最新进展主要体现在以下三个方面。
一、三维培养技术传统的动物细胞培养技术主要是在二维的平面培养基上进行，但这种方法不能完全模拟人体内三维环境。
近年来，三维培养技术呈上升趋势。
三维培养技术可以更好地模拟生物组织的真实环境，有利于研究体内疾病的发生机理及药物研发。
例如，三维培养技术已被应用于肿瘤细胞的筛选，在肿瘤研究中发挥了重要作用。
二、基因编辑技术动物细胞培养技术中的基因编辑技术是目前最热门的研究领域之一。
借助基因编辑技术，可以更好地研究细胞的功能及相关基因对生命活动的调节。
例如，通过基因编辑技术，可以对病毒基因进行编辑，用于研究病毒的传播机制及遗传规律。
此外，基因编辑技术在遗传病治疗方面也具有广阔的应用前景。
三、人工智能技术在动物细胞培养技术中，人工智能技术的应用也开始增多。
借助人工智能技术，可以更好地对大规模生物数据进行处理和分析。
例如，预测药物对蛋白质结构的影响及酶的特异性。
同时，人工智能技术还可以为动物细胞培养过程中的质量控制提供支持。
总的来说，动物细胞培养技术作为生物制药领域不可或缺的一环，其应用前景十分广阔。
随着科学技术和生产工艺的不断进步，动物细胞培养技术必将在世界范围内得到更广泛的应用。
动物细胞培养及无血清培养研究进展
动物细胞培养及无血清培养研究进展摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。
其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。
为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。
关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基1 引言组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。
这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。
近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。
然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。
因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。
2动物细胞培养动物细胞培养方式包括原代和传代培养。
培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。
2.1动物细胞培养的基本概念细胞培养指的是从体组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。
从体取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。
原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。
原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。
传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。
2.2动物细胞培养技术的容2.2.1培养的环境要求1）无菌无毒：无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。
大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的研究进展
大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的研究进展动物细胞培养开始于本世纪初1962 年，其规模不断的扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，，而大规模动物细胞培养技术已经成为生物技术制药中非常重要的环节。
目前，大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品上面，也已经开始了一些大规模的生产应用，细胞大规模培养技术作为行业技术升级改革的重要内容，农业部自2012年2月1日起，停止受理转瓶培养生产方式的的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。
因此，传统转瓶工艺的应用越来越受到限制使用。
自从20世纪60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，细胞悬浮培养已是当前国际上生物制品生产的主流模式。
动物细胞有悬浮培养和贴壁培养两种，技术水平的提高主要集中在培养规模的扩大、细胞培养环境的优化、细胞特性的改变、不断提高产品的产量及保证其质量上。
本文就大规模动物细胞培养技术在兽用疫苗上的应用进行综述，分析了其在獸用生物制品产业的发展趋势。
一、动物细胞培养方法1.贴壁培养贴壁培养是指细胞贴附在某种载体上，载体悬浮在反应器里的培养方法，一切贴壁型细胞都能够适用于贴壁培养。
在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、PK—15细胞、ST细胞和Vero细胞等。
由于贴壁细胞具有贴壁的要求，提高细胞的密度就是使细胞培养规模最大化的有效方法。
传统的贴壁细胞培养包括方瓶、扁瓶、转瓶等。
但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较复杂，所占空间大，劳动量也大，贴附面积具有限制性，在实际生产使用中受到极大的限制。
目前，贴壁细胞的微载体培养在细胞生产中得到广泛的应用。
2.悬浮培养悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便，细胞经过一定程度的驯化培养后，直接悬浮在适宜的液体培养基中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。
传代时也不需要再进行分散，只需要添加一定比例的培养基即可继续生长。
第十一章 动物细胞的大规模培养
抗原
有毒物质或病原物侵入，即抗原
指诱导产生抗体的物质。
侵入
抗体1 抗体2
如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子 可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。
对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴
细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫 抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的 抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定 簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。
1962年，Capstick等首次成功地进行了仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cell,BHK）的大规模悬浮培养。此后，随着细胞 培养原理与方法的不断完善，人们通过采用在培养液中添加人 工合成的小球状惰性聚合载体的微载体培养技术，大幅度地提 高了细胞产量，成功地在体积高达10 m3发酵罐内进行动物细胞 的深层培养，从而使动物细胞大规模培养技术趋于成熟。
目前由动物细胞培养的产物包括哪几类？请分别 列举出2-3个产物。
问题
第11章 动物细胞的大规模培养
疫苗 人 动物
单克隆抗体
表7-2 动物细胞培养的产物
小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫 苗等
牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘 病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬分批式培养细胞效果不佳？
第11章 动物细胞的大规模培养
二、流加式培养（补料分批式）
定义
流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜 的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断 形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系 统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个 培养结束后取出产物。
动物细胞大规模培养技术研究进展
摘要 ：文章 浅析 了动物 细胞 大规模培 养技 术 的研 究进展 。 关键 词 ：动物细 胞 ；培 养技 术 ：进 展 中图 分类号 ： ￥ ５ ８ 文献标 识码 ：Ａ
文 章编号 ： １ ７ — ４ ２（ ０ １ ０ — １ ８ １ ６ ４ ０ ３ ２ １ ）～ ２ ０ ７ —
动物细胞培 养开始 于上世纪初 ， 由胚胎 学技术衍 生而来 。１６ ９２ 年 以后其 规模 开始 增大 ，发展 到现在 已成为 生物制 品生产 以及基 因 工程等领域 必不 可少的工 具之一 。利用动 物细胞 培养 生产具有 较高 医用价值 的酶 、疫 苗 、单 抗和 生长因 子等 ，已成 为生 物医药 等高新 技术产业 的重要组 成部分 。在大 规模培养 动物细 胞的过 程 中，最根 本的是使培 养细胞 的条件 达到最 优化 ，尽 可 能降低或 消除外 界环境 对 细胞的影响 ，使细胞 维持高存活力和 高效表达 。
性 ，从而在增加细 胞的移动性 的同时提高 了细胞 贴壁率 。
４培 养 过程 的 在 线监 控
在 大规模培 养动物 细胞 中，生物离线取 样特 别是产物浓 度测 定 需 要较长 的时 间，不能及 时反 映细胞生 存环境 中的各 种参数变 化 。 因此 ，在线 过程 监控 就 显得 非常 重要 ，这样可 以创造 适合细胞 生存 的最 佳环境 ，减 少培养过 程 中的污染 。到现在 为止 ，在细胞培 养过 程 中 已经 能对 温度 、ｐ 值 、溶解 氧 浓度 进 行在 线分 析 并控 制 。此 Ｈ １细胞 最 适 生 长培 养 基 的 选择 外 ，估测 目前和未 来生物 反应过程 中葡 萄糖 的吸收率和 乳搪 的生成 动 物 细胞 培养 基是 细 胞体 外赖 以生长 、增殖 、分化 的 重要 因 率 的软件也 已经研制 成功 ，这使 得对细 胞大规模 培养过 程的状 态监 素 。 目前 ，动物细 胞大规模 培养 中 已经普 遍使用 无血清 培养基 ，在 控更加及 时、准确 。 此 之前 使 用过 天然 培 养基 和合 成 培养 基 。无 血清 培 养基 在 很 多方 ５细胞 生 长 所 需 的最 佳 条 件 面 虽然都显 示 了极 其强大 的优势和 发展前 景 ，但 无血清 培养 的应 用 影 响细胞 培养 的主 要 因素有温 度 、ｐ 值、ｃ ０ Ｈ Ｏ、Ｄ 、葡萄糖 、 诱 发的细胞 凋亡也 成为 了动物 细 胞无血清 培养技 术中亟 待解决 的问 乳酸 、氨 、甲基 乙二醛 、培 养基成 分等 。一般情 况下 ，温 度一般 为 题 。研 究发现 ，在培养基 中加入一 些化合物 ，如金精 三羧酸 （ｕ ｉ ｔ Ａｒｎ ３ ℃，ｐ 值在７ Ｏ ７４ ＿ ，ｃ ， ７ Ｈ ．一． ２间 Ｏ水平为４ １％ Ｄ 维持在２ — ０ ，葡 — ０， Ｏ ０５％ ｒ ｃｒ ｏｙｉ ｃ ｄ Ｔ ） ｉａｂ ｘｌＣａ ｉ，ＡＡ 、抗氧 化剂和锌离 子等 ，可阻止 因采 用无 萄糖是细胞培养过程 中的能量 的主要来源 ，需要维持在一定水平。乳 血清培养 基而导致 的一定程 度上的细胞凋 亡。 酸、氨、 甲基 乙二醛等是动物细胞培养 中的主要降低 甲基 乙二醛 的浓度是通过 降低葡 萄糖用 量来实现的。
动物细胞大规模培养技术研究进展
动物细胞大规模培养技术研究进展【摘要】当前动物细胞大规模培养技术已经成为生物技术领域的研究重点，同时被广泛应用于生物医药的研发、生产。
本文介绍了动物细胞大规模培养过程中的技术及研究进展。
【关键词】动物细胞；大规模培养技术；研究进展前言动物细胞培养出现在二十世纪初，并于1962年开始扩大，当前被广泛应用于生物、医学研究等。
依托动物细胞培养进行医用价值高的酶、疫苗、单抗、生长因子等的生产，已逐步发展为医药生物高新技术产业的一部分[1]。
当前依托动物细胞培养技术所制造生物制品在世界生物高技术产品市场份额中几乎占有一半的比例。
相关资料显示，生物技术药物属于新药开发的重要领域，在未来的制药工业中生物技术制药将成为重要新门类，上市的生物技术新药将高达数百种。
动物细胞大规模培养技术属于生物技术制药的重要环节，其水平当前集中于培养规模的扩大、细胞特征的改变等方面。
一、细胞生物反应器生物制品的生产离不开动物细胞的培养，其中生物反应器是进行动物细胞培养的重要设备。
因为动物细胞在生产红细胞生成素、尿激酶原、疫苗、干扰素等价值昂贵的生物制品时优势显著，所以关于动物细胞生物反应器的研制迅速。
（一）机械搅拌式这一类型的生物反应器开发相对早、应用也比较广泛，包括培养罐、阀、马达、管、泵、仪表。
在马达带动不锈钢搅拌系统可以对培养物进行混匀，罐顶的传感器连接监测培养物的pH值溶氧度、NH3、NH4+、温度、葡萄糖消耗等，规模为2000L，在微载体、灌注技术及多孔微球技术的配合下，其细胞密度将超过107/mL，消毒十分便利[2]。
培养的动物细胞类型多样、培养工艺易于放大、适宜于工厂化生产是其优势所在，但机械搅拌造成的剪刀力却会对细胞造成损害。
（二）气升式通过这一类型的生物反应器，气体混合物可以经底部喷射管到中央导管，这样中央导管的液体密度将比外部区域低，这就促成了循环。
其结构趋同于搅拌式，但是进行搅拌的不锈钢叶片换成了气流管，所以其形成的剪刀力较为温和，对细胞的损害相对较小。
固定化动物细胞大规模培养技术研究进展
固定化动物细胞大规模培养技术研究进展石 凯1 熊晓辉1 许建生2(1南京工业大学制药与生命科学学院,南京,210009;2苏州农业职业技术学院,苏州,215008)摘 要 介绍了固定化动物细胞培养过程中主要的技术及其进展,包括吸附、包埋、中空纤维、微囊化等。
并在此基础上探讨了固定化动物细胞培养中尚存在的问题以及未来的发展方向。
关键词 固定化,动物细胞培养,吸附,微载体,包埋,中空纤维,微囊化中图分类号 Q 813.1+1 文献标识码 A 文章编号 1000-6613(2002)08-0556-04 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径,相对悬浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯化、对贴壁型和非贴壁型细胞都适用的优点,因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。
本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。
1 动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别[1]:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;②倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染,培养时须用抗生素;③培养过程需氧量少(氧传质系数k L a 大于10h -1即可满足每毫升107个细胞的生长);④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在;⑤原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡;⑥代谢产物具有生物活性,生产成本高,但附加值也高。
动物细胞根据其在体外培养时对生长基质的依赖性差异,分为锚地依赖性和非锚地依赖性。
大多数分泌药用蛋白的动物细胞属于锚地依赖性细胞,即要有足够地支持细胞贴壁的表面,又要保持均匀悬浮状态。
固定化技术就是解决这两个问题的有效途径。
2 固定化培养方法在传统的固定化酶技术中,常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。
大规模动物细胞培养问题及对策
5结论与展望
可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定克隆的方法。细胞培养营养需要的重点将继续朝着维持或增加产品质量及一致性上努力。基因改建在筛选、扩增目的基因及控制其表达或增强细胞寿命等方面显示出强大生命力。改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养/控制模式将会在现有基础上不断产生。不断成熟的大规模动物细胞培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。
大规模动物细胞培养的问题及对策
大规模动物细胞培养的问题及对策
动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。
动物细胞的灌注养方法
动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比,动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题,大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术,提高动物细胞大规模培养的产率,一直是国内外研究的热点之一。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
仲恺农业技术学院学报,18(3):64~70,2005Jou r na l o f Zhongkai University o f Agriculture an d Technology文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07动物细胞大规模培养技术研究进展吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张涌3(1.西北农林科技大学植物保护学院; 2.西北农林科技大学生命科学学院;3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100)摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景.关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体中图分类号:Q251文献标识码:AResearch advance in large-scale culture of animal cellsW U Fang-li1,JIN We-i bo2,W ANG Bao-li2.3,ZHANG Yong3(1.College of Plant Protection; 2.College of Life Sciences; 3.Institute of Bio-Eng i neering,Northwest A&F University,Yangling712100,China)Abstract:Many biological products were manufactured by means of large-scale culture of animal cells.To increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density.Biore-ac tors with simple manipulation,good qualification and aeration were adopted.More suitable conditions for cell gro wth could be given through on-line supervising the environment for cell gro wth and restraint factors in cell culturing.Furthermore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.Porous microcarriers was emphasized in large-scale culture of animal cells.Key words:animal cell;culture environment;bioreac tor;microcarrier组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上.在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化.收稿日期:2005-04-18基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目.作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.1 细胞最适生长培养基的选择培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素.一般情况下,动物细胞的生长均有赖于血清的存在.但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端[1],给生物制品的生产造成了不便,这就引发了人们对无血清培养基的研究.结果发现,只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等,多种细胞即可在无血清供应的情况下生长[2],尤其是中华仓鼠卵巢(Chinese ha mster ovary,C HO)细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等,其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽.C HO 细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代[3].在人类细胞培养中,某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍.另外,应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长.应用无血清培养基培养动物细胞的成功,还将为某些痘苗的生产降低成本[4].目前,大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基,从而避免了血清培养基污染的可能性,并减少了纯化的难度.但无血清培养基缺乏广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血清培养基配方.如用于基因重组促人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin,r HuEPO)生产且不含牛血清白蛋白的无血清培养基-p (Serum free medium -p,SFM -p)培养液,就是在达尔贝可改良的伊格尔(Dulbecco p s modified Eagle p s medium,DME M)B F12(1B 1)培养基中添加了Se 、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子等成分构成的专用培养基[5].无血清培养基虽然在各个方面都显示出其强大的优势和发展前景,但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中亟待解决的问题.在培养基中加入某些化合物,如金精三羧酸(Aurint ricarboxylic acid,ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡[6].但是,由于培养基中所添加的蛋白成分主要还是来源于动物或人,仍然存在病毒污染的危险,只有完全采用非动物来源的材料,才是相对安全的,而植物提取物将是理想的选择.可以这样预测,未来开发的新一代无血清培养基,将是一种既无血清、无蛋白,又可以高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基[7].2 生物反应器的选择在生物制品生产中,动物细胞培养已越来越重要,而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器(也称动物细胞发生器)[8~10].由于动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)在促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)、干扰素(Interferon,IFN)、尿激酶原(Pro -Urokinase,Pro -UK)、疫苗以及其他一些价值昂贵的生物制品的生产上具有独特的优势,因此近年来有关动物细胞生物反应器的研制进展迅速[11~13].目前国内外生物反应器的种类较多,应用于生产实际的也不少,概括下来主要有以下几种:211 机械搅拌式(Spinner)生物反应器机械搅拌式生物反应器是开发较早、应用较广的一类生物反应器,主要由培养罐、管、阀、泵、马达及仪表组成.培养物的混匀由马达带动的不锈钢搅拌系统实现,在罐体顶端还有一些传感器,可以连接监测培养物的温度、pH 值溶氧度(Dissolved oxygen,DO)、葡萄糖消耗、NH 3、NH 4+等参数.这种反应器培养规模可达2000L,若再配合微载体、多孔微球、灌注技术,可使细胞密度达到107/mL 以上,而且消毒方便.另外,其最大的优点是能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合工厂化生产,但不足之处是机械搅拌所产生的剪切力对细胞有一定的损伤[14,15].212 气升式(Air lift)生物反应器气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管,使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环.它在结构上和搅拌式大同小异,其显著特点是用气流代替不锈钢叶片进行搅拌,因而产生的剪切力相对温和,对细胞损伤较小[16].英国Celltech 公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,该公司在1985年应用100L 气升式生物反应器对杂交瘤65第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展66仲恺农业技术学院学报第18卷细胞进行了大规模培养,现在还开发出了10000L气升式生物反应器用于各类单克隆抗体的规模化生产[17].国内也有人设计制造了10L规模的气升式生物反应器用于培养哺乳动物细胞和昆虫细胞等[18].213中空纤维管(Hollow fiber)生物反应器中空纤维管生物反应器是开发较早且正在不断改进的一类生物反应器.其原理为泵动培养液通过成束的合成空心纤维管(毛细管)而使细胞固着在毛细管内壁上生长.如果毛细管的直径为350L m,表面积B 体积比为30B7,因此大量成束的毛细管内壁提供了大量的细胞生长表面积.中空纤维管生物反应器的用途较广,既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞,并且细胞密度最高可达109/mL[19],主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体.其特点是细胞培养环境温和,培养细胞密度较高,产品较容易分离纯化[20].但这种反应器的培养环境不够均一,在一定程度上影响了产品质量的稳定性.而且,中空纤维培养工艺不易放大,反应器本身的消毒和重复使用也相对较难[21].214旋转式细胞培养系统20世纪90年代中期,美国宇航局(National aeronantics and space administration,NASA)开发了一系列旋转式细胞培养系统(The rotary cell culture system,RCCS),又叫回转式生物反应器(Rotating wall vessel biore-ac tor,RW VB),这是目前世界上培养贴壁和悬浮细胞的最新装置.该系统原先是为保护在宇航中所进行的纤细的组织培养而设计的.然而,它的低剪切力、高物质传递效率和微重力的独特环境,使人们在普通实验室的组织培养箱内也能培养出三维细胞组织[22,23].RCCS是绕水平轴旋转、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统.因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器,故几乎没有破坏性的剪切力,使得大细胞团得以形成.与普通系统相比,RCCS的一个主要优势是进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养.使人们能得到和在人体内一样的培养产物[24~26].由于可模拟空间中的微重力环境,该生物反应器被誉为空间生物反应器.其模拟空间环境的机理是它可使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化,导致一定程度的重力降低,使细胞处于一种模拟自由落体状态,以此模拟微重力环境[27].RCCS由于没有搅拌剪切力的影响,细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长,同时随机化的重力向量可能直接影响细胞的基因表达,或者间接促进细胞的增殖分化和组织器官形成,因而这种生物反应器可用于当前十分热门的组织工程研究,也可用于探索微重力环境对细胞生长、分化的影响[28,29].215其它生物反应器近年来在组织与细胞工程领域用到的还有流化床生物反应器(Fluidized bioreactor)、Petri碟生物反应器(Petri bioreactor)、脉动式生物反应器(Pulsatile bioreactor)、摇床式生物反应器(Shaking bioreactor)、填充床生物反应器(Packed bed bioreac tor)等[9,10,12,30],由于这些生物反应器应用不普遍,故不作详述.3培养用微载体的选择大多数被培养的动物细胞都是贴壁依赖性细胞,而传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或转瓶培养等方式获得,其操作繁复,且耗费空间及人力.1967年,Van Wesel[31]首先提出了/微载体0培养系统,为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了一个新的概念.经过几十年的研究,现在微载体培养已广泛应用于动物细胞的培养,并取得了许多成果.如微载体的大小和电荷量达到了最优化,以提高细胞的生长能力;微载体表面特性的改善,以利于细胞的快速贴壁等.细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和培养基的不同而变化,因此为特定细胞选择合适的微载体比选择微载体本身更重要.近年来开始使用的多孔微载体[32]可提供大的表面积B体积和最大的细胞密度[33],然而以该载体培养的有些细胞系却贴在微载体内,其/移动性0相对较差.因此需要研制一种更好的培养方式,以提高微孔的开放性或者改善其表面特性,从而在提高细胞贴壁率的同时增加细胞的移动性.4培养过程的在线监控在动物细胞的大规模培养中,生物离线取样特别是产物浓度测定需要较长的时间,不能及时反映细胞生存环境中的各种参数变化,因而在线过程监控在动物细胞的大规模培养中具有非常重要的地位,可以创造适合细胞生存的最佳环境,减少污染等.目前在培养过程中已经能对温度、pH 值、溶解氧浓度进行在线分析,并可进行有效控制.最近几年,有关细胞培养过程监控的研究迅速增多,在线测量氧吸收速率,可以确定从细胞生长期生产病毒到感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间;用在线葡萄糖分析仪的测定来调整灌流速度等[34].另外,估测目前和未来生物反应过程中葡萄糖的吸收率及乳搪的生成率的软件也已经研制成功[35],这使得对细胞培养过程的状态监控更加及时、准确.5 维持细胞生长所需的最佳条件影响细胞培养的主要因素有C O 2、DO 、温度、pH 值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛、培养基成分等.一般来说,最适C O 2水平为4%~10%,DO 维持在20%~50%,温度一般为37e ,pH 值在710~714之间.葡萄糖是细胞培养过程中的主要能量来源,必须维持在一定水平.氨、乳酸、甲基乙二醛等是动物细胞培养的主要限制因素.氨离子抑制谷氨酰胺(Gluta mine,G1n)的代谢途径,应限制Gln 用量,并尽可能去除培养基中的氨;高浓度乳酸可抑制细胞生长,应降低培养基中的葡萄糖浓度以减少乳酸产生,在动物细胞大规模培养中常常需添加果糖,以减少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基,实际应用中降低甲基乙二醛的浓度主要也是通过降低葡萄糖用量来实现的[7].6 物理场效应对细胞生长的影响各种物理场如静电场、磁场等都会对细胞的代谢产生一定的作用[36,37].物理场对细胞的刺激作用存在阈值,不同的物理场对不同细胞存在不同的场效应.人们目前对各种物理场对细胞的刺激效应有了一定研究,并试图将之应用到动物细胞培养体系之中[38].Bowlin 等[39]证实,细胞经电场作用刺激后,其生理活性有很大的提高,胞外某些物质的含量也明显上升.这说明适当的电场刺激可以提高细胞培养的效率.同时,一定的静电场还有助于细胞产物的分离[40].611 增强细胞抗凋亡能力在动物细胞大规模培养的初期,细胞数量不断增加,表达重组蛋白的能力也在逐步提高.随着细胞数量达到顶峰之后,细胞数量和表达水平将下降.因此,在动物细胞大规模培养的后期,维持细胞的高活力是一个富有挑战性的课题.最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死,而人们逐渐认识到至少有一些细胞系在生物反应器中出现细胞死亡的主要原因是细胞凋亡[7].随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入,细胞凋亡的发生被认为是动物细胞大规模培养过程的重要制约环节,预防并控制细胞凋亡也因此成为研究的热点.用基因工程方法将Bc-l 2这种细胞调亡抑制基因导入细胞,已成为众多学者的选择[41,42].Bc-l 2基因的过量表达能抑制Gln 或氧缺乏引起的细胞凋亡,减少细胞特定营养成分的消耗,提高细胞密度和目的蛋白产量[42,43],这对于细胞大规模培养具有重大意义.但Bc-l 2等抑制基因对细胞的这种保护作用依赖于它的高水平表达,因此,需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因.在动物细胞大规模培养条件下,细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生,因此一种/细胞静止0过程可以有效降低营养成分的消耗和有毒代谢产物的产生,提高CHO 细胞的目的蛋白产率[44],其方法就是向C HO 细胞中导入p21、p27基因,使细胞周期中Gl 期延长(细胞静止).经过如此改造后,细胞活力正常,外源基因表达蛋白量提高,并使产品成本降低,产量提高,遗传稳定性增加[45].612 选择合适的细胞培养工艺流加培养(Fed-batch)和灌流培养(Pefusion)是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式.另外可供选择的方式还有批式-反复流加(Batch-refeeding).虽然许多较老的病毒生产工艺采用批式操作(Batch),新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式,如批式-反复流加或灌流培养工艺.流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器,营养物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡,维持一个高细胞密度和高产物浓度.相对于流加培养,灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并带走代谢产物;同时,细胞保留在反应器中,可以达到很高的细胞密度.与其他方法相比,灌注培67第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展68仲恺农业技术学院学报第18卷养的产率可以提高一个数量级,并可以大大降低劳动力成本[46].灌注培养主要分为悬浮灌注培养和床层灌注培养两大类.悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上,加上一个细胞分离器而成,其中以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见;床层灌注培养则把细胞直接保留于床层,不需要分离器,其中以堆积床和大孔载体培养的应用较广泛[46].流加悬浮培养与灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同,两种操作形式的选择完全取决于每个产品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性,以及产品的最高产量需求和质量要求.7存在问题711无血清培养基适用范围窄目前应用的无血清培养基表现为细胞的适用谱极窄,细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便.因此无血清、无蛋白、可高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基是未来研制无血清培养基的方向.712固定化培养技术及微载体需进一步探索目前虽然对各种固定化载体某一方面的性能进行了一些改进,但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济适用、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求.因而研制新型的固定化载体以满足上述要求,是动物细胞固定化培养技术继续发展的一个主要方向.在细胞的固定化培养过程中,往往忽略了载体对细胞的生物学作用.即只注意了载体对细胞的机械保护而忽略了载体对细胞代谢过程的影响和调控.尝试研制具有一定生物学功能的细胞固定化载体,是载体研究中一个全新的领域.结合当今最新的纳米技术,可以在载体表面附着一些生物功能性分子,对培养过程进行一定的调节;同时通过不同的生物以及选择不同的加入时间,可望实现培养过程的阶段性调控.但是目前有关这方面的研究仍主要集中在对无机膜的修饰和对无机分子的研究,而有关生物大分子的应用仍处在尚未开发的阶段[47].713生物反应器装置及生产工艺仍需改进目前动物细胞大规模培养中所应用的生物反应器皆有其独特的优点,但同时也存在一定的不理想因素.低或无剪切力,同时还能在线监控的生物反应器是以后研究的重点.另外,动物细胞培养系统在利用新技术、新工艺的同时,还不能协调细胞及其环境与新技术应用的关系.在目前的技术条件下,对这一关系的协调仍旧处于摸索阶段,尚缺乏足够的理论指导.8展望经过几十年来的研究与实践,目前虽然动物细胞大规模培养技术还存在不少问题,但较之几十年前已是质的飞跃.随着这一技术的进一步发展,人们还将不断努力,研制更理想的生物反应器,以获得高密度、高活力的细胞;开发新的无血清培养基,使细胞的生长状态更好,生物制品更安全;建立细胞培养与产物分离的涡合系统,充分利用培养液,以降低生产成本等,从而使动物细胞培养技术在生物制品制备和基因工程等领域得到更广泛的应用.参考文献:[1]VOIGE A,ZIML F.Hybrid oma cell growth and ant-i neuroblasona monoclonal antibody production in spinner fleeks using a protein-freemedium with microcarrier[J].J Bi otechnol,1999,68(2-3):213-226.[2]SINACANE M S,DRAPEAU D,ADAMSON S K.Adaptation of mammalian cells to growth in seru mfree media[J].Mol Biotechnol,2000,15(3):249.[3]徐冰.大规模哺乳动物细胞培养[J].国外医学:预防、诊断、治疗用生物制品分册,1997,20(5):212.[4]忻亚娟,朱家鸿.动物细胞培养技术的进展[J].浙江预防医学,2001,(14):48-50.[5]邓继先,杨琴,程萱,等.用于生产rKuEPO的无血清培养基的研究[J].军事医学科学院院刊,1997,2l(4):244-250.[6] 陈昭烈.动物细胞培养过程中的凋亡[J].生物工程进展,1998,18(6):17-20.[7] 邹寿长,李干祥,杨葆生,等.大规模动物细胞培养技术研究进展[J].生命科学研究,2001,5(2):102-108.[8] ZHAOLIE C,DIRK L,KAI I J.High -ensi ty culture of recombinan t Chinese hamster overay cells producing prothrombi n in protein -freemedium[J].Biotechnology Letters,2001,23(10):767-770.[9] LIU C M,HONG L N.Developmen t of a shaking bi oreactor system for animal cell cultures[J].Biochemical Engineering Journal,2001,7(2):121-125.[10] GOUTAM S,ALOK B,SATYABROTO S.Modeling of the oxygen transfer characteristics of a -see -saw .bioreactor[J].Chemical En -gineering &Technology,2001,24(1):97-101.[11] 谭昌耀.用哺乳动物生产人用治疗制剂的发展与改进[J].国外医学:预防、诊断、治疗用生物制品分册,2001,24(1):11-14.[12] HAUT B,AMOR H B,C OULON L,et al .Hydrodynamics and mass transfer in a Couette-T aylor bioreactor for the culture of animalcells[J].Chemical Engineering Science,2003,58:777-784.[13] KAMEN A A,TOM R L,CARON A W,et a l .Culture of insect cells in a helical ribbon impeller bioreactor[J].Biotechnology andBioengineering,1991,38(6):619-723.[14] SHI Y,RGU D D Y,PERFORMANCE S H.Performance of mammalian cell culturebioreactor with a new impeller design[J].Biotechnology and Bioengineering,1992,40(2):260-264.[15] C HEN Zhaolie,PIRK Lutkemeyer,KAI Iding.High-density culture of recombinant Chinese hamster ovary cells producing prothrom -bin in protein-free mediu m[J].Biotechnology Letters,2001,23:767-770.[16] 李学梅,林建平,刘 娥,等.固定化米根酶发酵制L -乳酸[J].菌物系统,1998,17(4):318-326.[17] MEISSNER P,SCHRODER B,HERFURTH C,et al .Develop ment of a fi x ed bed bioreactor for the expansion of human hematopoieticprogenitor cell[J].Cytotechnology,1999,30:227-234.[18] 谭文松,陆 健,张元兴.气升式生物反应器在杂交瘤细胞培养中的应用[J].生物工程学报,1996,12(4):477-481.[19] KONG D,C ARDAK S,C HE N M,et al .High cell density and productivi ty culture of Chinese hamster ovary cells in a fluidized bedbioreactor[J].Cytotechnology,1999,29:215-220.[20] MARYA I C,J ULIO A L,RICARDO J G.Solving design equations for a hollow fiber bioreactor with arbitrary kinetics[J].ChemicalEngineering Journal,2001(84):445-461.[21] VINCENZA C,STEFANO C,GABRIE LE I.A theoretical analysis of transport phenomena in a hollow fiber membrane bioreactor wi thim mobilized biocatalyst[J].Journal of membrane Science,2002,206:217-241.[22] FREED LE,VUNJ AK -Novakovic G.M icrogravi ty tissue engineering[J].I n vitro Cellular and Develop ment Biology,1997,33:381-387.[23] 胡 江,陶祖莱.组织工程研究进展[J].生物医学工程学杂志,2000,17(1):75-80.[24] 万 超,杨庆铭,邓廉天,等.MSCs -PGA 兔复合物在RCCS 中的成骨潜能[J].上海第二医科大学学报,2002,22(5):403-407.[25] 何 川,邓廉天,周来生,等.RCCS 中犬成骨细胞nB GC 复合物联合培养的实验研究[J].上海第二医科大学学报,2003,23(4):301-304.[26] VUNJAK Novakovic G,MARTIN I,OBRADOVIC B,et al .Bioreact or cultivationconditions modulate the composition and mechanicalproperties of tissue -eng i neering cartilage[J].J Orthop Res,1999,17(1):130-138.[27] SC HWARZ R P,GOODWIN T J,WOLF D A.Cell culture for threedimensional modeling i n rotating wall vessels:an application insimulated microgravity[J].J Tissue Cul ture Methods,1992,14:51-58.[28] QING -Qing Q,PAUL D,PORTONOVO S,et al .Fabricatin,characterization andevaluation of bioceramic hollow microspheres used asmicrocarriers for 3-D bone tissue formation in rotati ng bioreactors[J].Biomaterials,1999,20:989-1001.[29] KONS TANTIONS J D,LEONARD J N,TIMOTHY J B,et al .The simulated microgravity environment maintains key metabolic func -tions and promotes aggregation of pri mary porcine hepatocytes[J].Biochi mica et Biophysica Acta,2001,1526:119-130.[30] GIRARD P,JORDAN M,TS AO M ,et a l .Smal-l scale bioreactor system for p rocess developmen t and opti mization[J].BiochemicalEngineering Journal,2001,7:117-119.[31] VAN Wezel A L.Growth of cel-l s trai ns and Primery cells micro -carriers in homogenecus culture[J].Nature,1967,216:64-65.[32] 王佃亮,肖成祖,陈昭烈,等.微载体高密度培养Vero 细胞研究[J].生物工程学报,1996,12(2):164-170.[33] 张 立,严 春,范卫民,等.Vero 细胞的微载体培养[J].华东理工大学学报,1998,24(6):659-663.[34] HU W S,AUNINS J rge -scale mammalian cell culture[J].Curr Opin Biotech,1997,8:48-153.69第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展。