PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构

中国环境科学 2011,31(4)：597~602 China Environmental Science PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构

郭飞宏1,郑正2*,张继彪2(1.南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京 210093；

2.复旦大学环境科学与工程系,上海 200433)

摘要：利用PCR-DGGE技术研究塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构变化,结果表明,微生物的变化与滤池体积大小、水力停留时间和污染物负荷有关,微生物群落结构在不同滤池层中变化较大.12个样品泳道中的总细菌的Shannon-Wiener多样性指数从0.25变化到1.27,一级滤池微生物多样性指数从0.29变化到1.05,二级滤池微生物多样性指数从0.75变化到0.97,三级滤池微生物多样性指数先从0.87减少到0.25,后由于葡萄糖的加入增加到1.27.二级滤池出水中葡萄糖的加入,加强了系统内微生物的活性,从而三级滤池砂石和青石层细菌条带变亮变多.经过克隆测序和系统发育树分析,塔式蚯蚓生态滤池内的微生物多为单细胞菌属、假单细胞菌属、革兰氏阴性菌属和不可培养杆菌属,不同细菌条带在不同级滤池内差异变化明显.

关键词：PCR-DGGE；蚯蚓生态滤池；微生物群落；指数；菌属

中图分类号：X705 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2011)04-0597-06

Research on microbe community in tower earthworm ecology-filter by PCR-DGGE. GUO Fei-hong1, ZHENG Zheng2*, ZHANG Ji-biao2 (1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210093, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：597~602

Abstract：Change of microbe community in tower earthworm ecology-filter was studied in this research with PCR-DGGE technology (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis). These results showed that: the change of microbe community was obvious and linked with hydraulic resident time、pollutation burden and the volume of filters. Meanwhile, Shannon-Wiener Index of biodiversity increased from 0.25 to 1.27 in an all-round way, including 0.29～1.05 in the first filter, 0.75~0.97 in the second filter and 0.87~0.25~1.27 caused by some glucose added into influent in the last filter. Under the same reason, the activity and light of denitrifying bacteria were intensified on bluestone and gravel layers. After analysis of cloning sequencing and phylogenetic tree, most of the inferred bacteria were Sphingomonas, Pseudomonas, Gram-negative bacteria and uncultured Bacillus and changed evidently in different filters.

Key words：PCR-DGGE；earthworm ecology-filter；microbe community；index；bacteria

塔式蚯蚓生态滤池是利用蚯蚓能够提高土壤通气性能和促进有机物分解而设计的一种新型污水处理工艺,它充分利用了植物、动物和微生物的协同作用,相比传统污水处理工艺具有投资省、处理效率高、无污泥产生等优点[1].“蚯蚓”在该系统对污染物降解中的作用:一是去除污水中的有机物,二是提高土壤通气性活化土壤,从而加大土壤富氧程度,间接促进系统内的耗氧微生物的活性.但是塔式蚯蚓滤池内部结构复杂,以往的研究主要集中在进水、出水等外部影响因素上,没有对塔式蚯蚓生态滤池内部微生物群落结构[1]进行研究,使得对污水处理过程中微生物与处理效果关系性的研究仍处于“黑盒子”状态.

传统的微生物生态学研究是基于微生物的直接培养来分析环境中微生物的种群结构及其生态关系的,由于自然界中可培养微生物数量占实际微生物数量不足10%,传统方法显然不适合微生物群体结构研究.PCR-DGGE技术不经过分离培养技术而直接对环境微生物进行分析,克服了传统微生物分类鉴定法的不足,可以直接可靠收稿日期：2010-07-10

基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07101-004)

* 责任作者, 教授, zzhenghj@

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的反映出微生物的多样性[2].

本研究利用PCR -DGGE 技术,以实验平台上运行1年的塔式蚯蚓生态滤池为研究对象,考察了三级塔式蚯蚓生态滤池中的微生物群落的演变.旨在为工艺运行和滤池内微生物的动态变化之间架起一座沟通桥梁,根据测得的滤池内微生物群落结构确定优势菌群进而调节工艺参数提高污水处理效率.

1 材料与方法

1.1 塔式蚯蚓生态滤池 塔式蚯蚓生态滤池构建于2009年2月中旬,共有三级:一级、二级的尺寸(长×宽×高)0.5m× 0.5m×0.6m,三级的尺寸1.1m×0.65m×1.2m.每级滤池填料包括土壤、细砂、碎青石和鹅卵石,土壤表面均栽种吊钟柳起到二次布水作用.实验使用的大平2号蚯蚓属于赤子爱胜蚯蚓,主要分布在土壤表层土和中层土中,蚯蚓在土壤中的接种密度为4.63g/L.进水为南京大学学生宿舍化粪池出水,采用蠕动泵控制进行间歇进水.水力负荷0.25m 3/(m 2⋅d),每天进水6h 进水与落干的时间(即湿干比)为1:3.

生活污水首先进入厌氧池,经过一段时间的

厌氧硝化作用,部分污染物质得到降解.厌氧池中

的出水通过水泵的作用,分别进入到一级滤池、

二级滤池和三级滤池.污染物在多级滤料、蚯蚓和植物的共同作用下得到去除,三级滤池的出水达到国家污水排放的一级A 标准.

一级

二级

三级

葡萄糖

卵石层

土壤层砂石层青石层

厌氧池

水泵集水区

图1 塔式蚯蚓生态滤池的结构

Fig.1 Structure diagram of tower earthworm ecology-filter

1.2 样品采集

分别于2009年11月和2010年6月从塔式蚯蚓生态滤池土壤层和砂石层取样.其中一级、二级滤池取样3份,分别是土壤表层土、中层土和砂石层,三级滤池取样6份分别是:土壤表层土、表层下5cm 土、中层土、下层土、砂石层和青石层.所有样品经冷冻干燥仪-80℃冻干后,研磨后过100目塞,样品分装放在-20℃保存待分析[3].

1.3 主要试剂

TE 缓冲液、二溴乙锭染色剂、1×TAE 均为

自制,TaqDNA 聚合酶和10×Buffer 购自宝生物工程(大连)有限公司,扩增引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,超纯水用Millipore 公司的Simpicity 型超纯水机制成,琼脂糖购自上海生工有限公司,dNTPs 和PCR 产物DN A Maker 购自宝生物工程(大连)有限公司. 1.4 实验方法

1.4.1 基因组DNA 的提取, DN A 的提取采用MOBIO 公司的Ultra Clean Soil DN A isolation KIT 试剂盒,包括Bead Solution Tubes 、2ml Collection Tubes 、Spin Filter Units in 2ml Tubes 、