截短型人bid基因的克隆,表达和促凋亡作用的研究

bid 即 B H3 interacting deat h agonist , 是 Bcl22 家 族中的成员之一 , 最初通过酵母双杂交筛选获得 。 bid 的结构中仅含 B H3 结构域 , 能与 Bcl22 和 Bax 相 互作用 , 并诱导细胞凋亡 [1 ] 。在 Fas/ TN F2R1 介导 的凋亡途径中 , 细胞质中相对分子质量 ( M r) 为 22 000 的 全 长 bid 被 caspase28 剪 切 而 激 活 成 M r 为 15 000 的 t bid (t runcated bid , t bid) 分子[2 ,3 ] 。t bid 转 移到线粒体 , 可引起细胞色素 C ( Cyt C) 的释放[224 ] , 其机制尚不清楚 。目前有研究表明 , bid 不仅可与其 他 Bcl22 家族蛋白相互作用 , 而且也可与膜磷脂相互 作用 。这样 , bid 作为一种“死亡配体”接受来自胞质的 死亡信号 , 然后转移到线粒体 , 把该信号传递给“死亡 受体”(如 BAX 或 BA K) [4]或心磷脂 (Cardiolipin) [5] , 最 终导致 Cyt C 释放 、效应 caspase 活化和细胞凋亡的发 生 。本研究中 , 我们探讨了与绿色荧光蛋白 ( GFP) 共 表达的 tbid 在 Hela 细胞中的促凋亡活性 。
Abstract AIM : To explore the expression of the truncated bid gene and its pro2 apoptotic effect on Hela cells. METHODS : A full2length human bid gene wa s cloned by RT2PCR and confirmed by sequence analy2 sis. By deleting the 60 amino acids of N2terminal the truncated bid (tbid) gene wa s o btained and then inserted into the eukary2 otic expre ssion vector p IRES22EGFP. After the tbid gene wa s
(第四军医大学 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 1 生物化学与分子生物学教研室 , 2 免疫学教研室 , 陕西 西安 710032 ; 3 唐都医院骨科 , 陕西 西安 710038)
The cloning and expression of the trun2 cated human bid gene and its pro2apop2 totic effect on Hela cells
Q I U Xi u2chu n 1 ,3 , Y U Cui2j uan 1 , M EN G Y an2li ng 1 , X U Y an2m i n g 1 , Z HA O J i n g 1 , J IN M i ng 1 , W A N G Cheng2ji 1 , FA N Qi ng2y u 3 , YA N G A n2
some 复合物后 , 缓缓滴加至洗过的细胞中 , 于 37 ℃、 50mL/ L CO2 条件下培养 6 h , 吸去转染液 , 加入适 量含 200 mL/ L 小牛血清的无抗生素 RPM I1640 培 养液 , 继续培养 12～24 h 。分别于转染后 12 、18 、24 h , 取出盖玻片 , 用 PBS 洗 3 遍 , 加多聚甲醛固定 30 min , 再以 PBS 洗 3 遍 , 用甘油 PBS 封片后 , 于荧 光显微镜下观察 。转染后 24 h , 取出爬片 , 用 PBS 清洗 , 40 g/ L 多聚甲醛固定 30 min 。根据检测试剂 盒 Td T2FragEL TM 使用说明书进行 TUN EL 染色 , 并以 DAB 显色 、甲基绿衬染 。 1. 2. 5 转染细胞的电子显微镜观察 细胞转染 27 h 后 , 用 2. 5 g/ L 的胰酶消化成单细胞 , 离心收集细 胞 , 用 RPMI1640 洗两遍 , 以 1 500 r/ min 离心 10 min , 弃上清 , 轻轻滴加 4 ℃预冷的电镜固定液固定 4 h 。 用细针轻轻拨离细胞团块 , 以使管底细胞彻底固定 后 。送校电镜中心制片 、染色 , 并在透射电镜下观察 细胞的超微结构变化 。
transfected into Hela cells under lipofectamine mediation , the effect of target gene expre ssion on morphology and growth of Hela cells were o bserved under fluore scence and electron mi2 cro scop e s and analysed by TUNEL staining. RESUL TS : p IRES22EGFP containing tbid gene wa s constructed succe ssful2 ly. After Hela cells were transfected with GFP expre ssion vector of tbid gene , tbid wa s expre ssed which wa s followed by de2 crea sed cell fluore scence intensity , poor cell growth , and cell death. Cell shrinkage and nuclear condensation , typical apoptotic characteristics , were observed by electron microscope observaion and Tunel staining. CONCL USION : The expre ssion of tbid can effectively induce apopto sis of Hela cells. Keywords : bid gene ; apopto sis ; p IRES2EGFP ; Hela cell
ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2004 , 20 (1)
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·论著·
文章编号 : 1007 - 8738 (2004) 01 - 0019 - 04
截短型人 bid 基因的克隆 、表达和促凋亡作用的研究
裘秀春1 ,3 , 于翠娟2 , 孟艳玲1 , 许彦鸣1 , 赵 晶1 , 金 明1 , 王成济1 , 范清宇3 , 杨安钢1 ,23
Tel : (029) 83374516214 ; Email :qiuxiuchun @hot mail. com 3Corresponding aut hor , Email :agyang @f mmu. edu. cn
摘要
目的 : 探讨截短型 bid (truncated bid , tbid) 基因的表达对 Hela 细胞的促进凋亡活性 。方法 : 用 R T2PCR 法克隆人全长 bid 基因 , 测序正确后 , 通过 PCR 截去编码 N 末端 60 个氨基酸 残基的基因 , 而获得 tbid 基因 。将其克隆入含绿色荧光蛋白 ( GFP) 基因的真核表达载体 p IRES22EGFP 中 , 用脂质体法转 染 Hela 细胞 。通过荧光显微镜 、电子显微镜观察和 TUN EL 检测法 , 检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况 的影响 。结果 : 成功地构建了 tbid 基因的真核表达载体 。以 其转染 Hela 细胞后 , tbid 基因在细胞中得到表达 , 随后引起 细胞荧光强度下降 , 生长状况不良甚至死亡 。电镜观察及 TUN EL 检测的结果显示 , 许多细胞呈典型的凋亡特征 。结 论 : tbid 基因的表达可促进 Hela 细胞的凋亡 。 关键词 : bid 基因 ; 细胞凋亡 ; 绿色荧光蛋白 ; Hela 细胞 中图分类号 : Q255 文献标识码 : A
收稿日期 : 2003 - 09 - 02 ; 修回日期 : 2003 - 10 - 10 基金项目 : 国家杰出青年科学基金资助 (No. 399Z5036)
国家高技术研究发展计划 (863) 资助 (No. 2001 AA217101) 作者简介 : 裘秀春 (19632) , 女 , 浙江嵊州人 , 博士生.
gang 1 ,23 1Department of Biochemistry and Molecular Biology , 2Department of Immunology , Xi’an 710032 ; 3Ort hopaedic On2 cology Institute , Tangdu Hospital , Fourt h Military Medical Uni2 versity , Xi’an 710038 , China
1 材料和方法
1. 1 材料 大肠杆菌 DH5α菌株 、载体 pcDNA3 、人 淋巴瘤细胞系 J urkat 和人宫颈癌细胞系 Hela , 均为
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ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2004 , 20 (1)
本室保存 。绿色荧光蛋白表达载体 p IRES22EGFP 购 自 Clontech 公司 。限制性核酸内切酶 、T4 DNA 连接 酶 、RPM I1640 、新生牛血清 、TRIzol 反转录试剂盒及 脂质体 Lipofect AM IN E TM2000 , 均为 Gibco 公司产 品。 1. 2 方法 1. 2. 1 引物的设计与合成 根据 PCR 引物的设计原 理 , 设计能够扩增出 bid cDNA 全长的一对引物 , 上游 引物 1E 的 5′端带有 1 个 EcoR I 识别位点 , 下游引物 2XS 的 5′端带有 1 个 Xba I 及 S al I 识别位点 。另设计 一对引物 , 将全长 bid 截短 , 扩增出 tbid 基因 。上游引 物 3261E 的 5′端带有 1 个 EcoR I 识别位点 , 下游引物 同 2XS。3 条引物均由上海生工技术服务公司合成 , 序 列 如 下 : 1E: 5′2TTTGAATTCATG2 GACTGTGAGGTCAACAAC23′; 2XS: 5′2TTTTCTA2 GAGTCGACTCAGTCCATCCCATTTCTGGC 23′; 3261E: 5′2TTTGAATTCAT G GGCAACCGCAGCAGCCACTCC2 3′。 1. 2. 2 bid 基因的 R T2PCR 于 5 ×10 6 ～10 ×10 6 对数生长后期的 J urkat 细胞中 , 加 1 mL TRIzol 试剂 , 使细胞完全裂解后 , 抽提总 RNA。以 2XS 为引物 , 根 据反转录试剂盒的说明书反转录合成 cDNA。以反转 录的 cDNA 为模板 , 采用 1E 和 2XS 引物进行 PCR 扩 增 。PCR 产物经 EcoR I 和 Xba I 双酶切后 , 回收并克 隆入空载体 pcDNA3 中 。构建的重组载体 pcDNA32 bid , 再经 EcoR I 和 Xba I 酶切鉴定 , 并测序证实 。 1. 2. 3 tbid 基因及 GFP 基因真核表达载体的构建 以 pcDNA32bid 为模板 , 以 3261E 和 2XS 为引物 , 扩 增 tbid 基因 , 构建的重组载体 pcDNA32tbid , 经 EcoR I 和 Xba I 酶切鉴定及测序证实 。用 EcoR I 和 S al I 双酶切重组载体 , 回收 400 bp 左右片段 , 克隆入载 体 p IRES22EGFP 的多克隆位点内 , 再用 EcoR I 和 S al I 酶切鉴定 。 1. 2. 4 细胞转染及 TUN EL 染色检测 将对数生长 期的 Hela 细胞用 0. 25 g/ L 胰酶消化后 , 按一定的密 度分别接种于 6 孔板中或含盖片的 12 孔板中 , 继续 培养 。待细胞生长至底面积的 80 %时 , 吸出培养液 , 用无血清 、无抗生素的 RPM I1640 洗细胞 2 次 。将适 量的质粒和相应量的 Lipofect AM IN E TM 2000 分别 溶于无血清 、无抗生素的 RPM I1640 中 , 轻轻震荡 5 min 即成转染液 , 静置 20 min , 待其形成 DNA2lipo2