不同产地黄芪药材的UPLC_Q_TOF_MS指纹图谱研究_芮雯

腈 － 异丙醇（ 7∶ 3） 梯度洗脱（ 0 ～ 1 min，10% →20% B； 1 ～ 15 min，20% →100% B； 15 ～ 16 min，100% → 10% B； 16 ～ 18 min，10% B） 。进样量为 5 μL，流速 为 0. 3 mL·min － 1 。 2. 3 质谱条件 采用 ESI 离子源，在正离子模式与 负离子模式下分别采集数据。数据采集范围 m /z 100 ～ 1000。 离 子 源 参 数： Capillary： 3 kV，Sample cone： 30 V，Source Temp： 100 ℃ ，Desolvation Temp： 350 ℃ ，雾化气（ N2 ） 流速 60 L·h － 1 ，脱溶剂气（ N2 ） 流速 600 L·h － 1 ； 碰撞能量（ CE） ： 10 ～ 40 V。Lock Mass 为 氯 霉 素，正 离 子 模 式［M + Na］+ 为 m / z 345. 0021，负离子模式［M － H］－ 为 m / z 321. 0045。 2. 4 数据分析
— 608 —
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
量元素等［3，4］。 传统指纹图谱研究多采用 UV 检测器，无法体
现无紫外吸收的其他类成分，因此，传统指纹图谱研 究技术用 于 药 材 质 量 的 评 价，具 有 一 定 的 片 面 性。 近年来新发展起来的超高效液相色谱 /四极杆飞行 时间串联质谱仪（ UPLC / Q － TOF － MS） 分析技术， 集 UPLC 快速有效的色谱分离能力和 Q － TOF 高分 辨质谱灵敏度高、定性能力强于一体，已成为中药活 性成分研究的最有效的分析手段之一。
本实验首次应用 UPLC / Q － TOF － MS 技术，建 立不同黄芪药材的指纹图谱，并结合多变量模式识 别方法主成分分析（ PCA） 区分 7 个产地的黄芪药 材，找出差异性最大的化合物，以反映不同产地样品 化学成分的变化。该方法获得信息更多，特征性更 强，可用于黄芩药材的鉴别及质量评价。 1 仪器与试剂
药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32（ 4）
— 607 —
不同产地黄芪药材的 UPLC / Q － TOF － MS 指纹图谱研究*
芮雯，冯毅凡，石忠峰，姜苗苗＊＊
（ 广东药学院中心实验室，广州 510006）
摘要 目的： 采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪（ UPLC / Q － TOF － MS） 建立黄芪药材的指纹图谱，初步鉴定其
水退肿 之 功 效［1］。 蒙 古 黄 芪 主 产 于 山 西、内 蒙 古、 河北、陕西、甘肃等省区，为目前野生资源最丰富、栽 培量最大的品种，同时传统认为其质量最优。研究 表明，黄芪的化学成分主要为黄酮类和三萜皂苷类 化合物［2］。另外还有单糖、多糖、氨基酸、甾醇及微
＊ 广东省自然基金博士启动项目“参芪扶正注射液的核磁共振指纹图谱研究”资助（ No． 10451022401004962） ＊＊ 通讯作者 Tel： （ 020） 39352526； E － mail： miaomiaojiang@ 126． com
PCA 分析： 将数据预处理结果通过 MarkerLynx 进行多维数据的分析。数据的多元统计分析采用主 成分分析（ PCA） 方法进行模式识别。建立模型后， 分别产生得分矩阵图和载荷矩阵图，通过得分矩阵 图来获得各组数据的分型信息。而载荷矩阵图能反 映各个变量对样品分型的影响。 3 结果与讨论 3. 1 色谱条件的优化 分别用甲醇 － 水、乙腈 － 水、乙腈 － 异丙醇 － 水、乙腈 － 异丙醇 － 水 （ 含甲 酸） 等体系进行洗脱，结果以乙腈 － 异丙醇 － 水（ 含 甲酸） 体系得到的色谱峰形较好，色谱峰信息较多 且较稳定。以梯度洗脱法使全部组分在 18 min 内 流出，且分离效果好。 3. 2 供试品溶液的制备方法的优化 分别用 95% 乙醇回流、甲醇超声、丙酮超声等提取方法制备供试 品溶液。结果表明，95% 乙醇回流和甲醇超声获得 的色谱信息较多，信号强度好，考虑到操作方便性等 因素，确定优化方法为甲醇超声提取。 3. 3 方法学考察
RUI Wen，FENG Yi － fan，SHI Zhong － feng，JIANG Miao － miao＊＊
（ Central Laboratory，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）
Abstract Objective： The fingerprint of Astragalus membranaceus was developed with ultra － performance liquid chromatography / quadrupole － time － of － flight mass spectrometry （ UPLC / Q － TOF － MS） ． The main components were preliminary identified． Combined with principal component analysis （ PCA） pattern recognition method to evaluate the quality of herbs from different areas． Methods： The chromatographic separation was performed on a BEH C18 column with a gradient elution of water － acetonitrile － isopropanol． The mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was used as detector and operated under the positive and negative ion modes． Using Markerlynx software，the different areas of Astragalus membranaceus were analyzed by PCA． Results： The fingerprint of Astragalus membranaceus was established within 18 min by UPLC / Q － TOF － MS． Twenty one samples were apparently classified into 7 groups by PCA． A brief list of 8 differential compounds is presented，including calycosin，formononetin，2'，3'，7 － trihydroxy － 4' － methoxyisoflavan，astragalosideⅠandⅡ． Conclusion： The fingerprint obtained by UPLC / Q － TOF － MS has good reproducibility and characteristics． Application of chemometric methods can fully reflect the chemical composition of different area of Astragalus membranaceus，and provide its experimental basis of quality control． Key words： UPLC； Q － TOF tandem mass spectrometry； Astragalus membranaceus； fingerprint； principal component analysis
ACQUITY UPLC / Q － TOF － MS 系统（ 美国 Waters 公司） ，采用电喷雾离子源（ ESI） 、二元高压泵、 在线脱气装置、自动进样器、柱温箱。数据采集与处 理采用 Masslynx 4. 1 软件。
乙腈、异丙醇均为色谱纯，购自德国 MERK 公 司，水为超纯水器所制（ Sartorius 公司，德国） ，其他 试剂 为 分 析 纯。对 照 品 氯 霉 素 （ 批 号： 130436 － 200704） ，购自中国食品药品检定研究院。
黄芪是常用的传统中药之一，为豆科植物蒙古 黄 芪 Astragalus membranaceus （ Fisch． ） Bge． var． mongholicus （ Bge． ） Hsiao 或 膜 荚 黄 芪 Astragalus membranaceus （ Fisch． ） Bge． 的干燥根。性微温，味 甘，归脾、肺经，有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利
主要色谱峰，并结合主成分分析（ PCA） 模式识别方法评价不同产地药材质量。方法： 用 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱，以水
－ 乙腈 － 异丙醇体系梯度洗脱，使用 ESI 离子源，正、负离子模式下采集数据。应用 Markerlynx 软件进行不同产地药材的 PCA
分析。结果： 在 18 min 内建立了黄芪药材的 UPLC / Q － TOF － MS 指纹图谱，结合 PCA 分析，可以区分不同产地的药材，并找出
Βιβλιοθήκη Baidu
包括毛蕊异黄酮，芒柄花素，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ等 8 个差异最大的化合物。结论： UPLC / Q － TOF － MS 方法所得谱图重现性和特
征性较好，可以用于黄芪指纹图谱的快速鉴别。应用化学计量学方法可以较全面地反映不同产地药材学成分的差异，为其质
量控制提供实验依据。
关键词： 超高效液相色谱； 四极杆飞行时间质谱； 黄芪； 指纹图谱； 主成分分析
中图分类号： R917
文献标识码： A
文章编号： 0254 － 1793（ 2012） 04 － 0607 － 05
UPLC / Q － TOF － MS study on fingerpint of Astragalus membranaceus obtained from 7 different origin*
预处理： UPLC / Q － TOF － MS 分析检测所得谱 图库，通过 MarkerLynx（ 美国 Waters 公司） 软件进行 峰检测和峰匹配，生成包含保留时间、核质比、峰面 积的数据矩阵。先将每个样品的峰面积归一化处 理，Pareto 法进行变量标度，再对数据矩阵进行分析 和数据筛选，进行去噪、缺失值的修正等处理。
7 个产地的黄芪药材共 21 批均购自当地药材 公司，经广东药学院中药鉴定系马鸿雁博士鉴定为 豆 科 蒙 古 黄 芪 Astragalus membranaceus （ Fisch． ） Bge． var． mongholicus（ Bge． ） Hsiao 的干燥根。来源： ①内蒙古 101101，101102，101103； ② 贵州 101104， 101105，101106； ③河南 101107，101108，101109； ④ 山 西 101110，101111，101112； ⑤ 甘 肃 101113， 101114，101115； ⑥黑龙江 101116，101117，101118； ⑦陕西 101119，101120，101121。样品标本 保 留 在 广东药学院中心实验室。 2 实验方法 2. 1 供试品溶液的制备 称取黄芪药材粉末（ 过 0. 25 mm 筛） 3 g，用 20 mL 甲醇室温超声（ 360 W，40 kHz） 提 取 3 次，每 次 40 min，过 滤，合 并 滤 液，过 0. 22 μm 微孔滤膜，即得。 2. 2 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 ACQUITY UPLC BEH C18 （ 2. 1 mm × 50 mm，1. 7 μm，Waters 公司） ，预柱为 AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre － Column 2. 1 mm × 5 mm 1. 7 μm，Waters 公司） ，柱温 30 ℃ 。流 动相 A 为 0. 1% 甲酸水，流动相 B 为 0. 1% 甲酸乙