Modfit分析细胞周期指南

Modfit分析细胞周期指南

本指南只提供在guava流式细胞分析仪上使用细胞周期模块分析后产生的数据,其它请参阅产品使用说明书,本指南仅供参考。

一.概述

细胞周期的概念:细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束,都要经历相同的变化阶段(即G1→S→G2→M )周而复始地进行活动,细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。一个细胞周期包括有丝分裂期(M)与分裂间期(G1、S、G2)。尽管在各种细胞中各期所占时间都不尽相同,但相对而言M期最短,S期却较长。

分裂间期:

1 、G1期,前一次有丝分裂完成到S期开始。各种与DNA复制有关的酶明显增多,线粒体、叶绿体、核糖体增多,内质网在更新扩大,高尔基体、溶酶体都增加,中心粒彼此分离、复制。

2、S期:DNA、组蛋白合成

3、G2期, S期结束后到有丝分裂开始。由上可以瞧出G2期、S期、M期反映了细胞的增殖活性,特别就是G2期、S期(因M期较短)。因而,G2/M％+S％反映了细胞增殖能力。二者有无差别要进行统计检验。

细胞周期阻滞:对于生殖细胞及保持增殖能力的细胞(如干细胞),由于细胞不断的增殖, 细胞总就是处于从G1 、S、G2 与M 期的连续的细胞周期中。在细胞周期的各阶段, 细胞分别进行着DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。每一阶段都就是下一阶段的准备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前监测与一个细胞周期顺利完成相关的生化事件,这包括各种体内外因素威胁下游事件进行时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理阶段的能力,而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。只有前一阶段的生理活动完成后,才能通过称为检定点的阶段,进入周期的下一步,一些突发事件引发的细胞反应能影响驱动细胞周期前进的因子,从而使细胞周期停滞在检定点, 这被称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。

比较相应的细胞G1 、S、G2 期差异有无统计学意义,才能说有无细胞周期阻滞。

第一张图:增值率S(合成期)＋G2/M(合成后期/分裂期):21、7％

第二张图:增值率S(合成期)＋G2/M(合成后期/分裂期):19、6％

据此分析两者的增值没有明显的差别。虽然第二张图比第一张图的S期有所增高,但G2期下

降了。

细胞周期就是基于细胞处于不同分裂时期具有不同的DNA含量而分析细胞处于不同的时期的方法。确切的说结果中G1期的百分比实际上就是G1＋G0期细胞的百分比。G2的百分比实际上就是G2＋M期细胞的百分比。

二.细胞样品制备

在样品的制备中存在的问题主要就是细胞的聚集与碎片,虽然细胞通透剂种类很多,但用于碘化丙啶(PI)染色进行细胞周期与倍体分析的细胞通透剂,通常为70％冷乙醇;乙醇必须与细胞充分快速混匀,避免细胞聚集成团;乙醇必须与细胞充分快速混匀,避免细胞聚集成团;流式细胞仪获取细胞的速度不宜太快,在guava上要使用最低速。

1、用户首先使用guava的细胞周期试剂盒,并按相应的操作步骤进行细胞固定、染色后,使用guava的细胞周期模块进行数据采集与分析,并生成以、ccy、CCY、FCS为后缀的文件。

2、细胞周期结果受样品制备的影响较大,请参阅相关文献进行样品制备。

3、guava细胞周期试剂盒简要操作步骤:

1) 制备70%的冰乙醇, -20C预冷2小时

2) 制备单细胞悬液,收集细胞,离心去除培液,用PBS重悬

3) 离心,去除PBS、加入100ulPBS重悬、

4) 将100ulPBS逐滴加入7ml70%的冰乙醇中固定过夜

5) 固定后,450g离心5分钟,弃固定液,用3mLPBS重悬、

6) 再次离心, 弃PBS,留细胞在离心管底部, 加入500ul Cell Cycle试剂

7) 染色30分钟后上机检测、

4、请注意在固定步骤中,加入－20℃70%酒精(1到2ml)打匀,固定,至少半个小时以上(约100ul细胞用枪一滴一滴加入到7ml装有预冷70%冰乙醇(-20至少2小时)中,每加一次都需要反复吹打,以避免细胞成团;需要注意的就就是加酒精固定的时候要用4℃预冷的酒精,缓慢的加,边加边晃动细胞,避免细胞黏连在一起。),(不做的话,可放入4℃冰箱保存2-3周问题不大。)另在用预冷PBS洗去固定剂时,不宜洗得过多,以免细胞损失。

三.Modfit操作指南

1、双击Modfit图标,打开Modfit软件(无需安装),打开界面如下:

不用理会弹出的信息,点击OK继续,会出现下述界面,每个均点击OK即可:

2、点击File,在弹出的对话框中选中要分析的细胞周期文件(FCS

3、0文件),点击open以打开文件:

3、打开文件,可以瞧到该文件包含10个数据文件,如果分析第一个文件,则选中第一个文件(如要在分析完第一个文件再分析第二个文件,需要关闭软件后,再次打开软件,重复上述过程,再在打开文件后出现的10个数据文件中再选中第二个进行分析,其它8个数据文件分析方法同上),点击OK以打开该数据文件:

4、在选择参数(Choose parameter for analysis)时选择第五个(FL2-P-PM2Max):

5、选择右下脚的Convert按钮,在下述界面的Linear-to-Log Conversion下选择第六个(FL2-W-PM2Width),点选Convert to log前的方框,再选中OK继续:

6、软件会回到前一界面,点击OK继续:

7、在下述界面中点选Enable Gate 1,并选中Define Gate 1按钮进行设门:

8、在下述界面中左侧(X Parameter)选第六个参数(FL2-W-PM2Width),右侧(Y Parameter)选择第五个参数(FL2-P-PM2Max),点击OK继续:

9、选中图中的黑色方框,当出现+字形调整其位置,正常的细胞周期细胞应为上下两群细胞的哑铃形状,并调整方框的大小,以去除碎片及粘连细胞: