Modfit分析细胞周期指南
细胞周期分析偏高注意事项
细胞周期分析偏高注意事项细胞周期分析是用来研究细胞生长和分裂过程的一种实验技术，通过测量细胞在不同细胞周期阶段的比例和持续时间，可以了解细胞周期的调控机制以及细胞增殖的异常情况。
在进行细胞周期分析时，需要注意以下几个方面：1. 细胞处理：在实验开始之前，需要将细胞制备至适宜的生长状态。
通常需要使用细胞培养基培养细胞，不同类型的细胞培养需要根据具体实验要求采取不同的操作方法。
同时，需要注意细胞的数量和密度，以确保细胞可以正常生长和分裂。
2. 细胞收集：细胞周期分析通常使用流式细胞术进行，因此需要先将细胞从培养皿或培养板中收集出来。
收集细胞时，要注意不要使细胞遭受太大的损伤，避免对细胞周期的影响。
可以使用胰酶等酶来进行细胞解聚，也可以使用细胞刮刀轻轻刮取细胞。
收集的细胞应尽可能集中和纯净，以获得准确的结果。
3. 样本处理：在细胞收集完成后，需要对样本进行处理。
通常需要将细胞用PBS 缓冲液洗涤一遍，去除残余的培养基和细胞碎片。
然后，可以使用乙醇等溶剂将细胞固定，以保持其形态结构。
固定时间和温度需要根据不同类型的细胞进行调整。
4. 细胞染色：为了鉴定细胞的不同细胞周期阶段，通常需要对细胞进行染色。
常用的染色剂有荧光素-氨基酸，乙蓝溴化物等。
染色剂浓度和染色时间需要进行优化，以充分显示细胞的染色状态。
5. 流式细胞仪分析：细胞染色完成后，可以通过流式细胞仪对细胞进行分析。
在进行分析之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保测量的准确性。
在设置参数时，需要根据细胞样本的染色状态进行调整，以使流式细胞仪可以准确识别和区分不同细胞周期阶段的细胞。
6. 数据分析：流式细胞仪会生成一系列的图表和数据，需要将这些数据进行统计和分析。
通常，可以使用软件进行细胞周期数据的分析，比如ModFit LT和FlowJo等。
数据分析的目的是了解细胞的增殖速率、细胞周期分布以及细胞周期的调控机制。
在进行细胞周期分析时，还需要注意以下几个技术细节：1. 细胞样本的保存：实验完成后，需要妥善保存细胞样本，以备后续的实验分析。
流式细胞周期结果图解读.docx
流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
1、细胞周期可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
流式细胞术系列之-用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期
【临床意义 临床意义】 临床意义
• 发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 发现癌前病变， • 在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 在肿瘤的诊断、 • 在指导肿瘤化疗中的作用
乳腺癌DNA异倍体患者生存率
乳腺癌肿瘤细胞异倍 体患者长期生存率显 著下降
【临床病例】 临床病例】
AL 骨髓
Diploid: 46.75 % Dip G1: 97.54 % at 46.06 Dip G2: 0.58 % at 92.12 Dip S: 1.88 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.26 Aneuploid 1: 47.55 % An1 G1: 93.05 % at 49.83 An1 G2: 0.00 % at 99.67 An1 S: 6.95 % G2/G1: 2.00 %CV: 2.13 DI: 1.08 Aneuploid 2: 5.70 % An2 G1: 94.97 % at 55.72 An2 G2: 5.03 % at 103.44 An2 S: 0.00 % G2/G1: 1.86 %CV: 4.52 DI: 1.21
• 倍体（Ploidy）： 倍体（ ）：原指染色体数目。流式中用来描述总的 ）： DNA含量。 • 二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 • DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四 倍体区域之外的统称异倍体。
结果分析
• CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手 工进行参数统计和计算； • 推荐使用ModFit分析软件（分析如下：） • 1、打开软件； • 2、在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1）， 去除聚集细胞，必要时可以设两个门。 • 3、在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图 • 注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析 凋亡、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。
细胞周期标准操作规程
细胞周期标准操作规程细胞周期是细胞从分裂到完成再次分裂的一个周期，在细胞生物学研究中是一个重要的研究对象。
为了能够准确地研究和观察细胞周期，科研人员需要遵循一系列的操作规程。
下面是细胞周期标准操作规程的详细说明：一、准备实验材料：1. 细胞培养基和试剂：选择适合细胞生长和分裂的培养基，如DMEM或RPMI 1640培养基，并根据需要添加相应的补充物和试剂，如FBS、L-谷氨酰胺、激素等。
2. 细胞株：选择适合的细胞株，如HeLa、CHO或HEK293等。
3. 细胞培养器具：包括细胞培养瓶、离心管、培养皿、显微镜片等。
4. 实验仪器：包括培养箱、离心机、显微镜等仪器。
二、细胞培养与维护：1. 细胞培养器官消毒：使用70%酒精将培养器官表面进行消毒处理，以确保无菌环境。
2. 细胞传代：将细胞转入新的培养瓶中，根据细胞倍增情况调整细胞密度，通常在细胞密度达到80%时进行传代。
3. 培养液更换：根据实验需要，定期更换培养液，以维持细胞的生长和稳定环境。
三、样品制备：1. 细胞准备：根据实验需要，将需要观察的细胞转入适当的培养器皿中，保证细胞的充分生长和附着。
2. 细胞处理：根据实验设计，添加适当的药物或诱导剂对细胞进行处理，如添加细胞周期调控剂。
3. 细胞采集：根据需要，使用离心机将细胞离心沉淀，然后去除上清液，最后将细胞沉淀用适量的缓冲液悬浮备用。
四、细胞周期监测：1. 细胞周期检测：根据实验需要，选择适当的方法和试剂对细胞周期进行监测，如细胞染色、流式细胞术、蛋白质检测等。
2. 数据采集：使用相应的仪器和软件进行数据采集和分析，记录细胞周期的相关参数，如G1期的长度、S期的进程等。
五、数据分析与结果解释：1. 数据处理：对采集的数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等，确保数据的可靠性和准确性。
2. 结果解释：根据数据分析结果，对细胞周期的变化和相关现象进行解释和讨论，以得出科学结论，如细胞周期的调控机制、细胞周期异常与疾病的关系等。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤欧阳学文取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP 管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP 管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C——Flowjo软件分析FCMDNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤(仅供参照)
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C。
运用ModFit LT进行手动分析
运用ModFit LT进行手动分析如ModFit LT在自动分析过程中无法正确确定峰值的位置或样本的倍型，或者你希望自己选择分析的模式，那么你可以用手动分析来实现。
Φ在工具栏中点击File，选定所要分析的数据文件，单击OpenΦ选择用于DNA分析的参数：FL2-AΦ设门。
软件最多允许同时设两个门，点击Gate 1或2前的小方框，然后单击Define the Gate，选择合适的X轴和Y轴，将门移动到所要分析的细胞群上，单击OKΦ单击工具栏中的Mod键或选择Analysis菜单中的Choose Model在这个对话窗口中需要你来描述你所得到的样本的信息，比如说，样本的类型，有无异倍体等。
每一个有关的资料都会影响到最终分析模式的选择。
═>选择碎片拟合的模式：新鲜/冻存，石蜡切片，没有碎片（不进行碎片分析）；═>选择倍型：异倍体，二倍体，四倍体；═>若有异倍体，则须确定是一个还是两个异倍体；═>选择细胞聚集体分析模式：有聚集体，没有聚集体，或自动检测（软件自行判断有无需要拟合聚集体）；═>选择是否拟合二倍体的S期：如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰明显分开,我们对每一个细胞周期的S期都能够进行拟合，则选择Fit Diploid S；如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰靠得非常近，则选择No Diploid S；═>选择能否看得见明显的G2/M期峰：Visible G2/M，Indistinct G2/M（软件将自动把G2/M期峰的位置固定在两倍于G0/G1期峰的位置；═>选择是否拟合凋亡：Fit Apoptosis，No Apoptosis；═>选择有无标准参照物：No Standards，One Standard，Two Standards；═>根据这些资料，软件选择分析的模式并将其显示在对话窗的下部；═>单击OK确认并关掉对话窗。
流式细胞周期结果图解读
流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03Author:bioer Hits: 51 times 流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读首先来认识一下流式细胞周期结果图：1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new)
PI单染检测细胞周期操作步骤：1、铺板：5×105 cells/ml，六孔板，每孔1ml。
2、血清饥饿法进行细胞同步化处理：无血清培养基培养8-12h，然后才加药。
注意：实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50～80％比较好。
自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。
周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其他阶段细胞增多。
3、收集细胞悬浮细胞：直接离心收集细胞，弃上清，在4 ℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次；贴壁细胞：a.将上清转入离心管（其中含有脱落的凋亡细胞）b.PBS冲洗液c.不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后，将细胞吹打成单细胞悬液将a、b、c合并后1200rpm离心5min；弃上清；用PBS清洗一次，再次弃上清，加入1.5ml PBS重悬细胞；注：为了既保持初始条件相同，又可搜集到足够的细胞，可选用多孔培养板；在搜集细胞时，浓度大、抑制强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。
4、固定：将细胞悬液加入预冷（-20℃）无水乙醇3.5ml，使乙醇终浓度为70%，4℃固定过夜。
注意：（1）加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速；（2）不是向细胞中加70%乙醇，而是向细胞悬液中加无水乙醇，这样是为了减少细胞聚集；（3）在染色之前细胞4 ℃固定可保存3周；5、离心收集细胞：以预冷（4℃）PBS洗细胞一次，调整细胞浓度≧1.0×106；6、PI综合染液：弃上清，在106细胞中加入0.5ml综合染液，重悬细胞后37 ℃水浴30 min。
PI stocking solution:5mg PI+5ml PBS--------混匀于15ml避光离心管RNase A stocking solution: 10mg +1ml PBS--------混匀于1.5ml避光离心管Triton X-100:0.5ml+25ml PBS--------混匀于50ml避光离心管注：（1）RNase A于－20 ℃保存，其它4℃保存并避光；（2）Triton-X-100（曲拉通）主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核，提前两小时配，难溶；（3）在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI易透过细胞膜和核酸结合，为避免干扰染色前需用RNAse A降解RNA。
用ModFit软件分析DNA倍体和细胞周期
对未来研究的建议
深入研究DNA倍体异质性的机制
DNA倍体异质性是肿瘤细胞的一个重要特征，但目前对其产生机制仍不清楚。未来研究可以进一步探讨DNA倍体异 质性的产生原因和生物学意义。
比较不同组织或个体的DNA倍体分布
为了更好地理解DNA倍体分布的生物学意义，未来研究可以比较不同组织或个体的DNA倍体分布，以寻找可能的组 织或个体特异性模式。
可视化效果好
modfit软件提供了丰富的可 视化工具，能够将分析结果 以图表、图像等形式直观地 呈现出来。
适用范围广
该软件适用于各种不同类型 的细胞，包括肿瘤细胞、正 常细胞等。
实际应用案例分析
在肿瘤研究中的应用
通过分析肿瘤细胞的DNA倍体和细胞 周期，可以了解肿瘤细胞的增殖状态、 恶性程度及对治疗的反应等，有助于 肿瘤的诊断和治疗。
理解modfit软件在分析中的作用
modfit软件是一款专门用于分析细胞周期和DNA倍体数据的软件，通过该软件可以对细胞周期和DNA倍体进行 定性和定量分析，从而对细胞的生长和增殖状态进行评估。
modfit软件简介
软件功能
modfit软件可以对细胞周期和DNA倍体数据进行模型拟合，提供定性分析和定量分析两种方式 ，支持多种图像处理和数据分析功能。
结合其他技术进行深入分析
为了更全面地了解细胞的生物学特性，未来研究可以结合其他技术，如基因表达分析、蛋白质组学等， 对细胞进行更深入的分析。
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用户社区
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05 结论
主要发现
要点一
DNA倍体的分布
ModFitLT细胞周期的分析软件
ModFitLT细胞周期的分析软件Re:[原创]ModFit LT----细胞周期的分析软件二、运用ModFit LT进行手动分析如ModFit LT在自动分析过程中无法正确确定峰值的位置或样本的倍型，或者你希望自己选择分析的模式，那么你可以用手动分析来实现。
在工具栏中点击File，选定所要分析的数据文件，单击Open选择用于DNA分析的参数：FL2-A设门。
软件最多允许同时设两个门，点击Gate 1或2前的小方框，然后单击Define the Gate，选择合适的X轴和Y轴，将门移动到所要分析的细胞群上，单击OK 单击工具栏中的Mod键或选择Analysis菜单中的Choose Model在这个对话窗口中需要你来描述你所得到的样本的信息，比如说，样本的类型，有无异倍体等。
每一个有关的资料都会影响到最终分析模式的选择。
═>选择碎片拟合的模式：新鲜/冻存，石蜡切片，没有碎片（不进行碎片分析）；═>选择倍型：异倍体，二倍体，四倍体；═>若有异倍体，则须确定是一个还是两个异倍体；═>选择细胞聚集体分析模式：有聚集体，没有聚集体，或自动检测（软件自行判断有无需要拟合聚集体）；═>选择是否拟合二倍体的S期：如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰明显分开,我们对每一个细胞周期的S期都能够进行拟合，则选择Fit Diploid S；如异倍体的G0/G1期峰与二倍体G0/G1期峰靠得非常近，则选择No Diploid S；═>选择能否看得见明显的G2/M期峰：Visible G2/M，Indistinct G2/M（软件将自动把G2/M期峰的位置固定在两倍于G0/G1期峰的位置；═>选择是否拟合凋亡：Fit Apoptosis，No Apoptosis；═>选择有无标准参照物：No Standards，One Standard，Two Standards；═>根据这些资料，软件选择分析的模式并将其显示在对话窗的下部；═>单击OK确认并关掉对话窗。
细胞周期分析软件modfitlt操作说明.doc
4. 应用ModFitLT 软体分析DNA 直方图4.1 概述ModFitLT 是由美国VeritySoftwareHouse 公司设计，专门用於流式细胞术中进行细胞周期分析的软体。
它通过对DNA 含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出分析细胞周期各时相细胞的含量、G1/S/G2M 细胞的百分比，并测量肿瘤细胞的DNA 指数DNAIndex、及析凋亡细胞亚二倍体所占的比例。
此外，2.0 版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分别进行同步化细胞和增殖细胞的研究SynchronizedorDrug‐PerturbedCells，对於研究凋亡细胞生物学与药理的同仁，实为一大利器。
本软体有苹果电脑与PCWin98/NT 两种版本，皆内建有65 种数学模型，可弹性运用以因应不同的DNA 直方图分析。
从事直方图分析时ModiFitLT 软体允许使用者应用四种基本方式操作:1AutomaticAnalysis2ManualAnalysis3Synchronization 精灵4Proliferation 精灵。
以下之范例练习可让您熟悉ModiFitLT 软体的四种基本分析功能，我们将以四个已储存之数据档案来练习DNA 直方图之分析。
这四个数据档案之档名及样品资料如下：档案名样品SampleLM.FCS4.2 自动分析1. 从苹果功能表下进入ModFitLT 以启动该软体，并在随后出现的对话方框上按OK 。
ModFitLT 软体有一套S 期评估功能，可以依照您所制定的范围，评估该样品中SPhase 比例是属於少量、中度或多量的，并在报告中显示出可信度。
软体若还没有被实验室其他人设置过，那麽当你进行分析时，将会出现一个关於S 期评估的询问方框，提供了3 个选项：马上设置S 期的临界值；以后再提醒我设置S 期的临界值；不需要启动S 期评估这项功能。
若你需要这项评估，你必须输入你们实验室获得的具有统计意义的各种组织的二倍体或者异倍体的S 期的临界值，如没有，则不必启动这项功能。
细胞周期分析重要知识
细胞周期生物学根底细胞的生成依赖于细胞的分裂而产生两个子代细胞的过程。
在分裂过程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核，因为它包含了细胞的遗传信息载体-DNA。
在绝大多数情况下，一个生物体的每个细胞都含有相等的DNA物质和一样成份的染色体。
因此，细胞在分裂前必须复制DNA这样它的子代细胞就能够拥有与父代一样的DNA含量。
细胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代继续复制并分裂，这个过程称之为细胞周期。
在细胞周期中最具特征性的阶段是在分裂前的DNA含量增加并到达2倍量的时候，并在此时细胞开场分裂其自身-有丝分裂期。
细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：S期〔合成期〕和M期〔有丝分裂期〕。
当细胞周期中的S期和M期被定义后，我们可观察到在有丝分裂完成后和DNA合成刚开场之时有短暂的停顿或间隙，同样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝分裂开场之时。
这两个间隙我们将之命名为G1和G2期。
这样整个细胞周期可划分为G1 →S →G2 →M →G1，如下列图所示：图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征当细胞没有进入分裂过程时〔我们机体中的绝大局部细胞〕，它们处于细胞周期的G1期的位置上。
因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。
在G1期细胞中有一群细胞特别安静并且没有进入细胞循环的任何生物学特征，我们称这些细胞为G0期细胞。
一些发生在G1和G2期细胞内的生物过程现还不完全明了。
处于G1期的细胞已开场为分裂前的DNA的复制和细胞成长准备许多RNA和蛋白分子。
处于G2期的细胞那么会修复在DNA复制过程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。
细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。
典型细胞循环中各期的开展时间为：G1期12小时，S期6小时，G2期4小时及M期0.5小时。
分析和流式细胞术细胞周期分析流式细胞最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。
流式细胞术的应用-周期检测
细胞周期的检测目录一、背景知识二、实验设计原则三、实验操作步骤四、实验结果分析一、背景知识1、细胞周期：G0/G1二倍体S二倍体---四倍体G2/M四倍体细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。
共分为静止期(GO期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)与分裂期(M期)。
在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。
通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以检测细胞周期。
2、细胞周期常用的核酸染料1.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI) 是一种可以嵌合到双链DNA和RNA 的碱基对中，并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。
其与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被PI染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量的测定。
PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。
可用于区分活、死细胞。
利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。
也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。
PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。
PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克斯频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。
PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。
2.7-氨基放线菌素(7-amino-actinomycinD，7-AAD) 是一种核酸染料。
它不能通过正常细胞膜。
7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
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Modfit分析细胞周期指南
本指南只提供在guava流式细胞分析仪上使用细胞周期模块分析后产生的数据,其它请参阅产品使用说明书,本指南仅供参考。
一.概述
细胞周期的概念:细胞由一次分裂结束到下一次分裂结束,都要经历相同的变化阶段(即G1→S→G2→M )周而复始地进行活动,细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期(cell cyc1e)。
一个细胞周期包括有丝分裂期(M)与分裂间期(G1、S、G2)。
尽管在各种细胞中各期所占时间都不尽相同,但相对而言M期最短,S期却较长。
分裂间期:
1 、G1期,前一次有丝分裂完成到S期开始。
各种与DNA复制有关的酶明显增多,线粒体、叶绿体、核糖体增多,内质网在更新扩大,高尔基体、溶酶体都增加,中心粒彼此分离、复制。
2、S期:DNA、组蛋白合成
3、G2期, S期结束后到有丝分裂开始。
由上可以瞧出G2期、S期、M期反映了细胞的增殖活性,特别就是G2期、S期(因M期较短)。
因而,G2/M％+S％反映了细胞增殖能力。
二者有无差别要进行统计检验。
细胞周期阻滞:对于生殖细胞及保持增殖能力的细胞(如干细胞),由于细胞不断的增殖, 细胞总就是处于从G1 、S、G2 与M 期的连续的细胞周期中。
在细胞周期的各阶段, 细胞分别进行着DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。
每一阶段都就是下一阶段的准备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前监测与一个细胞周期顺利完成相关的生化事件,这包括各种体内外因素威胁下游事件进行时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理阶段的能力,而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。
只有前一阶段的生理活动完成后,才能通过称为检定点的阶段,进入周期的下一步,一些突发事件引发的细胞反应能影响驱动细胞周期前进的因子,从而使细胞周期停滞在检定点, 这被称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。
比较相应的细胞G1 、S、G2 期差异有无统计学意义,才能说有无细胞周期阻滞。
第一张图:增值率S(合成期)＋G2/M(合成后期/分裂期):21、7％
第二张图:增值率S(合成期)＋G2/M(合成后期/分裂期):19、6％
据此分析两者的增值没有明显的差别。
虽然第二张图比第一张图的S期有所增高,但G2期下
降了。
细胞周期就是基于细胞处于不同分裂时期具有不同的DNA含量而分析细胞处于不同的时期的方法。
确切的说结果中G1期的百分比实际上就是G1＋G0期细胞的百分比。
G2的百分比实际上就是G2＋M期细胞的百分比。
二.细胞样品制备
在样品的制备中存在的问题主要就是细胞的聚集与碎片,虽然细胞通透剂种类很多,但用于碘化丙啶(PI)染色进行细胞周期与倍体分析的细胞通透剂,通常为70％冷乙醇;乙醇必须与细胞充分快速混匀,避免细胞聚集成团;乙醇必须与细胞充分快速混匀,避免细胞聚集成团;流式细胞仪获取细胞的速度不宜太快,在guava上要使用最低速。
1、用户首先使用guava的细胞周期试剂盒,并按相应的操作步骤进行细胞固定、染色后,使用guava的细胞周期模块进行数据采集与分析,并生成以、ccy、CCY、FCS为后缀的文件。
2、细胞周期结果受样品制备的影响较大,请参阅相关文献进行样品制备。
3、guava细胞周期试剂盒简要操作步骤:
1) 制备70%的冰乙醇, -20C预冷2小时
2) 制备单细胞悬液,收集细胞,离心去除培液,用PBS重悬
3) 离心,去除PBS、加入100ulPBS重悬、
4) 将100ulPBS逐滴加入7ml70%的冰乙醇中固定过夜
5) 固定后,450g离心5分钟,弃固定液,用3mLPBS重悬、
6) 再次离心, 弃PBS,留细胞在离心管底部, 加入500ul Cell Cycle试剂
7) 染色30分钟后上机检测、
4、请注意在固定步骤中,加入－20℃70%酒精(1到2ml)打匀,固定,至少半个小时以上(约100ul细胞用枪一滴一滴加入到7ml装有预冷70%冰乙醇(-20至少2小时)中,每加一次都需要反复吹打,以避免细胞成团;需要注意的就就是加酒精固定的时候要用4℃预冷的酒精,缓慢的加,边加边晃动细胞,避免细胞黏连在一起。
),(不做的话,可放入4℃冰箱保存2-3周问题不大。
)另在用预冷PBS洗去固定剂时,不宜洗得过多,以免细胞损失。
三.Modfit操作指南
1、双击Modfit图标,打开Modfit软件(无需安装),打开界面如下:
不用理会弹出的信息,点击OK继续,会出现下述界面,每个均点击OK即可:
2、点击File,在弹出的对话框中选中要分析的细胞周期文件(FCS
3、0文件),点击open以打开文件:
3、打开文件,可以瞧到该文件包含10个数据文件,如果分析第一个文件,则选中第一个文件(如要在分析完第一个文件再分析第二个文件,需要关闭软件后,再次打开软件,重复上述过程,再在打开文件后出现的10个数据文件中再选中第二个进行分析,其它8个数据文件分析方法同上),点击OK以打开该数据文件:
4、在选择参数(Choose parameter for analysis)时选择第五个(FL2-P-PM2Max):
5、选择右下脚的Convert按钮,在下述界面的Linear-to-Log Conversion下选择第六个(FL2-W-PM2Width),点选Convert to log前的方框,再选中OK继续:
6、软件会回到前一界面,点击OK继续:
7、在下述界面中点选Enable Gate 1,并选中Define Gate 1按钮进行设门:
8、在下述界面中左侧(X Parameter)选第六个参数(FL2-W-PM2Width),右侧(Y Parameter)选择第五个参数(FL2-P-PM2Max),点击OK继续:
9、选中图中的黑色方框,当出现+字形调整其位置,正常的细胞周期细胞应为上下两群细胞的哑铃形状,并调整方框的大小,以去除碎片及粘连细胞:
10、调整完成后,点击OK按钮,软件会回到设门的界面,点击OK继续:
11、软件会出现设门的细胞及细胞周期的峰图:
12、选择Analysis下的Sync Wizard中的第一个Create or edit model:
13、软件出现下述细胞周期的设置界面,分别进行G0/G1、G2/M与S Phase的设置,调整时可选择其中的红色三角改变G0/G1、G2/M的位置,一般选择默认即可(如不想设置,可直接选择第二排的Auto按钮进行自动分析):
14、设置完成后,点击Analysis即可自动完成分析过程,并出现分析结果如下,左侧为拟合的细胞周期图,右为统计数据:
15、选择Edit下的Copy按钮,即可将分析结果与图形复制到Word文档或PPT文档中:
16、下图为复制到Word文档后的情况:
请注意,本指南不排除其编写内容可能有不准确甚至错误的地方,仅供各位在做细胞周期时参考。
具体产品使用方法及注意事项,请参阅详细的产品使用说明书以获更详细的使用方法。
指南的编写得到北京医科大学的孙玉芳老师的大力协助,在此深表感谢。
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