产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板

本科开放项目

题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

学生姓名：

指导教师：

学院：

专业班级：

2016年3月

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

摘要

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株

目录

第1章绪论 (1)

1.1 实验原理 (1)

1.2 实验仪器及试剂 (1)

1.2.1 实验材料 (1)

1.2.2 实验仪器 (1)

1.2.3 培养基 (2)

第2章实验步骤 (3)

2.1 采样培养 (3)

2.2 初筛 (3)

2.3 复筛 (3)

2.4 酶活的测定 (3)

2.4.1原理 (3)

2.4.2溶液配制 (3)

2.4.3实验步骤 (4)

第3章实验结果 (6)

3.1 标准曲线的绘制 (6)

3.2 菌株复筛结果 (6)

3.3 测定纤维素酶活力结果 (7)

结束语 (8)

参考文献 (9)

第1章绪论

1.1 实验原理

自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：

1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；

2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC

3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；

3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。

以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。

1.2 实验仪器及试剂

1.2.1 实验材料

土样取自湖南省长沙市岳麓山上、中南大学校本部草地15—20cm深处；

1.2.2 实验仪器

试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、

酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；

1.2.3 培养基

（1）培养基

A、纤维素富集培养基（1L）：NaCl 6g，MgSO4 0.1g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.1g，

(NH4)SO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，琼脂1.5%，CMC-Na 0.5%，pH调至7.0。

B、纤维素筛选培养基（1L）：在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。

C、马丁培养基：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，KH2PO4~3H2O0.1g，MgSO4~7H2O0.05g，

0.1%孟加拉红溶液0.33mL，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，自然ph，2%去氧胆酸钠溶

液2mL（预先灭菌,临用前加入），；链霉素溶液10000u/mL 0.33mL（临用前加入）。

（2）溶液

A、刚果红染色液：用蒸馏水溶解刚果红,终浓度为0.1%(w/v)。

B、刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCl溶液。

第2章实验步骤

2.1 采样培养

（1）采样：在事先勘察好的取样地土壤15-20cm，取3个点采样；

（2）溶解：将3份土样各10g加入带有玻璃珠的锥形瓶并溶于无菌水中，在摇床上以200r/min振荡30min；

（3）富集：配制100m L 富集培养基中，加入250mL锥形瓶中，取生理盐水中振荡的土样溶液上清取5mL加入富集培养基中，30℃200r/min，培养24h；

（4）稀释：梯度稀释10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L、10-4 mol/L,10-5 mol/L、10-6 mol/L。

2.2 初筛

初筛：选取10-5mol/L、10-6mol/L两个浓度梯度各0.1mL分别做3个平行，涂布于纤维素富集培养基平板上，30℃恒温培养箱中培养2d。挑取生长良好的形态大小不同的菌落于纤维素液体富集培养基中30℃200r/min，培养24h。

2.3 复筛

（1）复筛：用接种针将分离到的菌株活化后点种于纤维素筛选培养基平板上,30℃恒温倒置培养2d。用0.1%刚果红染色液浸染再用1mol/LNaCl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶,则会在菌落周围出现清晰的透明圈,依据透明圈直径与菌落直径的比值大小选择产酶菌株

（2）将筛选获得的产纤维素酶的菌株接种到马丁培养基中，30℃培养4d,能在该培养基中生长良好的为真菌,不能生长的为细菌。

2.4 酶活的测定

2.4.1原理

纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将3，5-二硝基水杨酸(DNS)中的硝基还原为氨基，生成棕红色的氨基化合物。在一定的浓度范围内,还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关系。可用比色法测定。

2.4.2溶液配制

（1）CMC-Na底物溶液的配制浓度1% 热水煮ph 4.5