第一节 溶菌酶的提取

第一节溶菌酶的提取

一、简介

1.Lz的结构及组成

溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特

别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。

鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四

图5-1 溶菌酶的分子结构

对二硫键，分子量为14300。结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。

2.Lz的基本性质

Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。

（1）Lz的热稳定性

Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件

下稳定，在碱性条件下不稳定。

糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。

（2）加工过程中的化学变化

蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的储藏有着重要的影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生H2O2,导致产品的破坏，这类反应的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量，这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。

在150℃~300℃焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用中，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品在250℃几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸，含硫氨基酸、碱性氨基酸和β-OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外）、有烷侧链的氨基酸容易分解这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。

（3）络合作用

溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力；脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶的活力；蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰；对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此，研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。

3.Lz的用途

溶菌酶作为一种活性物质可应用在各个领域，我国的食品工业、酶工程、发酵工业、医学和科学研究对溶菌酶有较大的需求。

由于溶菌酶对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保鲜。目前主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜的方面。

此外在发酵工业领域，酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。另外溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。由此可见溶菌酶的用途极其广泛。

4.Lz的来源及分布

1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类：

（1）动物源溶菌酶

动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应

用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的，分子量为14KD，其等电点在pH 10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定。人溶菌酶分子量为14.6KD单位，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。然而，鸡蛋清溶菌酶是动物源溶菌酶的典型代表，也是目前研究得最深最透的一类溶菌酶。

（2）植物源溶菌酶

目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24 000-29 100。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。

（3）微生物源溶菌酶

上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。

二、溶菌酶的生产提取方法

溶菌酶的制备方法，目前主要有结晶法、离子交换层析法及亲和层析法等。溶菌酶广泛存在于高等动物组织及分泌物、植物及各种微生物中，但在新鲜鸡蛋清中含量最高，所以多数商品溶菌酶是从蛋清中提取纯化出来的。下面介绍以鸡蛋为原料制备溶菌酶的方法。

1.原料及试剂

（1）蛋清和蛋壳水选用新鲜或冰冻蛋清和蛋壳水

（2）724树脂是一种聚丙烯酸型弱酸性阳离子树脂，在pH6~7时，尿激酶及其他碱性蛋白、黏蛋白带正电荷，可被树脂吸附，许多杂蛋白不被吸附。吸附时pH在6.2~6.4时最佳，＞6.8时，吸附不完全，＜5.5时则吸附大量杂蛋白。

（3）磷酸钠缓冲液即磷酸氢二钠（Na2HPO4）一磷酸二氢（NaH２PO4）缓冲液，先分别配制0.2 摩尔／升的磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液，然后根据需要的pH，按表5-1注明体积量将两种溶液混合，然后稀释至1升。

（4）磷硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、醋酸、硫酸钠、氯化钙、磷酸钠、乙醇、乙醚、三氯乙酸

（5）聚丙烯酸一种多聚电解质，能在特定pH离子强度下，专一地使蛋白质凝聚沉淀，对多糖、核酸等则无作用，经聚丙烯酸处理，溶菌酶的比活可提高5倍左右，同时可将体积浓缩1/10~1/30。一般采用分子量60000~80000的聚丙烯酸为至好。

（6）几丁又称壳多糖，用于活力测定，选用生化试剂。

（7）乙二醇又称甘醇，带甜味的黏稠液体。沸点198℃，熔点—11.5℃易溶于水，不溶于乙醚，选用化学纯试剂。