northern印迹杂交

northern印迹杂交

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern 印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。

<1>试剂：

10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。

5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。

甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。

20×SSC；

去离子甲酰胺；

50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；

0.1mol/L Tris，pH7.5。

<2>步骤：

[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml

甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。

[4]55℃加热15min，冰浴冷却。

[5]加2ml5×载样缓冲液。

[6]上样、同时加RNA标记物。

[7]60伏电泳过夜。

[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。

[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。

[11]20×SSC洗胶1h。

[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。

[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。