Southern杂交实验
实验七Southern印迹法
实验七Southern印迹法Southern印迹法是分子生物学中常用的 DNA 转移与杂交技术。
Southern印迹法的目的是分离 DNA 片段，并根据它们的长度和数量测定第一种样品中特定 DNA 片段的存在。
该方法是以 Edward M. Southern 1975 年提出的。
Southern印迹法是一种将 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜上的技术。
该方法的基本原理是将目标 DNA 的片段分离出来，通过凝胶电泳分离出 DNA 后，将它转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
转移后进行 DNA 与膜的固定和预处理，然后涂上 DNA 探针发现和显示 DNA 片段的方法。
这些探针经常是标记的核酸分子，它们与目标 DNA 片段杂合并可以通过荧光或放射性探测器进行检测。
1. DNA 片段的制备从需要研究的DNA中，通过限制酶切或PCR扩增等方法，将所需 DNA 片段制备出来。
2. 电泳用琼脂糖电泳分离DNA片段，根据分子大小排列。
3. 转移将分离出的 DNA 片段转移到硝酸纤维素或其他荧光杂交膜上。
4. 增强和固定增强和固定DNA与膜之间的结合力，以便进行杂交。
5. 杂交将贴有 DNA 片段的膜和DNA探针，一起置于一定的条件下进行杂交，以检测特定的DNA 片段是否存在。
6. 洗涤和显影通过洗涤和显影等操作，观察到探针与 DNA 片段的杂交情况，以得到所需的信息。
Southern印迹法在生物学领域中的应用广泛。
它被广泛用于研究 DNA 片段，如发现基因缺失、揭示癌症的起源等方面的研究。
此外，它还可以用于检测利用基因工程技术制造的 DNA 片段与细胞内的核酸结合情况。
总之，Southern印迹法是一种常用的 DNA 分析方法，它可以用于很多领域，比如基因工程、细胞生物学、药物研究和疾病诊断等。
该方法分离DNA 片段的能力和灵敏度高，可以对 DNA 片段进行量化，是分子生物学中不可或缺的重要技术手段。
实验十一 Southern杂交分析
的转移。
固定操作：将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：
如果你想采用 紫外交联的方法
（尼龙膜）
，烘烤（尼龙膜） ，烘烤（尼龙膜）
那么 将刚转好的湿润的尼龙膜DNA面向上放到保鲜膜上。 用紫外交联仪交联这块湿润的膜，DNA面向上。
DNA转移和固定 紫外光盒 或者商业化可用于紫外交联的其他设备
试剂 灭菌的双蒸水 pH8.0 灭菌的EDTA 地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者TE 缓冲液 洗涤缓冲液；马来酸缓冲液 检测缓冲液；TE缓冲液
2×SSC 或者20×SSC
杂交
尼龙膜，带正电荷 杂交袋或杂交管， 注意：当用地高辛杂 交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。
注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。
充分混合DIG-High Prime（1号管），并取4μL加入到变性DNA中， 混合并简单离心。
孵育1小时或者过夜。
注 意 ： 较 长 的 孵 育 时 间 （ 最 高 达 20 小 时 ） 能 够 提 高 地 高 辛 标 记 DNA的产量。
加入2 μL 0.2 M EDTA（pH 8.0）和/或 65℃加热10分钟终止反应。 注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可 以从200 bp到1000 bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长 度。
杂交工作溶液的制备
分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后 立即在37℃条件下搅拌5分钟进行溶解。
杂交温度
适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体 的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度 ，以碱基对进行计算} Topt.= Tm -（20～25℃） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得 到的。 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25℃。 Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当 你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错 配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤 温度）。
Southern 杂交技术-1
Southern 杂交技术-1Southern技术是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术。
它可用于基因组特定D NA序列的定位，可以测定相关片段的同源性、可以从c库、基因组文库中筛选完整基因等。
用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。
该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。
下面分别介绍利用光敏生物素试剂盒及DIG试剂盒进行杂交的方法。
十五－1:光敏生物素试剂盒杂交实验一仪器：分子杂交仪、摇床、烤箱、取液器、电泳仪、电泳槽二试剂：硫酸葡聚糖钠盐(可不用)、聚乙烯吡赂啉酮（PVP）、聚蔗糖、牛血清白蛋白（BSA）、100mM EDTA、3MnaAC、无水乙醇、电泳缓冲液、切变性鲱鱼精DNA （100ug/ml）20×SSC溶液氯化钠３Ｍ预杂交液６×SSC柠檬酸三钠 0.3M （含100ug/ul变性鲱鱼精DNA）pH 7.0 ５×Denhardt's 溶液0.5%SDS变性液 0.5M NaOH 中和液 1M Tris-HCL pH 7.41.5M NaCL 1.5M NaCL封闭液 3gBSA溶于70ml水中，浓盐酸调pH至3.0,煮沸20分钟后，冷至室温，NaOH调pH至7.5,加入10ml以下缓冲液（1M Tris-HCL pH7.5, MgCL2 0.19%, NaCL 5.8%, T riton X-100 0.05ml）定容至100ml５０×Denhardt's 溶液 1％PVP 1M PBS NaCL 0.8% pH 7.41%BSA KCL 0.02%1%聚蔗糖 Na2HPO4 0.144%KH2PO4 0.024%洗涤液Ａ:２×SSC,250ml中含0.1%SDSＢ：0.1×SSC,250ml中含0.1%SDS Ｃ：Tris-HCL 100mM pH 7.5 Ｄ：Tris-HCL 100mMNaCL 1M NaCL 0.5MMgCL2 2mM Tween 20 0.5% pH 7.5Triton X-100 0.05%亲和素－碱性磷酸酶溶液 Tris-HCL 100mMNaCL 1MMgCL2 2mMTriton X-100 0.05%pH 7.5碱性磷酸酶2-3单位/ml底物溶液 Tris-HCL 100mM pH 9.5 终止液NaCL 100mM Tris-HCL 10mMMgCL2 5mM EDTA 1mM。
实验六 southern杂交ECL检测
实验六水稻基因组DNA的Southern杂交与非放射性ECL直接核酸标记及检测【实验目的】通过本实验学习和掌握Southern转膜、辣根过氧化物酶直接标记探针、Southern杂交及增强化学发光（ECL）检测分子杂交结果的过程。
【实验原理】Southern杂交是一项在复杂的背景基因中识别特异性DNA序列的重要技术之一，它是Southern于1975年首创的杂交方法。
其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链DNA在一定的条件下可按碱基互补原则（A=T,C=G）形成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及标记的探针。
此杂交过程是高度特异性的。
ECL直接核酸标记及检测系统用辣根过氧化物酶（HRP）直接标记探针。
该法用带正电荷的核酸标记试剂（经修饰成为带正电荷的HRP聚合体：HRP—对苯醌—聚乙烯亚胺复合物）与变性过的、带负电荷的单链核酸探针松散连接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化学交联作用下与带负电荷的单链DNA共价结合，从而标记DNA。
标记的探针DNA与膜上的单链DNA杂交形成双链DNA，探针上的HRP在H2O2存在下，催化H2O2还原，同时使鲁米诺氧化并伴随蓝光产生，在增强剂的作用下使产生的光加强，从而可在X光片上检测。
首先将经限制性内切酶酶解的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离以及在凝胶上经NaOH处理使之变性，然后将尼龙膜（Hybond-N+）放在凝胶上，使之按原有顺序将条带转移至膜上并固定起来，这是Southern 转膜过程。
Southern膜杂交是将吸附并固定在Hybond-N+尼龙膜上的DNA片段与一个标记的探针杂交，最后经过显影从Ｘ光片上显现出杂交分子的区带。
本实验中，经琼脂糖凝胶电泳分离的水稻基因组DNA酶切产物，通过Southern转移，将其吸印在Hybond-N+尼龙膜上，通过辣根过氧化物酶直接标记探针，与膜上的水稻DNA进行杂交，再用增强的化学发光方法得到分子杂交结果。
本实验所用的探针来源于水稻和大麦，具有抗病基因NBS-LRR结构特点的DNA探针，因此水稻DNA 和探针之间有较好的同源性，可得到杂交带，可满足初学者对Southern杂交方法进行训练。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern blotting实验方法
Southern 杂交的实验方法Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备（前述）二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量。
一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。
由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入DNA（1μg /μl） 20 μg10×酶切buffer 4.0 μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至 500 μl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放大反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。
southern blot
实验名称：Southern 印迹杂交一、实验目的核酸杂交是分子生物学的一个重要手段，它应用于克隆鉴定，同源性分析，以及癌症、遗传疾病和致病细菌、病毒和寄生虫的分子诊断。
通过本实验了解和掌握Southern杂交的基本原理和操作。
二、实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。
指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。
Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。
基因组DNA采用实验五中制备的HL-60细胞基因组DNA，接着是将DNA进行限制性酶切；本实验检测的靶DNA为原癌基因c-myc，c-myc的致癌机理包括染色体异位和病毒基因组的插入突变而导致c-myc基因的过度表达。
基因的变化可通过Southern杂交检测。
c-myc基因的酶切位点有EcorI、ClaI、HindIII等，基因组DNA首先经限制内切酶酶切成较短的片段，经电泳分开，然后再经碱变性使DNA成为单链，有利于结合于膜上和进行下一步杂交。
转移是根据毛细管作用原理进行的。
单链DNA经高温烘烤定于膜上。
杂交是根据靶DNA单链与探针之间的碱基互补的原则进行。
本实验采用的探针为1.4kb的ClaI和EcorI酶切片段，对应于c-myc的第3个外显子的部分片段。
探针用非放射性标记物地高辛（DIG）标记。
杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色。
为了降低背景，减少标记探针的非特异性结合，一般先行预杂交，用牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及去污剂SDS和十二烷基磺酸钠封闭膜上非特异结合位点，还在杂交液中加入小分子鲑精DNA作为竞争性封闭剂。
杂交一般在5或6xSSC和封闭剂的溶液中进行，水溶液中杂交温度为Tm-25°（65-70°）。
Southern杂交实验
Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
Southern杂交分析原理和操作
Southern杂交分析原理和操作【原理】Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
一．基因组DNA的限制酶切【操作】DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性内切酶(lOU /μl) 5.0μl、加ddH2O至50μl,在最适温度下消化1～3h。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6h己没有必要。
或者放大反应体积,或者补充酶再消化。
如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。
消化后的DNA 加入1/10体积的0.5mol/L EDTA,以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。
如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。
二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳【操作】1.制备0.8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2. 电泳电泳样品中加人6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。
1～2V/cm,DNA从负极泳向正极。
电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。
取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。
在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。
正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄人刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。
三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物【操作】1.碱变性室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
Southern杂交
实验九Southern 印迹杂交目的要求：了解核酸Southern印迹杂交的原理及其操作过程。
核酸杂交原理：核酸分子杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。
其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的两条多核苷酸链,按碱基配对原则形成稳定的双链分子。
若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。
探针与其互补的的核苷酸序列杂交后杂交体也就带上了同样的标记，可被检测出来。
这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定以及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。
核酸分子杂交分为两类，即Southern杂交和Northern杂交。
Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，常用于外源基因整合的鉴定及分析。
Northern杂交是以DNA 或RNA为探针，检测RNA链，常用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。
Southern 杂交是研究DNA物理图谱的基本技术，在DNA遗传诊断及PCR产物分析等方面有重要应用。
Southern印迹杂交基本方法是将DNA用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下将DNA从凝胶中转印至膜上，烘干固定后即可用于杂交。
凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
附着在滤膜上的DNA与标记的探针杂交，利用放射自显影术或其它显影技术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
实验材料和试剂：变性缓冲液：1.5M NaCl 0.5M NaOH中和缓冲液：0.5M Tris-HCl(pH8.0) 1.5M NaCl20×SSC：3 M NaCl 0.3M柠檬酸钠pH7.0待检PCR DNA样品实验操作步骤：DNA 凝胶电泳和转膜1.配制0.8% 的琼脂糖凝胶，3-4V/cm电压电泳。
Southern印迹杂交作业指导书
Southern印迹杂交作业指导书实验目的学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。
实验原理具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异性的。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。
Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。
这里主要介绍目前常用的电转法。
电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。
一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。
常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。
实验内容材料和试剂印迹试剂l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。
2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。
3．中和液1mol／L Tris·HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。
4．电泳液和转移液1×TBE或TAE。
5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。
杂交试剂1．预杂交液5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。
2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。
3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。
4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。
5．0.1×SSC溶液。
Southern杂交
Southern 杂交（一）目的通过分子杂交，检测重组DNA分子中插入的外源基因是否确是原供体中的某一基因片段。
（二）原理Southern 印迹杂交是指将经凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维膜），再通过特异性的探针杂交来检测被转移的DNA的片段的一种技术。
Southern 杂交的实验流程如下：基因组DNA样品的限制性酶切-> 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳-> DNA的变性、转膜与固定-> 杂交与杂交后清洗-> 杂交结果的检测（三）材料1.基因组DNA样品的限制性酶切：1）样品：GFP蛋白基因2）试剂：限制性内切酶；10x酶切缓冲液；0.5mol/L EDTA；Tris-饱和酚；氯仿/乙醇=24：1（体积比）；预冷无水乙醇和70%乙醇；TE缓冲液3）仪器及器材：恒温水浴锅；电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪2.酶切样品的琼脂糖凝胶电泳：1）样品：上一个实验的酶切产物2）试剂：琼脂糖；1xTAE缓冲液；6xDNA加样缓冲液；EB溶液；DNA分子量标准（DNA Marker）3）仪器及器材：电泳仪；水平电泳槽；微波炉；紫外透射仪；凝胶成像分析系统；微量移液器3.DNA的变性、转膜与固定：1）样品：电泳后的琼脂糖凝胶2）试剂：水解液（0.25mol/L HCL）；变性液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L NaOH, 0.2mol/L HCL）；中和液（1mol/L Tris-HCL pH=7.4, 1.5mol/L NaCl）；硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜；碱性转移缓冲液（0.4mol/L NaOH, 1mol/L NaCl）；20xSSC（3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸三钠pH=7.0）；20xSSPE（3.6mol/L NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4, 0.02mol/L EDTA pH=7.7）；50xDenhardt 试剂（5g聚蔗糖Ficoll 400, 5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白，加入无菌蒸馏水至500ml）3）仪器及器材：印迹转膜装置（托盘、支持物、Whatman 3MM滤纸、纸巾、玻璃板、重物等），紫外交联仪4.杂交与杂交后清洗：1）样品：固定了DNA酶切样品的硝酸纤维膜2）试剂：预杂交液（6xSSC, 5xDenhardt试剂, 0.5% m/V SDS, 1μg/ml polyA, 100μg/ml 鲑鱼精DNA, 50% V/V 甲酰胺）3）仪器及器材：杂交管（瓶），杂交炉5.杂交结果的检测：1）样品：杂交后已清洗的NC膜2）试剂：显影液，定影液3）仪器及器材：X线胶片，X线胶片盒（带增感屏），保鲜膜（四）步骤基因组DNA样品的限制性酶切：1）酶切：在1.5ml离心管中依次加入ddH2O Xμl；1μg/μl DNA 20μg；10x酶切缓冲液4.0μl；10U/μl限制性内切酶5.0μl，总体积500μl。
southern杂交原理的应用
Southern杂交原理的应用1. Southern杂交的基本原理Southern杂交是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在给定样本中的存在与表达情况。
它基于DNA的互补配对原理，通过将待测DNA与已知DNA序列进行杂交反应，然后通过检测反应产物来确定目标DNA是否存在。
Southern杂交实验通常包括以下步骤：1.DNA提取：从待测样品中提取DNA，并经过酶切等处理，将复杂的DNA样品变成易于分析的特定DNA片段。
2.DNA电泳：将DNA样品根据大小分子量在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，以得到待测DNA片段。
3.DNA转移：将电泳分离后的DNA片段转移到膜上，通常是通过电泳转移（electroblotting）或吸附转移（capillary blotting）的方式。
4.杂交：将已知DNA序列与待测DNA膜进行杂交反应，其中已知DNA序列可能是标记过的探针（probe）或同源基因组DNA。
5.检测：通过封闭法（i.e., 冷光法或放射性法）或非封闭法（i.e., 荧光原位杂交法）来检测杂交反应产物，从而确定目标DNA是否存在。
2. Southern杂交的应用Southern杂交技术在分子生物学和基因组学的研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：2.1 基因组DNA定量Southern杂交可用于检测和定量目标基因组DNA的存在。
通过使用特定探针，可以确定基因组中的某个DNA序列是否存在，并通过探针的信号强度来评估该序列在基因组中的数量。
2.2 基因突变分析Southern杂交可用于检测基因组DNA中的突变。
通过与野生型DNA进行杂交，可以检测突变DNA片段的变化，从而识别基因突变。
2.3 基因拷贝数分析Southern杂交可用于检测基因拷贝数的变异。
通过与标准DNA进行比较，可以确定目标DNA的拷贝数，并评估在不同个体或物种之间的差异。
2.4 基因组同源性分析Southern杂交可用于研究不同物种或个体之间的基因组同源性。
southern杂交实验方法和步骤
southern杂交实验方法和步骤一、主要仪器：离心机恒温水浴锅Orbital shaker 恒温摇床Poner PAC300核酸电泳仪VersaDoc凝胶成像系统水平摇床HL-2000 Hybrilinker分子杂交仪烘箱二、主要材料whatman 3mm滤纸尼龙膜吸水纸玻璃板玻璃棒废旧胶片方形果盘平板三、主要试剂RNase A真菌基因组提取试剂盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit IDNA MakerNaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸四、试剂准备变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl；Southern blot中和液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5 mol/L NaCl；20×SSC：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；2×SSC：取100 mL 20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；2×SSC+0.01%SDS：取100 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；0.5×SSC0.01%SDS：取25 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；洗涤缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5，0.3% （v/v）Tween 20；马来酸缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；检测缓冲液：0.1 Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5；封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4µL上清，加入20mL封阻溶液中，备用；底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400µL DIG试剂盒内的5号管。
southern_杂交实验流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％ SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积 3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
Southern杂交方法
分子植物病理学实验--Southern杂交（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。
膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。
再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。
最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。
由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。
Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。
（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等）一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素）三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。
四、转膜（为毛细管法，也可电转移）↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。
然后将凝胶置于一搪瓷盆中。
（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。
留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。
southern杂交
Southern杂交概述Southern杂交是一种常用于分析DNA序列和判定基因组结构的实验技术。
该技术由英国分子生物学家爱德华·南方于1975年首次提出，并以他的名字命名。
Southern杂交操作简单，适用于各种生物材料，被广泛应用于基因组学和分子生物学研究领域。
原理Southern杂交的原理基于亲和性结合和DNA互补碱基配对的特性。
该技术通过将待检测的DNA样品与一段标记的DNA探针进行杂交，通过探针与待检测样品DNA的配对形成稳定的双链DNA形式。
随后，通过探针上的标记进行检测，从而确定目标DNA序列的存在与否。
步骤Southern杂交主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样本中提取待检测的DNA。
2.DNA消解：将DNA样本通过限制性内切酶消解为较小的DNA片段。
3.凝胶电泳：将消解后的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳分离，根据DNA片段的大小形成DNA条带。
4.DNA定位：将凝胶中的DNA片段转移到薄膜或膜纸上。
5.杂交处理：将转移到膜上的DNA片段与一段标记的DNA探针进行杂交，探针可以是放射性同位素标记的DNA或荧光标记的DNA等。
6.杂交条件优化：调整温度、盐浓度和杂交时间等条件，以提高杂交效率和特异性。
7.杂交探测：通过探针上的标记进行检测，如放射性同位素检测或荧光检测。
8.数据分析：根据杂交的结果，确定目标DNA序列的存在与否。
应用Southern杂交技术在许多生物学研究中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：1.基因型分析：可以通过Southern杂交技术确定目标基因的存在、拷贝数和序列变异等信息。
2.基因组结构研究：可以通过Southern杂交技术确定目标基因组的结构和大小。
3.DNA重组检测：可以通过Southern杂交技术检测DNA重组事件的发生和定位。
4.DNA甲基化分析：可以通过Southern杂交技术研究DNA甲基化修饰的分布和变化。
5.遗传疾病诊断：可以通过Southern杂交技术检测遗传疾病相关基因的缺失、重复或突变等。
Southern印迹杂交实验原理和方法-2
Southern印迹杂交实验原理和方法-2（一）细管虹吸印迹法此法是利用浓盐酸转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，转移方式见图10－1：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜或尼龙膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动而滞留在膜上。
步骤：1．20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。
2．凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
3．照凝胶的大小剪一张尼龙膜。
4．膜放在凝胶上。
5．尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
7．以下方法把DNA固定在膜上：（1）紫外交联：1）把膜（DNA面朝上）放在用2×SCC浸湿的whatman 3MM滤纸上2）把湿膜暴露在短波紫外光（254nm）下1～3分钟。
3）在无菌双蒸水中浸润膜。
4）空气中凉干膜。
（2）干燥：1）在2×SCC中短暂洗膜。
2）120℃30分钟干烤固定或80℃2h干烤固定。
8. 如果不立即进行下一步杂交反应，则可把膜保存在两张whatman 3mm滤纸之间，放在密封袋中4℃保存。
图 10-1细管虹吸印记法（二）电转移法此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。
其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与滤膜一起置于滤纸之间，固定于凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。
在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹。
该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。
Southern杂交操作步骤
一基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入：25 μl DNA样品(约10μg)，3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl）5 μl 相应的10×buffer，补水到50μl。
然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。
酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。
如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25—30V 稳压电泳12—16hrs。
注意：在southern杂交中对，DNA的质量要求较高，否则酶切不完全导致失败。
二转膜1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要15~30分钟。
然后用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。
注意：此方法对酶切后目标片段大于15kb时用，如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理，否则容易将片段打断，导致转膜后结合不紧密。
2 取一磁盘架上一洗净玻璃板，在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液，在玻璃板上架两层长滤纸（30cm左右）（注意不要产生气泡）搭成盐桥。
（滤纸比胶弱宽）依胶大小裁好尼龙膜，写好标记，正面向下，紧贴于胶上，防止有气泡产生，接这压两张同样大小的滤纸，不可过大以免短路，胶周围用X光片压条。
胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。
堆积吸水纸。
上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。
注意：防止短路3 转膜16---20hrs后，将尼龙膜取下，胶染色，观察转膜效果。
将膜用2xSSC浸泡20分钟，滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）。
待用。
三杂交¨杂交炉与杂交管预热至65℃¨尼龙膜用2×SSC浸泡配置杂交液ssDNA沸水变性10min，冰浴10min，置冰浴备用Components Volume (ml) NoteddH2O 20.750×Denhardts 0.6P/H stock 8.120% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热.Add prepared ssDNA （10mg/L）≥0.3 ml倒入杂交液，加入尼龙膜，65℃预杂交4~5小时（新膜）注意：赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入杂交液，盖好管盖。
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Southern 杂交实验Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。
如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
一、溶液配制(1)20 X SSC(1000 mL) :组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl 175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调PH值到7.0，高温高压灭(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)Maleic acid：2.32gNacl： 1.75gTween20 0.6mlNaOH固体约1.7g调Ph值7.5(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)Tris 1.21g,NaCl 0.584gMgCl2 1.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用1 mol／L HCl调(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖(9)4 mol／L EDTA 100 mL(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。
114g Tris-base, 溶于80ml 蒸馏水中，用HCl 调pH 至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。
(11)0.5M EDTA (pH 8.0): 称取18.61g EDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。
(12)T E buffer ：取1M Tris-HCl (pH 8.0) 5ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 1ml，用蒸馏水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。
(13)10% SDS：称取10g SDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调pH至7.2，定容至100ml。
(14)低严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成2 X SSC，并按照100:1( 2X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成2 XSSC 0.1% SDS。
(15)高严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成0.5 X SSC，并按照100:1(0.5 X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成0.5XSSC 0.1% SDS。
(16)B locking Solution: 用Maleic acid buffer 将6#中的10 X Blocking Solution稀释成1X的工作液，现配现用。
(17)A ntibody Solution :将4#试剂离心，按照1:5000加入Blocking Solution，2-8℃可保存12小时，即每5ml Blocking Solution中加1ul Ab抗体，与地高辛标记探针结合。
(18)C olor substrate solution (显色液)：将5#试剂按照1:50 用Detection buffer稀释，即从5#中取100ul 加入5ml Detection buffer，要避光，现配现用，用于显示抗体结合位点。
(19)杂交液DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC摇动溶解5min。
二、基因组DNA的提取采用CTAB法微量提取植物总DNA：(1) 取叶片0.1～0.2g，剪碎，加入到2mL Eppendorf管中液氮研磨。
(2) 加入2 X CTAB 800μl, 65ºC水浴保温30min，不时颠倒混匀；(3) 加入等体积800μl 的24 :1，混匀10中；(4) 室温下12000rpm离心15min；(5) 重复步骤（3）一次(6) 小心将上清吸入新的1.5ml离心管中；(7) 加入等体积异丙醇，颠倒混匀；(8) -20 ℃放置30min以上，出现絮状DNA沉淀；12000rpm离心15min ，弃掉上清；(9) 75％乙醇洗涤1～2次，晾干沉淀；(10) 加入2uL RNaseA（10ug/uL），37ºC处理20min，除去RNA。
(11) 加40ul ddH2O溶解DNA，-20℃贮存备用三、酶切与电泳分离(1) 酶切反应体系1μg /μl15 μg10×酶切buffer 30 μl限制性内切酶（10U/μl） 6 μl加ddH2O 至300 μl(2) 混匀后于37ºC酶切16h，酶切完成后，取3μl酶切反应物电泳分析，检测酶切效果(3) 酶切完成后，用等体积氯仿抽提，0.1倍体积的3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇混匀后于—20 o C沉淀1h，(4) 12000g，4ºC离心10min，小心弃上清，加入500μl 70% 乙醇洗一遍，离心2 min，弃上清，少量TE或dd H2O溶解。
四、琼脂糖凝胶电泳(1) 用0.5 X TBE 配制0.8% 的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5 cm。
(2) 待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入：阳性对照：质粒酶切产物，阴性对照：水及检测样品。
(3) 加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100 V电压，电泳5 min 待溴酚蓝进入胶中后，将电压降至50 V 电泳3-4 h，(4) 电泳结束后，)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1 张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA 样品带的位置，在凝胶旁置 1 标尺照像五、变性与转膜(1) 将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min，变性液要能没过胶。
(2) 将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温和摇动2 X 15 min，中和液要能没过胶。
(3) 转膜：20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个―桥‖，凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。
(4)照凝胶的大小剪一张尼龙膜（长，宽略大0.2cm，剪去与凝胶对应的一角）。
膜放在凝胶上。
(5)尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸（长，宽略小0.2cm）一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。
在20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。
(6) 固定：将膜在2 X SSC 溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA 结合面朝上，放在一张干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，120ºC 烘箱中30 min，或者80ºC 2h，促进DNA与尼龙膜结合。
六、预杂交与杂交(1) 预杂交DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC摇动溶解5min，预热一定体积的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度42ºC 。
预杂交60min，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42ºC下充分润湿。
（此过程可以延长至数小时）(2) 探针变性：Dig标记的探针1ul（约25ng/ml）加40µl H2O, 95 ºC变性10min后迅速放在冰上冷却10min。
(3) 杂交：将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIG Easy Hyb混合液，继续在42 ºC下温浴过夜（单拷贝探针）。
含有探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20 ºC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68 ºC处理10min即可,不要煮沸DiG Easy Hyb杂交液七、洗膜与显色(1) 洗膜：2×SSC，0.1% SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。
0.5×SSC，0.1% SDS 65-68ºC温和振荡15分钟，洗2次(2) 免疫与显色：a. 杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（Washing Buffer，Buffer1）浸泡1-5minb. 在100ml 1×Block solution（Buffer2）中温育30minc. 用1×Block solution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）d. 用10ml antibody solution处理膜30mine. 用100ml马来酸洗膜15min，洗2次f. 在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5ming. 在8ml 新鲜配制的color substrate solution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。
注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16h内完成显色反应(在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)。
h. 5h后斑点出现，可在20ml水中洗膜5min中止反应。
i. 结果照像。