Southern杂交实验

Southern 杂交实验

Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

一、溶液配制

(1)20 X SSC(1000 mL) :

组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠

NaCl 175.32g

柠檬酸钠88.26g

NaOH调PH值到7.0，高温高压灭

(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml

组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.

Maleic acid：2.32g

Nacl： 1.75g

Tween20 0.6ml

NaOH固体约1.7g调Ph值7.5

(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml

组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)

Maleic acid：2.32g

Nacl： 1.75g

Tween20 0.6ml

NaOH固体约1.7g调Ph值7.5

(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml

组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)

Tris 1.21g,

NaCl 0.584g

MgCl2 1.01g

调ph值到9.5

(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol／L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol／L NaOH (10 g)，

(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol／L NaCl (87.66 g)，用

1 mol／L HCl调

(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL

(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖

(9)4 mol／L EDTA 100 mL

(10)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12,。114g Tris-base, 溶于80ml 蒸馏水中，用

HCl 调pH 至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。(11)0.5M EDTA (pH 8.0): 称取18.61g EDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调

pH至8.0后，用蒸馏水定容之100ml，高压灭菌，分装保存。

(12)T E buffer ：取1M Tris-HCl (pH 8.0) 5ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 1ml，用蒸馏

水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。

(13)10% SDS：称取10g SDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调

pH至7.2，定容至100ml。

(14)低严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成2 X SSC，并按照100:1( 2

X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成2 XSSC 0.1% SDS。

(15)高严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成0.5 X SSC，并按照

100:1(0.5 X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成0.5XSSC 0.1% SDS。(16)B locking Solution: 用Maleic acid buffer 将6#中的10 X Blocking Solution稀

释成1X的工作液，现配现用。

(17)A ntibody Solution :将4#试剂离心，按照1:5000加入Blocking Solution，2-8℃

可保存12小时，即每5ml Blocking Solution中加1ul Ab抗体，与地高辛标记探针结合。

(18)C olor substrate solution (显色液)：将5#试剂按照1:50 用Detection buffer稀

释，即从5#中取100ul 加入5ml Detection buffer，要避光，现配现用，用于显示抗体结合位点。

(19)杂交液DiG Easy Hyb：将64ml 无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37 ºC

摇动溶解5min。

二、基因组DNA的提取

采用CTAB法微量提取植物总DNA：

(1) 取叶片0.1～0.2g，剪碎，加入到2mL Eppendorf管中液氮研磨。

(2) 加入2 X CTAB 800μl, 65ºC水浴保温30min，不时颠倒混匀；

(3) 加入等体积800μl 的24 :1，混匀10中；

(4) 室温下12000rpm离心15min；

(5) 重复步骤（3）一次

(6) 小心将上清吸入新的1.5ml离心管中；

(7) 加入等体积异丙醇，颠倒混匀；

(8) -20 ℃放置30min以上，出现絮状DNA沉淀；12000rpm离心15min ，弃掉

上清；

(9) 75％乙醇洗涤1～2次，晾干沉淀；

(10) 加入2uL RNaseA（10ug/uL），37ºC处理20min，除去RNA。

(11) 加40ul ddH2O溶解DNA，-20℃贮存备用

三、酶切与电泳分离

(1) 酶切反应体系

1μg /μl15 μg

10×酶切buffer 30 μl

限制性内切酶（10U/μl） 6 μl

加ddH2O 至300 μl

(2) 混匀后于37ºC酶切16h，酶切完成后，取3μl酶切反应物电泳分析，检测

酶切效果

(3) 酶切完成后，用等体积氯仿抽提，0.1倍体积的3mol/L NaAc 和2倍体积无

水乙醇混匀后于—20 o C沉淀1h，

(4) 12000g，4ºC离心10min，小心弃上清，加入500μl 70% 乙醇洗一遍，离心

2 min，弃上清，少量TE或dd H2O溶解。