色谱分析(中国药科大学)第4章-第7节检测方法

第七节 检测方法一、理想检测器的特征① 灵敏度高② 对所有溶质都有快速反应③ 相应对流动相流量和温度变化都不敏感 ④ 不引起柱外谱带扩展 二、检测器的性能指标① 检测器的灵敏度：单位样品量（或浓度）进入检测器时所给出的响应值。

② 最低检出限：指检测器能给出可观测的信号（S/N>3）时进入检测池的最小样品浓度。

③ 线性范围三、紫外吸收检测器（ultraviolet absorption detector, UVD ） （一） 原理001lg bc I I e IT I A T ε-==⎛⎫= ⎪⎝⎭式中，I 为透射光强度，I 0为入射光强度，T 为透光率，A 为吸光度（absorbance ），又称光密度（optical density: OD ）或消光值（extinction, E ），b 为光在溶液中经过的距离，一般为吸收池厚度，c 是吸光物质溶液的浓度，ε为吸光系数。

如果溶液浓度单位采用mol/L ，b 的单位为cm ，则相应的吸光系数为摩尔吸光系数（molarabsorptivity ）或摩尔消光系数，单位为L/(mol •cm)，用符号ε表示，则A bc ε=由上式可见，吸光度与吸光系数、溶液浓度和光路长度成直线关系，当紫外检测器样品的光路长度一定时，ε值越大，灵敏度越高。

而ε的数值大小取决于波长和样品物质的性质，它表明物质分子对特定波长辐射的吸收能力。

（二） 单波长紫外检测器光源：低压汞灯 波长：254nm结构：双光路单流路系统特点：适用于相当多的有机化合物，特别是对芳香族化合物。

该检测器具有灵敏度高，稳定性好，结构简单，使用维护方便等优点。

（三） 多波长紫外检测器光源：氘灯、氢灯或中压汞灯 波长：200nm ～400nm特点：灵敏度要比单波长式UV-254检测器略低，选择性比UV-254高。

（四） 紫外/可见分光式检测器光源：氘灯（紫外区）/钨灯（可见区）。

(deuterium lamp 氘灯；comparator 比色器；grating 光栅；splitter 分光器；slit 狭缝。

)（五）扫描型可变波长紫外检测器它能在停止流动的情况下，记录样品池中洗脱组分的吸收行为。

优点：既可提供色谱图，又可提供紫外吸收光谱图，既可进行定量，又可进行定性。

缺点：停流扫描中断了色谱信息，也会导致色谱峰展宽。

（六）光二极管阵列紫外检测器光电二极管阵列检测器，又称光电二极管矩阵检测器，表示为DAD（diode array detector）、PDA（photo-diode array）或PDAD（photo-diode array detector）。

1、工作原理与仪器结构由于光电二极管阵列检测器在结构上的主要特点是用光电二极管阵列同时接受来自流通池的全光谱透过光。

为了适应这种特点，所以它在结构和光路安排上与普通的色散型紫外－可见光检测器有重要区别。

样品与光栅的相对位置正好相反的结构，经常被称为“倒光学”（reversed optics）系统。

一般，每个阵列有200～1024个光电二极管组成，它们的光敏范围为200～600nm，每只光二极管的分辨率为1～2nm。

2、特点①同时得到多个波长的色谱图，因此可以计算不同波长的相对吸收比。

②在色谱分离期间，对每个色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并计算其最大吸收波长。

③在色谱运行期间可以逐点进行光谱扫描，得到时间－波长－吸收值三维图形。

④可以选择整个波长范围的宽谱带检测，仅需一次进样，将所有组分检测出来。

光电二极管阵列检测器的光路紫外检测器的光路3、应用(1) 色谱峰的纯度检查Ⅰ）比较光谱法纯物质峰:在色谱峰范围内任何洗脱时间处所取的光谱图应该是一致的，仅在振幅上有差异（见图1），不纯物质峰：在色谱峰的不同部位得到的吸收光谱中，吸收最大值发生了位移（见图2）。

Ⅱ）吸收比法（比率色谱法）对于纯物质来说，两个特定波长处的吸收比应为一常数，与浓度无关，所以吸收比可以用作色谱峰纯度的检查指标。

纯物质色谱峰各点处的浓度不同，因而吸收光谱振幅大小不一，但吸收比应当相等。

Ⅲ）双波长法纪录被测组分在两个等吸收波长处的吸收值差对时间色谱图，纯峰应该得到一个零信号，否则证明有杂质存在。

(2) 色谱峰的鉴定①与标准品或标准光谱比较②三维色谱能提供更多更全面的信息(3) 宽谱带检测可以选择整个波长范围，例如从190nm～600nm，谱带宽度为400nm，仅需一次进样，则在这一段波长范围内有吸收的所有组分都能被检测出来。

(4) 峰抑制（peak suppression）如果两个化合物在色谱图中并未完全分开，但他们的吸收光谱却有很大差别。

通过选择适当的测定波长、参比波长和带宽，使一种化合物的色谱峰被完全抑制，提高选择性，实现未分离峰的准确定量分析。

这种峰抑制技术的代价是灵敏度将降低约10％～30％。

(5) 选择最佳波长①使检测波长随时间变化而变化，从而提高每一分离组分的检测灵敏度；②采用各组分的最大吸收波长同时进行多通道（多信号）检测。

四、荧光检测器(fluorescence detector , FD )1、工作原理与仪器结构许多化合物存在光致发生的现象，即它们可被入射光（称为激发光）所激发而发出波长相同的共振辐射或波长较长的特征辐射，即荧光。

荧光检测器就是在样品的激发波长处测量发射光的强弱。

（photo cell：光电池，即检测器，将荧光强度转化为电信号）2、优点①灵敏度极高。

比紫外可见光检测器约高两个数量级，最小检测量可达10-13g。

②良好的选择性。

③线性范围较宽，约104～105（比紫外吸收检测器窄）。

④受外界条件的影响较小。

⑤只要选作流动相的溶剂不会发射荧光，荧光检测器就能适用于梯度洗脱。

3、缺点①应用范围较窄（措施：与荧光试剂发生反应生成荧光衍生物）。

②荧光分析的干扰因素较多，影响测定的准确度。

五、电化学检测器（electrochemical detector, ECD）1、原理利用被测物在电极上发生氧化还原反应而产生电流，从而得以检测的一种方法。

电化学检测器测得的电信号与发生电极反应的被测组分的摩尔数成正比。

2、 适用范围① 可氧化化合物：酚、二羟基、过氧化物等 ② 可还原化合物：酮、醛、共轭不饱和化合物等HO NHCOCH 3NO 2COOH HO2NHC(CH 3)3OHOOOCH 3扑热息痛:特布他林：盐酸普鲁卡因：肾上腺素:HOHOHO COOCH 2CH 2N(C 2H 5)2 HClHOCHCH 2NHCH 3OH硝苯地平:NO 2NHCH 33H 3H 3COOC3、 特点① 高灵敏度，最低检出限，可达10-12g/ml ，故适合痕量分析。

② 高选择性，专属性强。

③ 线性动力学测定范围宽（106）。

六、示差折光检测器（Refractive Index Detector ）1、 原理基于连续测定色谱柱流出物折射率的变化而用于测定样品浓度。

溶有样品的流动相和流动相本身之间折射率之差即表示样品在流动相中的浓度。

原则上凡是与流动相折射指数没有差别的样品都可用它来测定。

2、结构类型反射式、偏转式、干涉型。

3、特点①检测限可达10-6～10-7g/ml；②对温度非常敏感；③检测灵敏度不高，但由于对所有的物质都有响应。

七、蒸发光散射检测器(Evaportive light Scattering Detector, ELSD)1、工作原理与仪器结构ELSD都是三部分组成，即雾化器、加热漂移管和光散射池。

雾化――用惰性气体雾化脱洗液；蒸发――流动相在加热管（漂移管）中蒸发；检测――样品颗粒散射光后得到检测。

2、影响ELSD的因素(1) 漂移管温度的影响随温度升高，流动相蒸发趋向完全，信噪比升高，但温度过高可能导致组分部分气化而使信号变小。

最优温度应是在流动相基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度。

(2) 载气流速对响应值的影响随气体流速的增大，响应值随之减小。

最优气体流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大响应的最低气体流速。

(3) 盐对基线噪音的影响对高浓度的盐，盐的不完全挥发会造成基线升高，使样品响应值受气体流速的影响相对变小；对低浓度的盐，盐较完全挥发使响应值受其影响较大。

对用做缓冲盐的盐既要容易挥发，又要具有好的纯度，一般盐的挥发性越大，所需的气体流速和漂移管温度越低。

3、ELSD的特点①通用型质量检测器。

②灵敏度高，LOD为10ng，采用细内径柱可使检测灵敏度增至最大。

③对流动相系统温度变化不敏感，不必严格控制温度。

④可进行梯度洗脱，基线平稳，分离时间短，提高定量精度。

⑤适用于非挥发性物质。

⑥流动相应是易挥发的溶剂，可用100%水及可挥发的缓冲溶液，但缓冲液浓度应尽可能低。

⑦峰面积和峰高的自然对数分别与浓度的自然对数有较好的线性关系。

八、液相色谱与其它仪器的联用1、与质谱联用LC-MS结合了液相色谱和质谱，取长补短，因而集LC的高分离能力与MS 的高灵敏度、高专属性于一体。

(1) 原理样品转变为气态离子。

利用离子在电场和磁场中的运行性质，将这些离子在真空状态下按其质荷比(m/z)进行分离。

质谱图就是一张以相对离子流强度为纵坐标、以质荷比(m/z)为横坐标的曲线图。

(2) 作用①定性：主要是以HPLC为分离手段，以质谱为定性手段，进行药物体内代谢物的研究，或降解产物的研究。

②定量：主要以样品中组分的基峰的高度为指标进行定量，但一般需以同位素标记的被测物为内标才能确保定性的准确性。

若没有同位素内标，则至少也要选择结构及裂解方式基本与被测物相似的物质作为内标。

2、与核磁共振联用(1) 优点核磁共振（NMR）是一种信息丰富的检测手段，其化学位移和偶合常数能提供丰富的有关分子中每个氢原子的局部电子环境的结构信息。

(2) 应用范围在聚合物应用方面：测定组分结构和分子量、聚合物动力学研究等。

在药物和临床化学方面有：不需事先分离就能检测混合物中的各组分，分析体液如尿、胆汁、血清、生物体培养等；研究代谢过程和药效学。

LC-NMR方法与常规代谢物分离鉴定相比，可节省时间，尤其对不稳定的化合物分析有利。

3、与气相联用LC分离中使用GC检测器检测，不但提高了灵敏度，而且更重要的是提高了检测的选择性。

LC与GC检测器联用中的重要的是接口设计。

LC的微型化促进了LC同GC检测器的联用可行性，其中最成功的应该是LC-ECD。