最新酶学第五章 酶的分离纯化与制剂ppt课件

主讲教师：赵丹丹
第五章 酶的分离纯化与制剂
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第二节 酶的抽提
抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。
主要内容：预处理和破细胞 抽提 浓缩
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一、预处理和破细胞
着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将 完整材料立即冰冻保存。
霉菌：易处理 细菌：少量超声和溶菌酶；大量丙酮干粉法或自溶法；工业生产中，
细菌材料可以用细菌磨或挤榨器等处理。 酵母：由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法，后来采用的办法有：
①细胞壁溶解酶处理法；②稀盐溶液振荡法；③冷热破壁法。
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二、抽 提
1. 抽提方式 (1) “普遍”抽提； (2) 选择性抽提，即先后用不同溶剂进行选择性抽提。 2. 由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶
所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温 度与pH条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯 以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶 液化。
有人认为不是好方法，理由是：
第一，自溶液中成分十分复杂；
第二，有破坏目的酶的危险。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption） (6) 注意微生物的种类不同处理方法及难易程度也有差异。
液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择则取决于酶的溶解性、稳 定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。 3. 酶提取的主要方法 (1) 盐溶液提取 (2) 酸、碱溶液的提取 (3) 有机溶剂提取
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二、抽 提
4. 酶提取的注意事项
(1) pH 应考虑的是酶的酸碱稳定性，选择的pH不能超出酶的稳定范围。 从最佳的抽提效果而言，选择的pH最好远离目的酶的等电点。也就
酶学第五章 酶的分离纯化与 制剂
第一节 酶分离纯化的一般原则
预防蛋白质变性失效的方法与措施
主要内容：防止酶变性失效 选择有效的纯化方法 酶活性测定贯穿纯化过程的始终
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一、酶分离纯化的概述
酶工业生产中属于下游技术！
最终目的（ 获得高度纯净的酶制剂 ）
整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液； (2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从
入5～10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后 低温干燥，研磨过筛 丙酮处理优点：
① 能有效地破坏细胞壁（膜）；② 有利于除去大量脂类物质，以免 它在以后的步骤产生干扰；③ 能使某些膜结合酶易于溶解；④ 丙酮 干粉含水量低，便于保存。 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。
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包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去； (3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。
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四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终
酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的 抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。 从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与 比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么 条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定 其取舍。
是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白 质宜用酸性溶液。例如胰蛋白酶的抽提，通常选用0.125mol/L的硫酸， 这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的 杂质也较少。
考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用 pH4～6为佳。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(3) 物理破碎法 ① 温度差破碎法
② 压力差破碎法：高压冲击法；突然降压法；渗透压差法
③ 超声波破碎法
(4) 化学破碎法 有机溶剂处理 表面活性剂处理
(5) 酶法破碎法 ① 外加酶处理 ② 自溶法(Autolysis)
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一、预处理和破细胞
3. 根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。
(1) 细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题； (2) 细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和
酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。 ‘‘周质酶”（periplasmic enzyme）通常只需将外层细胞壁或膜 破坏后就可释放； “膜结合酶’’（membrane-binding enzyme）则往往还有一个切 断酶与颗粒体或膜的连结问题。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(1) 机械破碎法 机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器 研磨法 匀浆法
高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶 失效；
加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时 也可能发生吸附变性。
在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉， 或者进行反复冰冻溶解处理。
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一、预处理和破细胞
4. 细胞破碎（cell disruption）
(2) ‘‘丙酮干粉’’（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下、加