WB的原理、操作及注意事项

WB的原理、操作及注意事项

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1〜5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备

A：样品的制备

1 组织：

组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。

2 细胞：

细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集，

180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。

B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因

1. 双缩脲法：

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L 〜10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三

氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量

测定。

2. Lowry 法：

此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性

溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深

蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L〜400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上

述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液

中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络

合物所还原。

3. 紫外吸收法：

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1〜0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：

M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”™ - 0.76 \ m

280 260

Ion

A A

2S0是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。办心是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。

此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其

他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各

0 1%

种蛋白质在280nm处的消光系数（：前）在0.5〜2.5之间变化。

所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的 a 0.1%在225nm

和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用

于测定浓度为10卩l/ml〜100卩l/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：

蛋白匪蔽fTfmg/L）- IM亡［7二二

"2 光密度之差求

得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较

大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改

变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。

4. Bradford 比色法：

Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白

可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。

分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5, 10, 15和20卩l ）,以

0.15mmol/l NaCI 补足至100 l，同时以两管100 ^1的0.15mmol/l NaCI 作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测

A595,取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA

标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100ug的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体

积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100^g另作一标准曲线进行测定。

5 •电泳估算法（我们选择此法）：

样品倍比稀释，SDS-PAG电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。

以提取癌组织总蛋白为例：

①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5〜10次，再用预冷的

1 X PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。

②每2克组织加入3ml 1 X PBS匀浆，保持在4C条件进行。

③加入5X STOFBuffer缓冲液1ml,混匀，4C下超声碎化。再加入0.5ml 3 -ME, 0.5ml

溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；

④SDS-FAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS- PAGE

A:实际操作

1. 做胶前的准备

1）检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。

2）检查是否有新鲜的，足量10%APS没有立刻重配。