Protein Crystallography-蛋白质结晶学

第三章鱼类营养学原理蛋白质营养影响蛋白质消化率因素.

第三章鱼类营养学原理 第一节蛋白质的营养 蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成 部分都有蛋白质参与。那么在鱼类营养中，是不是饲料中的蛋白质水平越高就越好呢？为什么， 在众多饲料蛋白源，一般鱼类对鱼粉的消化利用率比其它蛋白源饲料高呢？ （一）：蛋白质营养 1.蛋白质的组成 含C、H、O、N，部分蛋白质含少量Fe、P、S，蛋白质的平均元素含量： C 53%，H 7%，O 23%，N 16%，S+P <1% N平均含量为16%，这是概略养分分析法CP含量计算的理论依据。 CP=蛋白质含N量÷16%=蛋白质含N量×6.25 蛋白质的基本组成单位是氨基酸，主要由20种氨基酸组成。 2.蛋白质的生理功能 机体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20种氨基酸按不同比例组成的，并 在体内不断代谢与更新。 ①细胞原生质的重要组成成分；是碳水化合物和脂肪不可替代的，是除水外，含量最多的营养 物质，占干物质的50%，占无脂固形物的80%。 ②组织生长、更新、修补的物质来源。动物体蛋白质每天约 0.25-0.3%更新，约6-12月全部更新。 ③参与构成酶、激素和部分维生素。酶的本质是蛋白质；含氮激素：生长激素、甲状腺素、肾 上腺素、胰岛素、促肠液激素；含氮维生素：尼克酸 ④蛋白质是水生动物主要的能量来源，为鱼类提供能量，转化为脂肪和糖类：蛋白质的燃烧热 值为5.654卡/克，生理热价 4.4卡/克左右 ⑤参与机体免疫：抗体的成份绝大部分均为蛋白质 ⑥参与遗传信息的控制：DNA、RNA ⑦维持毛细血管的正常渗透压 ⑧运输功能：血红素 ⑨参与血凝和维持血液酸碱平衡。 3.鱼类对饲料蛋白质的利用 ①消化部位：主要在胃和小肠上部, 20%在胃,60-70%在小肠,其余在大肠。 ②吸收：部位在小肠上部，主动吸收 吸收的顺序： L-AA > D-AA Cys>Met>Try>Leu>Phe>Lys≈Ala>Ser>Asp>Glu

蛋白质组学研究方法选择及比较

蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：

●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。

蛋白质纯化与结晶的原理

蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载体（expression vector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沉淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～50mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。

基因组学与蛋白质组学

《基因组学与蛋白质组学》课程教学大纲 学时： 40 学分：2.5 理论学时： 40 实验学时：0 面向专业：生物科学、生物技 术课程代码：B7700005先开课程：生物化学、分子生物 学课程性质：必修/选修执笔人：朱新 产审定人： 第一部分：理论教学部分 一、课程的性质、目的和任务 《基因组学与蛋白质组学》是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，是融合了生物信息学、计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。是当今生命科学研究的热点与前沿领域。由于基因组学与蛋白质组学学科的边缘性，所以本课程在介绍基因组学与蛋白质组学基本基本技术和原理的同时，兼顾学科发展动向，讲授基因组与蛋白组学中的热点和最新进展，旨在使学生了解现代基因组学与蛋白质组学理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 二、课程的目的与教学要求 通过本课程的学习，使学生掌握基因组学与蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在基因组学与蛋白质组学上的应用及典型研究实例，熟悉从事基因组学与蛋白质组学的重要方法和途

径。努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，并通过学习提高自学能力、独立思考能力以及科研实践能力，为将来从事蛋白质的研究奠定坚实的理论和实践基础。 三、教学内容与课时分配 第一篇基因组学

第一章绪论（1学时） 第一节基因组学的研究对象与任务； 第二节基因组学发展的历程； 第三节基因组学的分子基础； 第四节基因组学的应用前景。 本章重点： 1. 基因组学的概念及主要任务； 2. 基因组学的研究对象。 本章难点： 1.基因组学的应用及发展趋势； 2.基因组学与生物的遗传改良、人类健康及生物进化。建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题： 查阅有关资料，了解基因组学的应用发展。 第二章人类基因组计划（1学时） 第一节人类基因组计划的诞生； 第二节人类基因组研究的竞赛； 第三节人类基因组测序存在的缺口； 第四节人类基因组中的非编码成分； 第五节人类基因组的概观； 第六节人类基因组多样性计划。 本章重点： 1. 人类基因组的研究； 2. 人类基因组多样性。 本章难点： 人类基因组序列的诠释。 建议教学方法：课堂讲授和讨论 思考题：

果实蛋白质组学研究的实验方法

植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 107?116, w w https://www.360docs.net/doc/1318157785.html, 收稿日期: 2008-04-22; 接受日期: 2008-05-10 基金项目: 国家自然科学基金(No. 30671473, U0631004) * 通讯作者。E-mail: tsp@ibcas.ac.c n .技术方法. 果实蛋白质组学研究的实验方法 王清1, 2, 产祝龙1, 秦国政1, 田世平1* 1中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100039 摘要 双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH 梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF 管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。 关键词 果实, 凝胶染色, 等电聚焦, 裂解缓冲液, 蛋白质提取 王清, 产祝龙, 秦国政, 田世平 (2009). 果实蛋白质组学研究的实验方法. 植物学报 44, 107?116. 果实生长发育阶段的生理代谢变化, 以及采后处理 对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研 究中, 我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗 氧化酶类和防御基因的表达(Chan and Tian, 2006; Tian et al., 2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非 生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能, 利用蛋白质 组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要 的手段。 蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、 胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今, 蛋白 质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研 究(Antelmann et al., 1997; Qin et al., 2007), 在植物 生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaner et al., 1992; Chang et al., 2000)。植物细胞中包含许多 次生代谢物质, 可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化 (Granier, 1988; Meyer et al., 1988)。而从果实组织 中提取蛋白质更加困难, 可能是由于果实中蛋白质含量 相对较低, 并且含有大量干扰性物质, 如色素、淀粉、 多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(C l e m e n t s ,1970)。因此, 建立蛋白质提取的有效方法和标准化技术体系对于果实蛋白质组学研究十分必要。本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上, 建立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(P r u n u s a v i vu m )、桃(P r u n u s p e r s i c a )、苹果(Ma l u s domestica )、芒果(Mangifera indica )和冬枣(Ziziphus jujub a )的蛋白质组学研究方法, 包括蛋白质的抽提、蛋白质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色方法等。1 材料与方法1.1 实验材料桃(Prunus persica L. Batsch)采于北京市平谷的试验果园, 甜樱桃(Prunus avivum L. ‘Hongdeng ’) 采于中国科学院植物研究所的试验果园, 苹果(Malus domestica Borkh ‘Fuji ’ ) 采于中国农业科学院林果所果园, 芒果(Mangifera indica L. ‘Zill ’)和冬枣(Ziziphus jujub a Mill. ‘Dongzao ’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨

基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响

通过校园网进入数据库例如维普期刊数据库、CNKI、超星电子图书等。完成 A、任选一题，检索相关资料，截取检索过程图片，做成一个ppt文件（50分）。 B、写综述形式的学术论文(学术论文格式，字数不限，正文字体小四)，做成word文件（50分）。要求：按照自己的思路组织成文件，严禁抄袭。 写明班级学号，打印纸质版交给老师。 1、对检索课题“磷酸对草莓生长和开花的影响”检索中文信息。提示：磷酸的化学物质名称是“Phosphonic acid ”普通商业名称是“ethephon”， 2、基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响 3、红霉素衍生物的设计、合成与抗菌活性研究 4、HPLC法测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中L-谷氨酰胺的释放度 姓名：朱艳红 班级： 11生科师范 学号： 11223074 学科教师：张来军

基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响琼州学院生物科学与技术学院 11生科师范2班朱艳红 11223074 摘要 20世纪末伴随着人类基因组计划的实施，相继产生了基因组学和蛋白质组学，基因组学和蛋白质组学的迅速发展，对药学科学产生着深远的影响。文章在简介蛋白质组学基本概念、核心技术的基础上，综述了基因组学和蛋白质组学对新药研发带来的影响。 关键词：基因组学；蛋白质组学；药物研发 The impact of genomics and proteomics on the research and development of innovative drug abstract With the implementation of the 20th century,Genomics and proteomics had emerged one after the other. Driven by Soaring development of the omits，pharmaceutical industry presents a new vision，all human life faces a promising future. On the basis of proteomics Introduction to basic concepts, core technology, reviewed the genomics and proteomics research on the impact of new drugs. Keywords:Genomics; proteomics; drug development

解析蛋白结晶的过程

说起蛋白结晶，中国可有着很悠久的历史呢。1965年中国首次人工合成了结晶牛胰岛素。这是第一个与天然蛋白有着相同性质并具有生物活性的人工合成蛋白，也是蛋白结晶的首个成功例子。2004年，中国科学院生物物理研究所常文瑞研究员发现的菠菜主要捕光复合物(LHC-II)的晶体结构，以封面形式在《Nature 》杂志上发表（图1）。 最近，饶子和院士等在《Nature 》杂志上发表文章，展示了禽流感病毒H5N1聚合酶内部的晶体结构。此外，饶教授已经解析出 了50多个重要蛋白质的晶体结构，包括艾滋病毒基质蛋白SIV-MA 、IgA Fc 受体（CD89，JBC 的封面，图2）、第一个SARS 病毒蛋白 -3CL PRO 。看着饶教授的丰硕成果，大家可能都很感兴趣蛋白结晶是怎么样做的，简单说吧，就是将表达目的蛋白的DNA 片段PCR 之后克隆到表达载体上，然后在大肠杆菌中诱导表达，得到大量的蛋白并纯化，摸索结晶条件，等它结晶（时间长短不定），拿到晶体之后进行X 射线衍射，收集衍射图谱，通过计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。看上去似乎很简单，其实不然。在1971年蛋白数据库PDB （https://www.360docs.net/doc/1318157785.html, ）刚刚成立时，只有可怜的7个蛋白结构；不过蛋白结晶的方法也在不断改进，因此PDB 的结构数也呈指数增长，目前已达到了52684个。生物通就结合绕教授的文章，给大家解析一下蛋白结晶的过程。 图1 LHC-II 的晶体结构 图2 IgA Fc 受体的结构 1．蛋白表达和纯化 这个大家都比较熟悉了，简单说一说。用PCR 扩增目的蛋白的结构域。PCR 产物纯化后克隆到大肠杆菌表达载体上。饶教授在两篇文章中分别用了pGEX 6p-1（GE Healthcare ）1和pET-28a （Novagen ）2的载体，然后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行表达，再利用相应的层析柱纯化，如果需要的话，还要用蛋白酶将较大的标签切除。这一步的关键是得到大量纯化的蛋白质（>10mg ），其浓度通常在10mg/ml 以上，才能进行结晶条件的筛选。不过蛋白表达量高了，经常就会形成包涵体，所以还要优 化变复性的条件，使蛋白正确折叠。 2．蛋白结晶 蛋白质晶体的培养，通常 是利用气相扩散（Vapor Diffusion ）的原理来完成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～ 50mg/ml ）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋 白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态 2008年9月10日四十期第 4 页，共 21 页下一页 返 回

蛋白质的性质实验(二)

蛋白质的性质实验（二） 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸和醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200 mL锥形瓶内，用少量40～50 ℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10 mL1 mol／L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至 100 mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 5．操作 （1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4 管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀及变性 1．目的 （1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 （3）了解蛋白质变性和沉淀的关系。 2．原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶 体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀和凝固，蛋白质和重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

基因组学(结构基因组学和功能基因组学).

问:基因组学、转录组学、蛋白质组学、结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学研究有哪些特点? 答:人类基因组计划完成后生物科学进入了人类后基因组时代,即大规模开展基因组生物学功能研究和应用研究的时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。以功能基因组学为代表的后基因组时代主要为利用基因组学提供的信息。 基因组研究应该包括两方面的内容:以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学(functional genomics。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段,以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段,是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能,它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。 功能基因组学(functional genomics又往往被称为后基因组学(postgenomics,它利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和应用新的实验手段,通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。 基因的功能包括:生物学功能,如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰;细胞学功能,如参与细胞间和细胞内信号传递途径;发育上功能,如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交,差示筛选,cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等,但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生,包括基因表达的系统分析,cDNA微阵列,DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异,因此需要建立模式生物体。 功能基因组学

营养学名词解释

名词解释 1.营养:营养是机体摄取食物，经过消化、吸收、代谢和排泄，利用食物中的营养素和其他对身体有益的成分构建组织器官、调节各种生理功能，维持正 常生长、发育和防病保健的过程。 2.营养素nutrient维持机体繁殖、生长发育和生存等一切生命活动和过程，需要从外界环境中摄取的物质。 3.营养价值指某种食物所含营养素和能量能满足人体营养需要的程度。 4.营养不良malnutrition指由于一种或一种以上营养素的缺乏或过剩所造成的机体健康异常或疾病状态。包括营养素是否种类齐全，数量是否充足和相 互比例是否适宜，并且是否被人体消化、吸收和利用。 5.消化食物在消化管内经过物理的、化学的和微生物的作用，使它们转变成可溶的、结构简单的小分子物质才能被吸收利用，这一转变过程称为消化。 6.吸收：食物的消化产物(如葡萄糖、氨基酸、甘油、脂肪酸)、水和无机盐等,通过消化道黏膜上皮细胞进入血液和淋巴的过程,叫吸收。 7.被动转运：指物质或离子顺着浓度梯度或电位梯度通过细胞膜的扩散过程，其特点是不需要细胞提供能量。 8.主动转运某些物质(如钾离子、钠离子)以细胞膜特异载体蛋白携带下，通过细胞膜本身的某种耗能过程，逆浓度差或逆电位差的跨膜转运称为主动转运。 9.胞饮作用：指活细胞不靠通透性从外界摄取液态物质的现象。（指内吞细胞外液体。） 10.完全蛋白质/优质蛋白质完全蛋白质：指那些含有的必需氨基酸种类齐全，含量充足，相互比例适当，能够维持生命和促进生长发育的一类蛋白质。 优质蛋白质：食物蛋白质的氨基酸模式越接近人体蛋白质的氨基酸模式，则这种蛋白质越容易被人体吸收利用，称为优质蛋白质。 11.必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）：在人体内不能自身合成或合成速度远不能满足机体的需要，必须从食物中获得。 12.限制性氨基酸（limiting amino acid，LAA）：食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸相对含量较低或缺乏，导致其它的必需氨基酸在体内不能被充分利 用，造成其蛋白质营养价值降低，这些含量相对较低的必需氨基酸称限制氨基酸。 13.蛋白质互补作用complementary action of protein：由于食物蛋白质中限制氨基酸的种类和数量各不相同，如将几种食物进行混合，能起到取长补短， 使其必需氨基酸的构成更接近人体需要量模式，从而提高蛋白质在体内的利用率，这种作用称为蛋白质的互补作用。 14.蛋白质消化率指一种食物蛋白质可被消化酶分解的程度。蛋白质消化率越高，被人体吸收利用的可能性越大，营养价值也越高。 15.必需脂肪酸essential fatty acid ：是指人体不可缺少而又不能自身合成，必须通过食物供给的脂肪酸。 16.n-3多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid,PUFA) ：n-3（或w-3）系列不饱和脂肪酸，即从甲基端数，第一个不饱和键在第三和第四碳原子 之间的各种不饱和脂肪酸。 17.n-6 PUFA ：n-6（或w-6）系列不饱和脂肪酸，从甲基端数，第一个双键在第六和第七碳之间。 18.反式脂肪酸Trans Fatty Acid ：是分子中含有一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸。 19.内源性胆固醇：由肝脏合并随胆汁进入肠腔的胆固醇，一般为2至3g/d。 20.膳食纤维指不能被人体消化道酵素分解的多糖类及木植素。 21.节约蛋白质作用：机体一切生命活动都是以能量为基础，当碳水化合物供能不足时，将由蛋白质、脂肪产能来弥补，即为糖类对蛋白质 的保护作用。 22.抗生酮作用当碳水化合物不足时，脂肪酸不能被彻底氧化分解而产生过多酮体，会产生酮症酸中毒；当碳水化合物充足时，可防止酮症酸中毒的发生， 这种作用称为抗生酮作用。 23.功能性低聚糖：是由2~10个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合糖，分功能性低聚糖(functionaloligosaccharide)和普通低聚糖两大类。 24.功能性多糖：是一类由十个以上单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物,广泛存在于动植物和微生物中。 25.食物血糖指数glycemic index：某种食物升高血糖效应与标准食品（通常为葡萄糖）升高血糖效应之比。GI值越高，说明这种食物升高血糖的效应越 强。 26.基础代谢(basal metabolism,BM) ：指人体维持生命的所有器官所需要的最低能量需要。

质谱技术在蛋白质组学研究中的应用_甄艳

第35卷　第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 　收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 　基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002)　作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 　引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄　艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏　南京　210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化

蛋白质结晶方法探究

蛋白质结晶方法探究 发表时间：2018-08-20T14:56:45.123Z 来源：《医药界》2018年1月下作者：高铨，解婧妍 [导读] 有机大分子蛋白质是生命物质基础，其基本组成单位是氨基酸，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。它与生命以及各种生命活动紧密联系，几乎参与了全部生理过程。蛋白质还是大多数食品的主要成分，是一类重要的产能营养素。（西北工业大学陕西西安 710072） 本文相关工作受到国家级大学生创新创业训练计划（新型CDM结晶板悬滴法对蛋白质结晶影响，资助号#201710699109）支持。【摘要】有机大分子蛋白质是生命物质基础，其基本组成单位是氨基酸，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。它与生命以及各种生命活动紧密联系，几乎参与了全部生理过程。蛋白质还是大多数食品的主要成分，是一类重要的产能营养素。蛋白质的复杂结构决定了其功能的复杂性，鉴于此，要研究蛋白质的具体功能及其应用的前提是解析出高分辨率的三维结构。 【关键词】蛋白质结晶 X射线衍射晶体质量 引言 目前，测定蛋白质空间结构的有效方法主要有X射线衍射技术、核磁共振技术及电镜技术。电镜法研究不染色的蛋白质分子结构明显的困难是样品对电子损伤的高敏感性和样品在真空中三维结构的改变。核磁共振技术解析蛋白质的结构虽不需结晶，可研究动力学，但因分子量的限制，且需要标记。因此，解析蛋白质的结构最有力的方法首推X射线衍射技术，它能精确确定生物大分子中各原子坐标，确定共价键键长、键角。 据PDB数据库的统计，超过88%的蛋白质是由X射线衍射技术得到的，所以充分利用这项技术对于开展后续研究十分重要。X射线衍射技术解析蛋白质结构需获得蛋白质晶体，而这种晶体不是普通的晶体，它必须具有足够大小和质量才能保证数据收集的准确性。因此，得到符合要求的晶体成为了整个衍射过程的关键，是最终决定结构解析成功与否的因素。获得可以用于X射线衍射的高质量蛋白质晶体也成为晶体学领域追求的目标。 蛋白质结晶过程是蛋白质分子在溶液中析出的过程。蛋白质分子首先在其过饱和溶液中形成晶核，之后由于溶液中蛋白质浓度降低，蛋白质结晶生长趋于平稳，具体表现是蛋白质不再形核，晶体逐渐长大。这个过程中要想获得高质量的蛋白质晶体一般需要考虑一些问题，如如何获得高纯度的蛋白质溶液，选择什么结晶方法能获得质量好的晶体。本文基于此，对现有结晶方法进行总结，并介绍一些在蛋白质结晶领域的新技术。 1 传统结晶方法 A. 批量结晶法 该方法是最古老也是最简单的方法，蛋白溶液和结晶试剂开始就在确定的浓度下混合，其中蛋白质溶液一定是处于过饱和状态[1]。混合溶液一般处于密封的体系下，溶液各种参数都不变化，形成的晶体也不溶解。这种方法也有一个比较明显的缺点，由于这种方法需要大量且纯净的蛋白质晶体，但多数纯化得的蛋白质最终量都是非常少，所以，该方法未被大量使用，取代的是微量批量结晶法[2]，该方法只需非常少量的结晶液，结晶液滴混合后被分配到低密度的石蜡油和硅胶的混合物中。因液滴的密度要大，故整个过程都在石蜡油中进行，在这种混合物中的结晶效果等同于蒸汽扩散结晶，同时又可以防止溶剂挥发、空气污染和外界晃动，方便装置的移动，但溶液包含小分子有机物的实验不能用此方法，因为他们会溶解入油滴中。 B. 气相扩散法 气相扩散法主要是利用在蛋白质和沉淀剂混合的液滴中，沉淀剂的浓度低于晶体形核所需要的浓度，导致水分子不断从低浓度的液滴向高浓度的液池扩散，液滴中的蛋白质浓度逐渐增加并于沉淀剂结合，进而实现结晶。 气相扩散法的优点在于晶体生长的过程缓慢，蛋白有足够的时间在晶格中堆积，节省样品而且可有效利用储存空间。 C. 平衡透析法 平衡透析法需要用半透膜在装置里形成一个分隔面，在左右两边分别是蛋白质溶液和结晶试剂，因为两边存在浓度梯度，所以在结晶试剂里的小分子如离子、添加剂和缓冲剂就会通过半透膜进入到样品区，样品区的沉淀剂浓度逐渐增加。与此同时，由于蛋白质分子属于大分子，不能通过半透膜，由于结晶试剂里的小分子在样品区的浓度逐渐增加，蛋白质浓度就会逐渐下降，最终达到过饱和状态形核结晶。这种方法可以用于大规模的结晶实验，但要注意的是不是所有的结晶试剂都能应用此方法。 D. 液-液扩散法 又叫自由界面扩散法，这个方法是利用扩散作用而达到体系平衡并析出蛋白质晶体的过程。通常是将样品蛋白质溶液和结晶液在一个毛细管状的容器中，两者存在着浓度梯度，通过缓慢的扩散，整个系统自发的选择形核和晶体生长的过饱和状态。这种方法在确定了沉淀剂、pH和缓冲液后，可以作为筛选条件的微调实验。 2新技术的应用 一些生物结构科学家通过将传统方法和现在最新技术相结合，在传统的基础上提出了一系列有关于蛋白质结晶的新方法，提高了蛋白质结晶的质量。 由于蛋白质晶体生长是在晶核的基础上进行的，晶核的质量直接影响到蛋白质量。由于高质量的晶核是在较低的过饱和的状态下形成的，条件比较难控制。因此在2004年Ireton等学者利用低分辨率的晶体作为籽晶，导入到新结晶溶液中得到了适于衍射的高分辨率晶体[3]。D’ Arcy 等人在此基础上用导入籽晶的方法对牛胰岛素等5种蛋白结晶条件进行了筛选，发现导入籽晶可以有效的提升使蛋白质结晶筛选的成功率[4]。 共结晶技术近年来也成为提高蛋白质结晶质量的一种常用方法。有些晶体在与核苷酸、协同因子或是一些小分子可以稳定存在。Schartman等学者通过计算的方法证明共结晶技术可稳定晶体热力学性质，从而更易得到晶体[5]。实验证明这种方法尤其适用于配体溶解度很低或者蛋白质分子容易聚合的情况下，可以显著提高结晶成功率，尤其是一些膜蛋白只有与配体共结晶后才能得到晶体。

蛋白质纯化与结晶的原理

获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载（expressionvector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10-50 mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40%至60%之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。