[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。

比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。

对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。

一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。

✓KM71比GS115生长的要慢。

毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。

转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。

建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。

乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。

6)20ul ddH2O重溶）电击转化：8. 将5~20 µ g 的线性化DNA 溶解在5~10 µ l TE溶液中，与80 µ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中；9. 将电转化杯冰浴5min；10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP 管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板）12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 µ l 涂布一块平板；13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。

推荐：电压1.5kV ；电容25µF ；电阻200 Ω。

电击时间为4 ～10msec。

Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。

3. 用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，利用5’AOX 1和3’AOX 1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichia pastoris基因组，则会扩增到两条带，一条为2.2kb（KM71为3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。

)Each 50 µl aliquot of competent Pichia cells with 3 µg linearized plasmid DNA will yield 50 colonies on selective medium.Muts 表型重组酵母的诱导表达实验As a general rule when inducing expression, never allow cultures to be more than 10-30% of your total flask volume.1. 挑选一单菌落，置于装有50ml MGY、BMG 或BMGY培养基的500ml 摇瓶中，于28-30°C /250-300 rpm 培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；2. 室温下1500~3000g 离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM, BMM或BMMY重悬菌体（约2.5~5ml ）；3. 将步骤2 所得的菌液置于100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30 °C/250-300 rpm 的摇床上继续生长；4. 每24h 向培养基中添加100 ％甲醇至终浓度为0.5 ～1.0%；5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP 管中，最大转速离心2~3min ，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

时间点一般取：0 、24、48、72、96和120h；6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80 °C 保存备用；7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1. 挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300 rpm培养至OD600 = 2-6 (~16-18 h)；2. 室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600 =1.0左右（约100~200ml）；3. 将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm的摇床上继续生长；4. 每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7. 可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

BMGY和BMMY的换液方式有2种：1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。

2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。

是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。

如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。

用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。

也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。

菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。

麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。

如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10-1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。

通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。

摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。

摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。

Mut+/Mut s的筛选用Sac I，Sal I or Stu I 线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Mut s的转化子存在（见Invitrogen protocol p36），Not I or Bgl II线性化插入AOX I位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Mut s。

Use the plates containing the His+ transformants and screen for the Mut+ and MutS phenotype as described below.1. Using a sterile toothpick, pick one colony and streak or patch one His+ transformant in a regular pattern on both an MM plate and an MD plate, making sure to patch the MM plate first.2. Use a new toothpick for each transformant and continue until 100 transformants have been patched (2-3 plates).3. To differentiate Mut+ from MutS, make one patch for each of the controls (GS115/His+ MutS Albumin and GS115/His+ Mut+ β -gal) onto the MD and MM plates.4. Incubate the plates at 30°C for 2 days.5. After 2 days or longer at 30°C, score the plates. Mut+ transformants will grow well on both MD and MM plates. MutS transformants will grow well on MD plates, but show little or no growth on the MM plates.We recommend purifying your His+ transformants to ensure isolation of a pure clonal isolates. You may do this before or after testing for the Mut phenotype.Replica-Plating ProcedureThis procedure gives a lower rate of misclassifications, but it increases the overall Mut+/MutS screening procedure by 2 days. You will need equipment to replica-plate.1. Using sterile toothpicks, patch 100 His+ transformant on MD plates (2-3 plates). For controls, make one patch from each of the strains GS115/His+ MutS Albumin and GS115/His+ Mut+β -gal onto the MD plates.2. Incubate the plates at 28-30°C for 2 days.3. After 2 days, replica-plate the patches from the MD plates onto fresh MM and MD plates to screen for MutS transformants.4. Incubate the replica plates at 28-30°C for 2 days.5. After 2 days at 28-30°C, score the replica plates. Look for patches that grow normally on the MD replica plates but show little or no growth on the MM replica plates. Including His+ Mut+ and His+ MutS control patches on each plate will provide examples of Mut+ and MutS phenotypes. Screening by Functional AssaySome researchers have used a functional assay to directly screen for high expressing Pichia recombinant clones without first screening for MutS or Mut+ phenotypes. If you elect to screen directly for high-expressing recombinants, be sure to also check the Mut phenotype. This will help you optimize expression of your recombinant clone.毕赤酵母基因组提取方法⑴接种重组和空质粒转化子于5ml YPD+k抗生素培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。