第九章 植物种质资源离体超低温保存

第一节 概 述

发展中国家印度也于1976年成立国家植物 种质资源局(NBPGR)，下设30个单位组成全印 植物种质资源保存体系，已保存20万份种质， 每年用于植物种质资源保存维护费110万美元； 1997年建成库容100万份的国家植物种质资源 库，成为世界植物种质资源大国。
第一节 概 述

英国 皇 家 植物园邱园的千年种子库工程(msBP)，是目前世界上最大的种质设施保存库。该库于 2001年建成并投人使用，MSBP计划到2010年使得 全世界干早地区2. 4万种以上(约10%)的植物种子得 到收集和保存，目前已收集保存了全英国95%的植 物种质资源，并与澳大利亚、埃及、肯尼亚、南非 等12个国家开展了合作，收集以干早地区为主的植 物种质资源，计划到2025年完成收集保存全球2.4万 种植物(约占1000)种质资源的目标。
第三节 超低温保存的方法



(4)超低温保存:将冷冻材料保存到有效低温环境 中，以防止冰的游移或解体。 (5)解冻:一般认为快速解冻更好。从液氮环境中 取出封装好的材料，与其容器一同放人+40℃的 无菌水浴中，直到解冻后才回到室温下，未封装 的材料放到20-30℃的液体培养基中解冻。 (6)生命力测定:如用TTC染色法等。
第一节 概 述

早在上个世纪中叶，世界各国就已经开始进 行植物(包括作物和森林植物)种质资源的收集 和保存工作。联合国粮农组织(FAO)在19471948年成立了“动植物遗传资源委员会”， 1967年成立了森林遗传资源专家组。 FAO/IBPGR支持和协调国家与地区的遗传资源 的调查、保存和利用，负责咨询有关提案和计 划，并在利用有限资金保存作物种质资源。
第九章 植物种质资源离体超低温保存
杨柏云
南昌大学生命科学学院
第一节 概 述

Fra Baidu bibliotek
植物种质资源保存主要有原地 保存、异地保存和设施保存3种方式. 设施保存是当前最有效、最安全的 保存方式,它包括种子低温保存、超 低温保存及种质离体保存等方法.
第一节 概 述


原地保存是指在植物资源丰富的地区建立 自然保护区、原地保存林等，以保护植物 种质资源及其生境； 异地保存是指当天然群体的遗传组成发生 严重的变化，或存在潜在破坏威胁的物种， 在植物种的非本地群体中收集种子或繁殖 材料，营建异地保存林(圃)进行集中保存。
第一节 概 述

一、植物种质资源低温保存意义

防止资源灭绝
节约人力物力 便于交流


第一节 概 述

二、超低温保存的概念 一般来说，低温所涉及的温度范围是不确定的。习惯 上，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度 （－70℃）称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武 等，1998）。对植物而言，低温常常是指那些比常温 稍低一些的温度。如果低温超过细胞原生质所能忍受 的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。如 甜橙树发生冻害的临界温度通常在－6.5℃，枳壳通常 在－20℃左右（沈德绪等，1986）。
第一节 概 述

保存种 子 、配子、器官或组织等，在人 工条件下使植物的基因(载体)能得到延续，为 未来的植物利用、培育计划服务，这是当前 世界各国生物多样性保护工作的重点之一。
第一节 概 述
全世界到1996年已建成1300多座植物种质 资源保存库，共保存各类植物种质610万份(含 重复)，其中低温库保存550万份，田间种植保 存库52. 7万份，试管苗保存3.76万份。1958年 建成的美国国家种质库是世界上第一座现代化 种质库，该库于1992年扩建成库容100万份的 现代化国家种质库，已保存各类植物种质资源 55万份，在科罗拉多Fort Collins的种子库则在 一196℃保存了26万份含水量6%的植物种子。
1．干冻法（desiccation） 利用无菌空气流、干燥硅胶或饱和溶液表 面的气相等对种质材料进行脱水处理，然后快 速将其投人液氮贮存。 2．预培养法（pregrowth） 也叫预冻法:将种质材料在添加保护剂(如 蔗糖、二甲亚矾、甘油等)后置于低温冰箱或液 氮蒸汽箱(-10~-700C)中冰冻若干小时后投人液 氮贮存。
第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础

二、植物细胞超低温保存过程中的致死损伤
细胞超低温保存有三个重要操作步骤： 一是细胞预冻； 二是细胞在－196℃下长期贮存； 三是细胞解冻。



第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础

植物超低温保存技术建立在生物细胞冻 害和抗冻机理的基础之上。种质超低温保存 成功的关键，在于降温冰冻过程中避免细胞 内结冰。为此，针对不同种类的植物材料， 筛选适合的冰冻保护剂，采用适当的降温冰 冻速度和化冻方式，可能使细胞不受损伤或 使损伤减小到最低程度。
第一节 概 述

2．用于离体超低温保存的植物材料 超低温保存技术在保存植物花粉、 种子和胚、芽、茎尖、胚状体、原生质 体、愈伤组织和悬浮细胞等方面有应用 和报道。
第一节 概 述

3．超低温保存的植物种类 目前主要应用在作物、果树和园林 花卉种质资源保存方面，林木种质资源 的超低温保存也有少量报道。 超低温保存已涉及到不同的植物种 类，如野生及人工创造的谷类、豆类、 薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、 果树、树木、药用植物和藻类等。
第四节 影响超低温保存效果的主要因素

二、预培养和低温锻炼 预处理对于调整植物离体材料的生理状 态非常有效。通过预处理的植物材料，减少 了细胞内自由水的含量，使细胞能经受低温 胁迫，减少或避免了冷冻伤害，可大大提高 材料的抗冻力。
第四节 影响超低温保存效果的主要因素

三、冰冻保护剂的应用 一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的 情况下经历低温后是很难存活下来的。所以， 生物体的低温保存离不开冰冻保护剂 （cryoprotective agent，CPA）。冰冻保护 剂也称作抗冻剂，合理地选择冰冻保护剂， 对低温保存至关重要。
第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础

一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键
植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的 60～90％。细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其 中游离水约占90％，很容易冻结。由于细胞内含有复 杂的化合物，细胞内的溶液并不象纯水那样在0℃左右 结冰。
第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础
第一节 概 述

但是，我国的林木及野生植物种质资源设 施保存仍处于起步阶段，中科院于1996年在西 双版纳热带植物园建立了一个小型的热带濒危 植物种质库，其实施保存的种质范围仅限于热 带地区的濒危植物;中国林科院于2001年建成了 一座小型低温库，目前保存了我国部分主要造 林树种的种质资源，尚未完成抢救保存任务， 离全面保存我国森林植物的种质资源目标相去 甚远。目前，中国林科院牵头的国家森林植物 种质低温库正处于筹建当中，该库能够容纳30 万份以上的林木种质，该库的建成将完成抢救 保存林木种质资源的任务。
第三节 超低温保存的方法

一、传统的降温冰冻方法 1．快速冰冻法 2．慢速冰冻法 3．两步法 4．逐级冰冻法
第三节 超低温保存的方法


二、玻璃化保存方法 玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体 （玻璃态）的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径： 一是大幅度提高冷却速率； 二是增加溶液浓度。
第三节 超低温保存的方法

3．预培养-干燥法(pregrowth-desiccation) 也叫两步法，种质材料在添加保护剂后，用程序降温
仪以某个速率(每分钟0. 1~0. 50C)降温至转移温度(－ 40~－70 0C )，然后投人液氮中贮存，两步法较预冻 法更为严格。

4．包埋脱水法（encapsulation- dehydration）
第三节 超低温保存的方法




超低温保存植物种质资源的程序包括下 面几个步聚： (1 )前培养:对培养体短期的生长锻炼处理， 使其提高耐液氮保存的能力。 (2)防冻:培养体放人防冻液中，使其细胞降 低冰点，减少因形成冰晶可能造成的损伤。 (3)变温冷冻:按照不同变温模式降温冷冻， 降温速度依不同种质材料采用特定的速度。
第一节 概 述

我国是植物种质资源丰富的国家，植 物种质设施保存工作近几年也有较大的发 展，我国也已有一些科研单位建立了一批 大、中、小型种质基因库。特别是在农作 物品种资源保存方面已初步形成体系，中 国农科院在1984年和1986年分两期在北京 建立了一座较大型的国家农作物种质库， 包括一座长期库和一座中期库，而于90年 代初又在青海建立了一个“复份库”，至 2000年，已保存了33万份材料。
第三节 超低温保存的方法

2．包埋玻璃化法 是包埋－脱水法和玻璃化法的结合。 保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓 度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入 液氮保存，其材料存活率比用包埋—脱水 法要高，可能是藻酸钙包埋后减轻了玻璃 化溶液的毒性。
第三节 超低温保存的方法

三、其它超低温冻存方法


第一节 概 述

目前常用的超低温保存方法可分为两 类，即冷冻诱导保护性脱水的超低温保存 和玻璃化处理的超低温保存。在超低温条 件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢， 甚至完全停止，因此可以长期保存植物材 料。
第一节 概 述

三、超低温保存的研究概况 1．超低温保存技术的发展 种质材料的超低温保存，传统的技 术有干冻法、预冻法和两步法，上世纪 80年代末和90个代初玻璃化法和包埋脱 水法开始应用于植物材料的超低温保存。
茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐藻酸钙包 埋后，第一阶段先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水， 第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶脱水，然后投人液 氮贮存。
第四节 影响超低温保存效果的主要因素

一、材料的基本特性 材料的基本特性包括植物的基因 型、抗冻性及器官、组织和细胞的年 龄以及生理状态。不同基因型的植物 离体材料对超低温冻存的反应各不相 同。
第一节 概 述

设施保存，也叫设备保存、离体保存，就是利 用种质资源库(冷藏库、超低温库、组织培养室) 等保存设施长期保存种子、配子体、器官、组 织、细胞等种质材料，来达到保存植物种质资 源的目的，它也可以被看作是异地保存中的一 种形式。设施保存可以大批量贮藏种质材料于 一个较小的可以人工控制的空间，并能安全地 保存种质30-50年以上，具有种质不易丢失、便 于交换和利用等特点，是一种行之有效的保存 方式。


理论上讲，细胞外水的冻结温度为－5～－15 ℃，细 胞内游离水的冻结在－25℃。－30 ℃时，细胞几乎 没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在－100℃ 温度下也不冻结。根据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），细胞游离水的冻结温度（－30℃）可被认 为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻 结法是以－30℃为基础的。 控制细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。
第一节 概 述

世 界 自 然保护联盟(IUCN)在1978年出 版的《植物红皮书》一书中指出:在全世 界分布的约25万种维管束植物中，估计 约有2万一2.5万种(占整个区系成分的 10%)处于很稀少或受严重威胁的状况， 这意味着人类赖以生存的植物资源陷人 了生存危机。
第一节 概 述

我国是一个植物资源丰富的国家，约有 高等植物3万多种，占世界第三位，位居北半 球之首，并且特有程度高，生物区系起源古 老，是世界上屈指可数的植物遗传资源起源 中心之一，但其物种流失的态势也不容乐观。 据估计，我国有高等植物2.7万种，受到灭绝 威胁的约有4 000-5000种，占总数的12%一 15%左右。
第一节 概 述

目前，发 达国家的种质资源研究已进 人到常规方法与分子技术相结合的研究阶 段，分子标记技术的利用大大加快了种质 资源鉴定的速度和准确性。美国田间种植 圃保存的10万份无性繁殖生物种质资源， 已有56%进行了同功酶,RAPD,AFLP和SSR 等分子标记的种质学评价，33%的资源圃 建立了核心种质资源。
第三节 超低温保存的方法

1．玻璃化法 是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液 快速脱水后，直接投入液氮，使生物材料连 同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。 此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也 不产生结构和体积的改变，因而不会对材料 造成伤害。保存终止后，复温时要快速化冻， 防止去玻璃化的发生。材料能安全度过冷却 和化冻两个关口，就可保证冻存的成功。